葡聚糖是由葡萄糖单糖组成的同型多糖,主要存在于大自然的各种植物、真菌以及细菌的细胞壁中。其中,β-葡聚糖被当作免疫功能调节剂的研究始于20世纪40年代。1941年,Pillemer等[1]发现在酵母细胞中存在一种具有免疫刺激的物质;1955年被证实为β-1, 3/1, 6-葡聚糖[2]。在当代畜禽养殖过程中,需要避免畜禽被病原微生物所感染,理论上的2种方法为使用抗菌药物和接种特定疫苗。在实际应用中,在畜禽饲粮中添加抗生素成为了常用方法,添加抗生素可以获得3项功效:一是控制病原感染,二是增加生长性能,三是提高饲料转化率。但是这种方法却是一把双刃剑,长期在饲粮中添加非特异性抗生素不仅会降低畜禽的免疫功能,还会增加病原微生物的耐药性,最终甚至会危害消费者的健康[3]。随着2020年饲料中抗生素的禁用,寻找新的绿色替代抗生素的添加剂成为亟待解决的问题。近年来的研究表明,β-葡聚糖在抗肿瘤、促进免疫器官生长以及提高机体免疫功能上拥有良好性能[4]。刘影等[5]研究表明,在肉仔鸡的饲粮中添加β-葡聚糖可以提高其脾脏和胸腺2种免疫器官的相对重量。刘杰[6]为断奶后14 d的仔猪饲喂含不同分子质量β-葡聚糖的饲粮,发现β-葡聚糖具有较强的免疫调节功能。何凤琴[7]等将100 mg/kg的β-葡聚糖添加至蛋鸡饲粮中,发现β-葡聚糖能够提高蛋鸡的免疫力,与添加抗生素相比优势明显。但是β-葡聚糖在肉兔上的研究与应用较少。因此,本试验旨在探讨饲粮中添加不同水平β-葡聚糖对肉兔生长性能、免疫器官指数、血清生化和免疫指标的影响,为β-葡聚糖在兔用饲粮中应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试验设计试验中使用的β-葡聚糖为裸藻β-葡聚糖(纯度>95%),购自美国某公司。
试验挑选240只体重相近的35日龄断奶伊拉商品兔,采取单因素完全随机试验设计,随机分为4组,每组60个重复,每个重复1只兔。各组兔的公母比例一致、体况良好。对照组饲喂基础饲粮,试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组分别在基础饲粮中添加0.03%、0.05%、0.07%的β-葡聚糖。预试期5 d,正试期22 d。
1.2 试验饲粮对饲料原料采用《实验动物配合饲料常规营养成分的测定》(GB/T 14924.9—2001)中的分析方法测定常规营养成分后,参考Lebas[8]以及任克良[9]推荐的生长兔饲养标准,使用玉米、棉籽粕、豆粕、葵花皮、麦麸、苜蓿、玉米胚芽粕、菜籽粕等原料配制基础饲粮(营养水平测定方法同饲料原料),并在基础饲粮中分别添加0.03%、0.05%、0.07%的β-葡聚糖制成试验饲粮。饲粮加工成直径4 mm、长10 mm的颗粒料。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
选取通风且有自然采光的兔舍。试验前,按照常规程序对240只试验兔进行免疫,并对兔舍以及兔笼进行全面打扫、清洗、消毒。采取单笼饲养的形式以及渐进换料方式,各组试验兔管理和环境卫生条件相同。换料期共5 d,正试期为22 d。每日08:30和17:30分别饲喂1次,自由饮水。
1.4 检测指标及测定方法 1.4.1 生长性能试验开始后,统计饲喂量,每周同一时间对每只兔子进行空腹称重并记录,计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.4.2 免疫器官指数饲养试验结束时,每个组选择8只(4公4母)接近平均体重的试验兔,通过断颈的方法进行屠宰。屠宰前禁食12 h,不禁水。称量宰前重、各免疫器官重量,并计算免疫器官指数。
试验结束前3 d,每个试验组选8只(4公4母)兔子进行耳静脉采血,采集的血液静置2~3 h,待血液凝固后,4 000 r/min离心8 min,收集血清,装入EP管中于-20 ℃保存,用于测定血清生化和免疫指标。血清生化和免疫指标均采用上海酶联生物科技有限公司的试剂盒进行测定,其标准品线性回归与预期浓度相关系数(R)≥0.99。
1.5 数据处理和统计采用Excel 2007对试验数据进行初步统计,然后使用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析,并采用Duncan氏新复极差法进行多重比较。数据使用平均值±标准差表示,P < 0.05表示差异显著,P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 β-葡聚糖对肉兔生长性能的影响由表 2可知,各组的始重差异不显著(P>0.05)。试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅰ组的末重分别比对照组高3.76%(P < 0.05)、2.47%(P>0.05)和1.71%(P>0.05)。试验Ⅱ组、试验Ⅰ组和试验Ⅲ组的平均日采食量分别比对照组高2.89%(P < 0.05)、1.49%(P>0.05)和1.14%(P>0.05)。试验Ⅱ组的平均日增重最高,试验Ⅱ组、试验Ⅲ组和试验Ⅰ组的平均日增重分别比对照组高5.80%(P < 0.05)、3.20%(P>0.05)和1.72%(P>0.05)。各组间料重比差异不显著(P>0.05),试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的料重比均低于对照组。
由表 3可知,各试验组的胸腺指数均高于对照组,其中试验Ⅱ组的胸腺指数极显著高于对照组(P < 0.01),试验Ⅰ组、试验Ⅲ组的胸腺指数与对照组差异不显著(P>0.05)。各组间脾脏指数差异不显著(P < 0.05)。各试验组的圆小囊指数均高于对照组,其中试验Ⅱ组的圆小囊指数显著高于对照组(P < 0.05),试验Ⅰ组、试验Ⅲ组的圆小囊指数与对照组差异不显著(P>0.05)。
由表 4可知,各组间血清总蛋白(TP)含量差异不显著(P < 0.05),但各试验组的血清TP含量均高于对照组。试验Ⅱ组的血清白蛋白(ALB)含量高于对照组,但差异不显著(P>0.05);试验Ⅲ组的血清ALB含量极显著低于对照组(P < 0.01)。试验Ⅱ组的血清尿素氮(UN)含量最高,但与对照组差异不显著(P>0.05);试验Ⅲ组的血清UN含量最低,极显著低于试验Ⅱ组(P < 0.01),显著低于试验Ⅰ组(P < 0.05),与对照组差异不显著(P>0.05)。各试验组的血清葡萄糖氧化酶(GOD)活性均高于对照组,试验Ⅰ组的血清GOD活性极显著高于对照组(P < 0.01)。各组间血清二胺氧化酶(DAO)和超氧化物歧化酶(SOD)活性差异不显著(P < 0.05)。试验Ⅱ组的血清碱性磷酸酶(ALP)活性最高,极显著高于试验Ⅰ组(P < 0.01)。试验Ⅰ组的血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性与对照组差异不显著(P>0.05),试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的血清ALT和AST活性显著或极显著低于试验Ⅰ组和对照组(P < 0.05或P < 0.01),试验Ⅱ组和试验Ⅲ组之间的血清ALT和AST活性差异不显著(P>0.05)。
由表 5可知,试验Ⅱ组的血清免疫球蛋白A(IgA)含量极显著高于对照组(P < 0.01),显著高于试验Ⅰ组(P < 0.05);试验Ⅲ组的血清IgA含量显著高于对照组和试验Ⅰ组(P < 0.05)。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的血清免疫球蛋白G(IgG)含量极显著高于对照组(P < 0.01)。试验Ⅰ组和试验Ⅱ组的血清免疫球蛋白M(IgM)含量显著低于对照组(P < 0.05)。试验Ⅱ组的血清白细胞介素-6(IL-6)含量极显著低于对照组(P < 0.01);试验Ⅰ组和试验Ⅲ组的血清IL-6含量均高于对照组,但差异不显著(P>0.05)。各组间血清白细胞介素-1(IL-1)含量差异不显著(P>0.05)。
研究表明,葡聚糖能提高畜禽的生长性能[10-12]。葡聚糖能够激活免疫细胞,从而促进释放细胞因子,免疫能力的提高促进了畜禽生长性能的提高[13]。曲昆鹏等[14]研究发现,饲粮中添加一定量的葡聚糖能显著降低1~21日龄肉仔鸡的料重比,提高平均日增重;但是对22~42日龄肉仔鸡的平均日增重、平均日采食量以及料重比无显著影响。何凤琴等[7]研究发现,与添加抗生素的对照组相比,饲粮中添加100 g/t的葡聚糖对蛋鸡的生长性能相无显著影响。Cho等[15]研究发现,饲粮中添加一定量的葡聚糖能提高35日龄内肉仔鸡的平均体重。刘金艳等[16]研究发现,饲粮中添加一定量的葡聚糖能显著降低断奶仔猪的料重比,提高平均日增重。安尚泽等[17]研究发现,饲粮中添加0.1%和0.2%的葡聚糖能够提高仔猪平均日增重,且提出葡聚糖来源的不同导致了适宜添加水平的差异。本试验结果表明,饲粮中添加β-葡聚糖可提高肉兔平均日采食量和平均日增重,且有降低料重比的趋势,以β-葡聚糖添加水平为0.05%时的效果最佳。
3.2 β-葡聚糖对肉兔免疫器官指数的影响胸腺是幼兔的中枢免疫器官和重要淋巴器官,是T细胞发育的场所,其功能与机体免疫密切相关。而脾脏作为机体最大的外周免疫器官,在动物免疫功能中也起着重要作用,它内部含有多种免疫细胞,如B细胞、巨噬细胞和T细胞。圆小囊,又称淋巴球囊,即盲肠与回肠相接处膨大而形成的厚壁圆囊,是兔特有的结构。它是一种淋巴器官,其圆顶上皮有2个作用:一是作为屏障来抵抗烈性抗原对淋巴组织的入侵; 二是作为通道来传递抗原。总之, 它在兔机体免疫中同样起着重要作用[18]。在合理的范围内,免疫器官指数越大代表机体免疫功能越强大。Sheth等[19]的研究表明,随着脾脏重量的下降,机体的免疫功能会随之衰退。张敬等[20]研究了β-葡聚糖对肉仔鸡免疫器官指数的影响,结果表明,饲粮中添加30 mg/kg的β-葡聚糖可以在一定程度上提高肉仔鸡的脾脏指数、法氏囊指数和胸腺指数。汪岩等[21]研究表明,β-葡聚糖可以增强小鼠的非特异性免疫机能,当添加100 mg/kg的β-葡聚糖时可以略微提高脾脏指数,并显著提高胸腺指数。刘金艳等[16]研究发现,饲粮添加400 mg/kg的β-葡聚糖能够显著提高断奶仔猪脾脏指数和胸腺指数。本试验中,饲粮添加β-葡聚糖提高了胸腺指数和圆小囊指数,并有提高脾脏指数的趋势;其中,饲粮添加0.05%的β-葡聚糖能够显著或极显著提高胸腺指数和圆小囊指数。
3.3 β-葡聚糖对肉兔血清生化指标的影响血清TP和ALB含量可反映机体对蛋白质的吸收和代谢状况,同时也可反映机体的免疫状况。血清TP含量升高,提示机体对蛋白质的消化利用能力增加,有利于机体的生长发育[22]。本试验中,3个试验组的血清TP含量相近,均高于对照组,而试验Ⅱ组的血清ALB含量最高,表明饲粮添加0.05%的β-葡聚糖时可以有效提高肉兔对蛋白质的吸收和代谢。
血清UN含量高低反映了肉兔体内的氮代谢情况,若血清UN含量低,则说明肉兔体内蛋白质降解速度慢而合成速度快,即肉兔体内可以存储更多的氮,所以吸收到兔体内的氨基酸等蛋白质分解产物增加[23]。本试验中,饲粮添加β-葡聚糖对肉兔血清UN含量的影响不大。
GOD能够催化葡萄糖产生过氧化氢与葡萄糖酸,在胃中葡萄糖酸能够降低pH,保持各种消化酶的活性,提高饲料的消化率与适口性;在肠道中这种催化反应会消耗氧气,制造厌氧环境,促进厌氧有益菌的生长,有益菌的生态竞争与产物过氧化氢可以抑制大肠杆菌、葡萄球菌和巴氏杆菌等有害菌的生长[6]。此外,GOD也是一种抗氧化酶,具有清除自由基的能力,能够保护小肠黏膜上皮细胞的完整。本试验中,饲粮中添加β-葡聚糖提高了血清GOD活性,但随着β-葡聚糖添加水平的增加,血清GOD活性提高效果在减弱。
DAO是动物小肠黏膜绒毛中具有高度活性的细胞内酶,其活性反映了小肠黏膜细胞的蛋白质与核酸的合成情况,当小肠黏膜受到损伤,DAO便会进入血液之中,此时血清DAO活性便会增加,那么小肠黏膜是否完整或者受到损伤程度便会间接地从血清DAO活性反映,所以它是监测肉兔肠道屏障功能的一个重要指标[24]。本试验中,饲粮添加β-葡聚糖对血清DAO活性无显著影响。
SOD是肉兔体内重要的抗氧化酶,是清除自由基的首要物质。它可以抵抗氧自由基对细胞造成的损伤,并修复受损细胞。SOD目前是表征衰老与死亡的直观指标。本试验结果表明,饲粮添加β-葡聚糖可以略微提高血清SOD活性,增强肉兔的抗氧化能力,其中添加0.05%的葡聚糖的效果最佳。
对于幼龄动物,血清中的ALP主要来自于骨骼,由于其可以将底物去磷酸化,所以它在动物机体免疫中起重要作用,是机体免疫的重要指标之一[25]。同时血清ALP活性高低能够反映肉兔物质合成能力、代谢强弱以及骨骼生长的好坏,即生长速度的快慢以及生长性能的优劣。本试验中,饲粮添加0.05%的β-葡聚糖时,血清ALP活性最高,在一定程度上提高了蛋白质的沉积速度,提高了免疫能力,保持了幼兔机体健康。
在正常情况下,细胞内酶由于细胞膜的屏障作用不易逸出,仅仅会因为细胞的不断更新破坏而少量释放进入血液。当细胞受到损伤,细胞膜的通透性增大而使其释放进入血液的速度升高,产生相应病理变化。这种病理变化会直接或者间接影响动物的健康生长,其中AST、ALT活性可以衡量动物肝脏受损的程度[26]。本研究中,试验Ⅱ组和试验Ⅲ组的血清AST和ALT活性显著或极显著低于对照组和试验Ⅰ组,以试验Ⅱ组最低,表明试验Ⅱ组肉兔的抵抗应激能力高于其他各组。
3.4 β-葡聚糖对肉兔血清免疫指标的影响免疫球蛋白具有各种免疫功能,血清中的免疫球蛋白主要包括IgG、IgA、IgM等,是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物[27-28]。葡聚糖本身作为一种外源物质中的病原体相关分子模式物质,其发挥免疫调控作用主要是促进IL-1、IL-6的表达,提高血清中IgA和IgG含量[29-31]。Shao等[32]研究发现,饲粮中添加一定量的葡聚糖能提高肉鸡血清IgA和IgG含量;Hofer等[33]对免疫功能的机理研究发现,葡聚糖通过与机体内的免疫细胞进行特异性结合,刺激免疫细胞增殖,增强机体免疫力。葡聚糖可以促使机体产生IL-1、IgM等,进而增强体液免疫功能[34]。而IL-6是一种促炎性细胞因子,需要保持在一定范围内升高,能够刺激细胞因子的分泌,增强免疫,但是分泌过多的后果是组织损伤,生长性能减弱[6]。本试验结果表明,断奶肉兔饲粮中添加0.05%的β-葡聚糖后,血清IgA、IgG含量极显著高于对照组;血清IL-1含量高于对照组,但差异不显著;而血清IL-6和IgM含量显著或极显著下降。这是由于IL-6能够促进B细胞分泌免疫球蛋白,则两者一同下降符合事实,此处与前人研究中促进IL-1、IL-6表达可提高血清IgA和IgG含量的结果[29-31]稍有不同,原因可能与动物种类差异或者葡聚糖分子大小差异有关。总体来看,饲粮添加0.05%的β-葡聚糖使肉兔的体液免疫能力得到了提高。
4 结论饲粮添加β-葡聚糖可提高肉兔平均日采食量和平均日增重,增加免疫器官指数,提高机体的免疫力和消化吸收代谢能力。本试验条件下,饲粮中β-葡聚糖适宜添加水平为0.05%。
[1] |
PILLEMER L, ECKER E E. Anticomplementary factor in fresh yeast[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1941, 137(1): 139-142. |
[2] |
PILLEMER L, SCHOENBERG M D, BLUM L, et al. Properdin system and immunity:Ⅱ.Interaction of the properdin system with polysaccharides[J]. Science, 1955, 122(3169): 545-549. DOI:10.1126/science.122.3169.545 |
[3] |
郑娟善, 丁保安. β-1, 3/1, 6-葡聚糖在畜禽日粮中的应用效果[J]. 中国畜牧兽医, 2018, 45(6): 1571-1579. |
[4] |
杨泰, 杨媚, 邓圣庭, 等. β-1, 3/1, 6-葡聚糖的免疫调控机理及其在畜牧生产中的应用[J]. 动物营养学报, 2019, 31(8): 3463-3472. |
[5] |
刘影, 呙于明, 袁建敏, 等. β-1, 3/1, 6-葡聚糖对肉仔鸡生产性能和免疫功能的影响[J]. 中国农业大学学报, 2003, 8(1): 91-94. |
[6] |
刘杰.β-1, 3-葡聚糖对断奶仔猪生产性能、肠道健康及免疫功能的影响[D].硕士学位论文.雅安: 四川农业大学, 2016.
|
[7] |
何凤琴, 胡雪静, 高智华, 等. β-葡聚糖对蛋鸡生产性能、蛋品质及免疫指标的影响[J]. 畜牧与饲料科学, 2011, 32(5): 1-3. |
[8] |
任克良. 家兔配合饲料生产技术[M]. 北京: 金盾出版社, 2002.
|
[9] |
LEBAS F. Nutrient requirements of rabbits[J]. Journal of Applied Rabbit Research, 1998, 3: 14-16. |
[10] |
HISS S, SAUERWEIN H. Influence of dietary β-glucan on growth performance, lymphocyte proliferation, specific immune response and haptoglobin plasma concentrations in pigs[J]. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2003, 87(1/2): 2-11. |
[11] |
LEI X J, YUN H M, YANG Y, et al. Growth performance, nutrient digestibility, and selected fecal microbiota are improved by β-glucan supplementation in weaner pigs[J]. Annals of Animal Science, 2018, 18(3): 769-779. DOI:10.2478/aoas-2018-0024 |
[12] |
WANG Z, GUO Y M, YUAN J M, et al. Effect of dietary β-1, 3/1, 6-glucan supplementation on growth performance, immune response and plasma prostaglandin E2, growth hormone and ghrelin in weanling piglets[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences, 2008, 21(5): 707-714. DOI:10.5713/ajas.2008.70559 |
[13] |
周怿.酵母β-葡聚糖对早期断奶犊牛生长性能及胃肠道发育的影响[D].博士学位论文.北京: 中国农业科学院, 2010.
|
[14] |
曲昆鹏, 张倩, 杨家昶, 等. β-葡聚糖对肉仔鸡生长性能、免疫功能和肠道微环境的影响[J]. 动物营养学报, 2016, 28(7): 2235-2242. |
[15] |
CHO J H, ZHANG Z F, KIM I H. Effects of single or combined dietary supplementation of β-glucan and kefir on growth performance, blood characteristics and meat quality in broilers[J]. British Poultry Science, 2013, 54(2): 216-221. DOI:10.1080/00071668.2013.777691 |
[16] |
刘金艳, 王瑶, 毛俊霞, 等. 日粮添加β-葡聚糖对仔猪生长性能、肠道发育与免疫功能的影响[J]. 中国兽医学报, 2017, 37(11): 2197-2205. |
[17] |
安尚泽, 汪岩, 王雷, 等. β-葡聚糖对仔猪生长性能和肠道黏膜形态的影响[J]. 延边大学农学学报, 2012, 34(1): 79-82, 92. |
[18] |
刘环, 佘锐萍, 宋俊霞, 等. 兔圆小囊免疫功能及其与肠道黏膜局部免疫关系的研究Ⅳ.实验性感染肠球虫兔的圆小囊上皮间淋巴细胞及杯状细胞定量观察[J]. 畜牧兽医学报, 1997, 28(5): 448-452. |
[19] |
SHETH S G, MANI S, TAMHANKAR H, et al. Spleen size in health and disease:a sonographic assessment[J]. Journal of Association of Physicians of India, 1995, 43(3): 182-184. |
[20] |
张敬, 潘振亮, 李鹏, 等. 酵母源β-葡聚糖对肉仔鸡生长性能和免疫功能的影响[J]. 天津农业科学, 2008, 14(6): 5-8. |
[21] |
汪岩, 安尚泽, 姜贺, 等. β-葡聚糖对小鼠非特异性免疫性能的影响[J]. 饲料研究, 2012(6): 32-33, 35. |
[22] |
李华伟, 姬玉娇, 张婷, 等. 发酵中药渣对围产期母猪和哺乳仔猪血浆生化参数和抗氧化指标的影响[J]. 天然产物研究与开发, 2017, 29(9): 1580-1586. |
[23] |
武静龙.复合酶制剂对獭兔生产性能和血清生理生化指标的影响[D].硕士学位论文.长沙: 湖南农业大学, 2006.
|
[24] |
胡泉舟, 侯永清, 王猛. 血中二胺氧化酶活性与仔猪腹泻程度的相关性分析[J]. 猪业科学, 2007, 24(12): 73-74. |
[25] |
李芹, 唐洪玉. 中华倒刺鲃仔稚鱼期消化酶及碱性磷酸酶活性变化的研究[J]. 水生态学杂志, 2010, 3(5): 82-85. |
[26] |
刘乙发. 根据血清谷草转氨酶与谷丙转氨酶比值对重型肝炎进行预后分析[J]. 湘南学院学报(自然科学版), 2004, 6(3): 45-46. |
[27] |
刘玮, 韩海霞, 曹顶国, 等. α-多肽菌素对科宝500肉鸡生产性能、免疫指标、血清生化指标和抗氧化性能的影响[J]. 中国家禽, 2018, 40(4): 29-35. |
[28] |
李燕舞, 姜八一, 刘建胜, 等. 杜仲叶提取物对肉兔生长性能及血清生化、免疫与抗氧化指标的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 31(2): 824-830. |
[29] |
GROSS O, POECK H, BSCHEIDER M, et al. Syk kinase signalling couples to the Nlrp3 inflammasome for anti-fungal host defence[J]. Nature, 2009, 459(7245): 433-436. DOI:10.1038/nature07965 |
[30] |
GRINGHUIS S I, KAPTEIN T M, WEVERS B A, et al. Dectin-1 is an extracellular pathogen sensor for the induction and processing of IL-1β via a noncanonical caspase-8 inflammasome[J]. Nature Immunology, 2012, 13(3): 246-254. DOI:10.1038/ni.2222 |
[31] |
SANCHO D, REIS E SOUSA C. Signaling by myeloid C-type lectin receptors in immunity and homeostasis[J]. Annual Review of Immunology, 2012, 30: 491-529. DOI:10.1146/annurev-immunol-031210-101352 |
[32] |
SHAO Y J, WANG Z, TIAN X Y, et al. Yeast β-D-glucans induced antimicrobial peptide expressions against Salmonella infection in broiler chickens[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2016, 85: 573-584. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2016.01.031 |
[33] |
HOFER M, POSPÍŠIL M. Glucan as stimulator of hematopoiesis in normal and gamma-irradiated mice.a survey of the authors' results[J]. International Journal of Immunopharmacology, 1997, 19(9/10): 607-609. |
[34] |
史酉川, 郑云朵, 李昂, 等. 啤酒酵母对生长獭兔免疫性能及抗氧化能力的影响[J]. 中国饲料, 2017(19): 17-20. |