2. 上海海洋大学, 农业部鱼类营养与环境生态研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学, 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心, 上海 201306
2. Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition of Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
豆粕是目前水产饲料行业广泛应用的植物性蛋白质原料，相比于其他植物性蛋白质原料，具有粗蛋白质含量高、氨基酸组成均衡等优点，但豆粕中含有多种抗营养因子，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制剂、棉子糖、水苏糖、大豆凝集素、脲酶和植酸等，会抑制水产动物消化酶活性，引起过敏反应，造成肠道损伤，从而导致豆粕中营养物质消化率的降低[1-3]。微生物固态发酵技术能降解豆粕中的抗营养因子，提高粗蛋白质含量，增加小肽以及游离氨基酸含量[4-6]。在点带石斑鱼(Epinephelus coioides, Hamilton)[7]、大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)[8]的研究表明，水产动物对发酵豆粕的利用率要显著高于豆粕。现阶段我国的发酵豆粕生产工艺主要以固态发酵为主，因发酵菌种和发酵工艺的不同，不同种类发酵豆粕的营养价值存在一定的差异。研究表明，相比于单菌种单级发酵，采用多菌种联合多级发酵技术能够更切底地去除抗营养因子，提高豆粕的营养价值[9-11]。
大口黑鲈(Micropterus salmoides)是我国重要的水产养殖品种，具有生长快、耐低温、抗病力强以及味道鲜美等特点，2018年全国总产量为432 058 t[12]。目前，大口黑鲈的商业饲料中鱼粉含量较高，一般为40%~55%，这也导致了养殖业的高成本问题，故寻找适宜的大口黑鲈植物蛋白质源成为如今研究的热点。但肉食性鱼类对植物性蛋白质原料中营养物质的消化利用率较低[13]，因此通过养殖试验和消化率试验来评定蛋白质原料的营养价值，是蛋白质原料推广应用的重要前提。
本研究在测定发酵豆粕营养成分的基础上，通过养殖试验探究饲料中豆粕和发酵豆粕对大口黑鲈生长、体组成及营养物质消化率、沉积率的影响，通过套算法测定大口黑鲈对豆粕和发酵豆粕中营养物质的消化率，对发酵豆粕的营养价值进行评定，为发酵豆粕在水产饲料中的合理应用提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验1：发酵豆粕部分替代鱼粉对大口黑鲈生长和饲料利用的影响 1.1.1 试验设计及试验饲料本试验所用的豆粕和发酵豆粕由上海某公司提供。发酵豆粕采用粗蛋白质含量为46%的豆粕作为发酵原料，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)室温发酵24 h后，再接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和乳酸菌(Lactobacillus)(1 : 1)厌氧发酵64 h，最后干燥粉碎制得。豆粕和发酵豆粕的常规成分和主要抗营养因子含量见表 1。
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表 1 豆粕和发酵豆粕的常规成分和主要抗营养因子含量 Table 1 Conventional composition and main anti-nutritional factors contents of soybean meal and fermented soybean meal |
以鱼粉含量为35%的大口黑鲈基础饲料作为对照组(CON组)，以豆粕、发酵豆粕分别替代基础饲料中30%的鱼粉(SBM-30和FSBM-30组)，制成3组等蛋白质饲料，同时，饲料中添加0.5 g/kg的三氧化二钇作为指示剂，用于消化率的测定。所有蛋白质原料经粉碎后过60目筛网，按照配方称重后充分混匀，加入15%的水，采用单螺杆挤压机(SLP-45，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所)在85~90 ℃制成粒径3 mm的沉性颗粒饲料，阴凉通风处干燥后，储存于4 ℃备用。试验饲料组成及营养水平见表 2。
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表 2 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
试验所用大口黑鲈购于浙江湖州大明湖水产养殖基地，暂养2周后挑选体格健壮、体表无伤、规格均匀的大口黑鲈180条，平均体重(4.0±0.1) g，随机分配到9个网箱中，每个网箱20尾，每组3个网箱(60尾鱼)。所有网箱设置在室内水泥池中，网箱的尺寸为1.4 m×1.2 m×1.2 m，水深1 m。试验开始后，每天投喂2次(08：00、17：00)，投喂量为体重的3%~4%，并根据摄食情况调整。养殖试验为期8周，期间每周换水1/3，并清理池底粪便，水质条件如下：氨氮含量＜0.1 mg/L，亚硝态氮含量＜0.01 mg/L，溶解氧含量＞5 mg/L，pH 7.0~7.5，水温27~32 ℃。
1.1.3 样品采集养殖试验开始时，选取20尾大口黑鲈保存于-20 ℃冰箱，用于初始样常规成分测定。养殖试验结束前3 d，于投喂前采用虹吸法清除网箱底部粪便等污物，投喂2 h后用小抄网轻轻捞取网箱底部粪便，取包膜完整的粪便颗粒用于粪便常规成分分析。养殖试验结束后，对所有网箱的鱼进行24 h饥饿处理后计数并称量总重，随机选取3尾鱼采用MS-222麻醉后测量体长体重，然后解剖分离内脏，称量内脏和肝脏重。另外随机选取3尾鱼麻醉后于-40 ℃保存用于全鱼常规成分测定。
1.2 试验2：发酵豆粕和豆粕中营养物质消化率的测定 1.2.1 试验设计及试验饲料设计1个鱼粉含量为40%的基础饲料，基础饲料组成见表 3，然后将豆粕和发酵豆粕分别以10%、20%和30%的比例与基础饲料混合，配制成6组试验饲料：SBM-10(90%基础饲料+10%豆粕)、SBM-20(80%基础饲料+20%豆粕)、SBM-30(70%基础饲料+30%豆粕)、FSBM-10(90%基础饲料+10%发酵豆粕)、FSBM-20(80%基础饲料+20%发酵豆粕)、FSBM-30(70%基础饲料+30%发酵豆粕)。各组饲料中均添加0.5 g/kg三氧化二钇作为指示剂用于测定消化率。试验原料处理和饲料制作同试验1。基础饲料、豆粕和发酵豆粕的营养水平和氨基酸组成见表 4。
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表 3 基础饲料组成(风干物质) Table 3 Composition of the basal diet (air-dry basis) |
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表 4 基础饲料、豆粕和发酵豆粕的营养水平和氨基酸组成 Table 4 Nutrient levels and amino acid composition of basal diet, soybean meal and fermented soybean meal |
试验用大口黑鲈购于浙江湖州大明湖水产养殖基地，暂养2周后挑选体格健壮、体表无伤、规格均匀的大口黑鲈315条，平均体重(35.7±1.0) g，随机分到21个循环水玻璃缸中(50 cm×60 cm×50 cm)，每个玻璃缸饲养15尾，每天投喂2次(08：00和16：00)，投喂量控制在体重的3%左右，视摄食情况适当调整，养殖周期为3周。养殖期间每天清理粪便残饵并换水，水质条件如下：水温27~29 ℃，pH 7.0~7.5，溶解氧含量＞6 mg/L，氨氮含量＜0.2 mg/L，亚硝氮含量＜0.1 mg/L。
1.2.3 样品采集养殖2周后开始收集粪便。投喂后采用虹吸管清理鱼缸底部的粪便和残饵，2 h后用小抄网轻轻捞取鱼缸底部粪便，取包膜完整的粪便颗粒，于-20 ℃保存备用。
1.3 指标测定 1.3.1 生长性能与形体指标(试验1)
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式中：Nt为终末尾数；N0为初始尾数；Wt为终末体重(g)；W0为初始体重(g)；Wf为摄入饲料量(g)；Wh为鱼肝脏重(g)；Wv为鱼内脏重(g)；W为鱼体质量(g)；L为鱼体长(cm)。
1.3.2 常规成分和氨基酸组成原料、饲料以及全鱼常规成分组成分析参考AOAC(1995)[15]方法进行。其中，水分含量采用105 ℃恒重干燥法测定，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(2300自动凯氏定氮仪，FOSS，瑞典)测定，粗脂肪含量采用氯仿甲醇提取法测定，粗灰分含量采用550 ℃马弗炉高温灼烧恒重法测定，磷含量采用钼酸比色法(GB/T 6437—2002)测定，粗纤维含量按照国标法(GB/T 5009.10—2003)测定。
原料以及粪便的氨基酸组成采用氨基酸自动分析仪(S-433D，塞卡姆，德国)测定。分别称量50 mg左右原料和100 mg左右粪便(均为干物质基础)，采用6 mol/L盐酸在真空条件下110 ℃水解24 h，取1.0 mL水解液过滤，置于真空干燥箱中干燥后，加少许蒸馏水继续干燥，重复干燥2次后加入5 mL样品稀释液，振荡混匀后采用0.22 μm滤膜过滤后上机分析。
1.3.3 抗营养因子含量测定大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白含量采用酶联免疫吸附测定(ELISA)测定试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)进行测定。称取粉碎后的豆粕和发酵豆粕0.2 g，加入2 mL磷酸缓冲液(pH 7.2~7.4)，用液氮迅速冷冻保存，待样品融化后保持在4 ℃，加入2 mL磷酸缓冲液，50 Hz/s研磨(Tissuelyser-48组织研磨仪，上海净信实业发展有限公司) 60 s，2 500 r/min离心20 min，取上清液进行测定。
棉子糖和水苏糖含量采用高效液相色谱仪(Waters ACQUITY，美国)进行测定。精准称取1 g粉碎的豆粕和发酵豆粕置于50 mL离心管中，用乙醚除去脂肪后，加入40%的乙腈水溶液，混匀后于60 ℃超声波水浴提取60 min，10 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。
1.3.4 营养物质沉积率和消化率饲料和粪便中钇元素的含量采用等离子原子发射光谱法(Vista MPX，Varian Alo Alto，美国)测定。称取0.5 g饲料和0.2 g粪便，炭化后在马弗炉中900 ℃灼烧1 h，于干燥器中冷却至室温，加入2.5 mL蒸馏水、2.5 mL硝酸水溶液(硝酸:蒸馏水=1 : 1)和0.125 mL双氧水(30%)，低温加热溶解完全后冷却至室温，定容到25 mL容量瓶。取5 mL溶液，经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。
饲料中营养物质的表观消化率计算如下：
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式中：ADCd为饲料中某营养物质的表观消化率(%)；DY为饲料中指示剂的含量(%)；F为粪便中某营养物质的含量(%)；FY为粪便中指示剂的含量(%)；D为饲料中某营养物质的含量(%)。
待测原料(豆粕和发酵豆粕)某营养物质的表观消化率计算如下：
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式中：ADCs为待测原料中某营养物质的表观消化率(%)；N为混合饲料中某营养成分的含量(%)；T为混合饲料中某养分的表观消化率(%)；b为混合饲料中基础饲料所占比例；NB为基础饲料中某营养成分的含量(%)；B为基础饲料中某营养成分的表观消化率(%)；r为混合饲料中被测原料所占比例；NF被测原料中某营养成分的含量(%)。
营养物质沉积率计算如下：
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式中：PRR为蛋白质沉积率(%)；PB为鱼体蛋白质增加量(g)；PI总蛋白质摄入量(g)；LRR为脂肪沉积率(%)；LB为鱼体脂肪增加量(g)；LI为总脂肪摄入量(g)。
1.4 数据分析采用SPSS 22.0版统计软件中one-way ANOVA和two-way ANOVA程序进行方差分析，并进行Duncan氏法多重比较，数据采用“平均值±标准差”表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 发酵豆粕对大口黑鲈生长性能的影响由表 5可知，SBM-30组的饲料系数和摄食量显著高于对照组(P < 0.05)，肝体比显著低于对照组(P < 0.05)；FSBM-30组的上述指标与对照组没有显著差异(P>0.05)。各组之间的终末体重、存活率、增重率、肥满度以及脏体比均没有显著差异(P>0.05)。
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表 5 发酵豆粕对大口黑鲈生长性能的影响 Table 5 Effects of fermented soybean meal on growth performance of largemouth bass |
由表 6可知，各组之间的大口黑鲈全鱼的常规成分均没有显著差异(P>0.05)。
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表 6 发酵豆粕对大口黑鲈全鱼常规成分的影响 Table 6 Effects of fermented soybean meal on proximate composition of whole body of largemouth bass |
由表 7可知，SBM-30组的干物质、粗蛋白质表观消化率及蛋白质、脂肪沉积率均显著低于对照组(P < 0.05)；FSBM-30组的干物质表观消化率及蛋白质、脂肪沉积率均显著高于SBM-30组(P < 0.05)，并且与对照组没有显著差异(P>0.05)。各组之间的粗脂肪表观消化率没有显著差异(P>0.05)。
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表 7 发酵豆粕对大口黑鲈营养物质表观消化率和沉积率的影响 Table 7 Effects of fermented soybean meal on nutrient apparent digestibilities and retention rates of largemouth bass |
由表 8可知，随着豆粕混合比例的增加，干物质、粗蛋白质和磷表观消化率逐渐下降，粗脂肪表观消化率逐渐上升；30%混合比例下干物质、粗蛋白质和磷表观消化率显著低于10%混合比例(P < 0.05)，粗脂肪表观消化率显著高于10%和20%混合比例(P < 0.05)。而随着发酵豆粕混合比例的增加，干物质、粗蛋白质和磷表观消化率没有显著差异(P>0.05)。30%混合比例下，发酵豆粕的干物质、粗蛋白质和磷表观消化率显著高于豆粕(P < 0.05)。双因素方差分析结果表明，原料显著影响干物质、粗蛋白质、粗脂肪和磷表观消化率(P < 0.05)，混合比例显著影响粗脂肪和磷表观消化率(P < 0.05)，原料和混合比例的交互效应显著影响粗脂肪表观消化率(P < 0.05)。
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表 8 豆粕和发酵豆粕中营养物质的表观消化率 Table 8 Nutrient apparent digestibilities of soybean meal and fermented soybean meal |
由表 9可知，随着豆粕混合比例的增加，总氨基酸表观消化率逐渐降低，30%混合比例下总氨基酸表观消化率显著低于10%混合比例(P < 0.05)；而随着发酵豆粕混合比例的增加，总氨基酸消化率没有显著差异(P>0.05)。30%混合比例下，发酵豆粕的总氨基酸表观消化率显著高于豆粕(P < 0.05)。双因素方差分析结果表明，原料显著影响组氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、缬氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和总氨基酸表观消化率(P < 0.05)，混合比例显著影响蛋氨酸、丙氨酸和脯氨酸表观消化率(P < 0.05)，原料和混合比例的交互效应显著影响精氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和总氨基酸表观消化率(P < 0.05)。
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表 9 豆粕和发酵豆粕中氨基酸的表观消化率 Table 9 Amino acid apparent digestibilities of soybean meal and fermented soybean meal |
研究表明，随着饲料中植物性蛋白质原料用量的提高，水产动物对饲料中营养物质的消化率下降，生长受到抑制[16-18]，这主要是由于植物性蛋白质原料中含有较高的抗营养因子、氨基酸组成不均衡以及部分微量营养元素的缺乏。豆粕含有的胰蛋白酶抑制剂、大豆抗原蛋白、大豆凝集素、植酸、低聚糖等抗营养因子，会通过抑制消化酶活性、引发肠道抗原反应和胀气等方式影响鱼类对饲料中营养物质的利用率[19-20]。王新霞[21]的研究也发现，在大口黑鲈饲料中添加20%的发酵豆粕替代鱼粉不会对大口黑鲈的生长性能产生显著影响。本试验采用豆粕和发酵豆粕替代大口黑鲈基础饲料中30%的鱼粉后，各组间的增重率没有显著差异，但豆粕组的摄食量和饲料系数显著上升。饲料系数的上升表明饲料利用率的下降，这可能与消化道的损伤和消化率的下降有关。Liang等[22]发现以植物蛋白质全部替代鱼粉会导致花鲈(Lateolabrax japonicus)的摄食抑制，而徐韬等[23]则认为发酵桑叶替代鱼粉并不影响大口黑鲈的摄食率。本试验在养殖过程中发现，豆粕组的大口黑鲈抢食更加活跃，且投喂后排便时间短，排便量大，故豆粕组的高摄食量可能和豆粕引起食糜排空速度加快而产生的强饥饿感有关，具体原因仍有待研究。而发酵豆粕替代饲料中30%的鱼粉并未对大口黑鲈的增重率和饲料利用产生显著影响，说明发酵豆粕的营养价值要高于豆粕，这与彭松等[24]在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)以及Shiu等[7]在点带石斑鱼上的研究结果一致。
豆粕中的抗营养因子会造成鱼类肠绒毛的损伤并降低消化酶活性[17, 25]，而微生物发酵能有效降解抗营养因子，如抗原蛋白和不良寡糖，增加益生菌及其代谢产物含量，从而改善养殖动物的肠道健康[26-27]。本试验中，豆粕替代饲料中30%鱼粉后，显著降低了大口黑鲈的干物质和粗蛋白质表观消化率。这与张鑫等[16]在乌鳢(Channa argus)以及Biswas[28]在真鲷(Pagrus major)上的研究结果类似。也有研究表明，植物蛋白质导致的营养物质消化率下降可能与纤维素含量提高有关，饲料中过高的纤维素会加快食糜在消化道中的排空速度，导致饲料中的营养物质不能被充分吸收[29]。本试验中，发酵豆粕中的粗纤维含量也较高，并没有降低营养物质的表观消化率，说明在现有配方条件下，粗纤维含量并不是降低消化率的主要原因。本试验还发现，豆粕和发酵豆粕替代30%鱼粉并不会对粗脂肪表观消化率产生显著影响，这可能与鱼粉的替代比例较低有关。Yang等[30]在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)上的研究表明，豆粕替代饲料中60%的鱼粉对粗脂肪表观消化率无显著影响，但豆粕替代饲料中80%的鱼粉显著降低了粗脂肪表观消化率。
3.2 大口黑鲈对豆粕和发酵豆粕中营养物质的表观消化率本试验采用套算法(在30%混合比例下)计算出大口黑鲈对豆粕中粗蛋白质表观消化率为76.56%，低于王广军等[31]测得的80.12%。研究表明，豆粕中的大豆球蛋白[20]能引发牙鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼肠道功能障碍，降低其对饲料中营养物质的消化率，而β-伴大豆球蛋白[17]被证实能引起建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)的肠道炎症，并导致肠道消化吸收功能的障碍；而高植物蛋白质饲料中添加赖氨酸和蛋氨酸被证明能提高营养物质的利用率，故抗营养因子的存在以及氨基酸组成不均衡是导致大口黑鲈对豆粕中营养物质消化率较低的主要原因。本试验采用的发酵豆粕由枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和乳酸菌二级发酵而来，β-伴大豆球蛋白、大豆球蛋白、棉子糖和水苏糖含量较豆粕分别下降了91.11%、89.31%、94.10%和99.30%，抗营养因子的去除较单枯草芽孢杆菌[32]或乳酸菌[33]发酵更加彻底。同时，发酵过程中产生了小肽等活性物质。这些都是发酵豆粕中蛋白质消化率提高的原因。Zhuo等[34]在点带石斑鱼上的研究也表明了发酵豆粕的蛋白质表观消化率要高于豆粕。
对于粗脂肪表观消化率，Zhuo等[34]认为微生物发酵原料能够通过提高鱼类消化道脂肪酶的活性来提高对脂肪的消化吸收。本研究中，在30%混合比例下大口黑鲈对豆粕中粗脂肪表观消化率仅为59.35%，显著低于大黄鱼(Larimichthys crocea)[35]的90.0%和花鲈[13]的75.47%，而发酵豆粕中的粗脂肪表观消化率达到60.35%。由于原料中的粗脂肪含量较低，受基础饲料(11.54%)中高粗脂肪含量的影响较大，这可能是导致本试验中粗脂肪的表观消化率组内差异较大的原因。植物中的磷主要以植酸钙、镁盐的形式存在，单胃动物因肠道中缺乏植酸酶，不能利用植酸磷，这导致了水产动物对植物性原料中磷的利用率很低，如斑点叉尾(Ietalurus punetaus)[36]对豆粕中磷的利用率仅为29%，本试验结果(23.24%)与之类似。经微生物发酵后，豆粕中的植酸磷转化成无机磷[37]，从而提高鱼类对磷的利用率，本试验也证实了大口黑鲈对发酵豆粕中的磷表观消化率(46.94%)显著高于豆粕。
本试验结果表明，在30%混合比例下大口黑鲈对发酵豆粕中的总氨基酸表观消化率(92.25%)显著高于豆粕(87.34%)，这与王文娟[38]在斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)和军曹鱼(Rachycentron canadum)上的研究结果相似。通过微生物发酵，豆粕中总氨基酸含量提高，豆粕氨基酸组成更加合理[39]；而抗营养因子的去除也能改善鱼类肠道健康[26]，这是氨基酸消化率提高的主要原因。另外，本研究还发现，大口黑鲈对原料的总氨基酸消化率要高于蛋白质消化率，这可能与套算法本身的计算原理有关，相似的情况在费树站等[40]的研究中也有报道。
套算法是测定动物对原料中营养物质消化率的经典方法，该方法假定基础饲料和测试原料中营养物质的可加性以及各原料消化率的独立性。本试验采用不同比例豆粕和发酵豆粕与基础饲料混合来测定大口黑鲈对营养物质的表观消化率，结果表明，随豆粕混合比例的增加，豆粕中干物质、粗蛋白质和磷表观消化率降低，而发酵豆粕的干物质、粗蛋白质和磷表观消化率变化不显著。这表明原料与基础饲料混合比例会显著影响大口黑鲈对原料中营养物质的表观消化率，且不同原料受影响程度存在较大的差异。肉食性鱼类对抗营养因子的耐受度较低[41]，故饲料中抗营养因子含量过高(豆粕比例升高)引发的饲料消化率下降，将导致计算过程中原料表观消化率的下降，而发酵豆粕中的低抗营养因子含量消除了这种负面效应，故对消化率的影响不大。由此可见，对于抗营养因子含量较高的原料，如以敏感性强的肉食性鱼类为试验对象，按照传统的套算法测定消化率，可能难以得到可靠的数据。
4 结论发酵豆粕可降低抗营养因子含量，提高粗蛋白质、氨基酸和磷表观消化率；在含35%鱼粉的大口黑鲈饲料中，发酵豆粕可替代30%的鱼粉而不会对鱼体增重和饲料利用产生显著影响。
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