随着全球气候变暖，养殖环境日趋恶化，在我国，尤其是南部地区的炎热季节高温多雨，饲料原料及配合饲料普遍受到霉菌毒素污染[1]。研究证实，低剂量[含量符合我国《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)]的某种或多种霉菌毒素能够诱导家禽免疫抑制、氧化应激及肠道损伤，破坏肝脏和肾脏功能，降低生产性能[2-3]；此外，蛋鸡饲粮中禁止添加抗生素，肠道有害菌过度繁殖会造成肠道菌群失衡，破坏肠屏障功能，进而容易导致细菌及内毒素易位，可触发全身炎症反应和多器官功能衰竭，最终降低蛋鸡生产性能，严重者甚至导致死亡。因此，探寻安全有效的饲料添加剂来减少霉菌毒素和有害菌等对蛋鸡的危害，维持机体健康，是实现蛋鸡高效养殖的重要任务。
霉菌毒素吸附剂(mycotoxin adsorbents，MA)主要包括硅铝酸盐类、复合矿物质类和酵母细胞壁类等。硅铝酸盐是指含有氧化铝和二氧化硅的一类黏土矿物，如蒙脱石、坡缕石等，硅铝酸盐因其比表面积大、表面微孔多、容积大，且有阳离子交换性而具备较强的吸附能力[4]。研究表明，饲粮添加MA能够有效逆转霉变饲料导致的畜禽氧化损伤和免疫抑制，改善机体健康状况，提高生产性能[5-6]。有机酸(organic acid，OA)如苯甲酸、短链脂肪酸和植物精油(essential oil，EO)如肉桂醛、香芹酚具有良好的抗氧化、抑菌和抗炎作用[7-8]，可以改善动物肠道健康，促进养分消化吸收，提高生产性能，是当前畜牧生产中常用的饲用抗生素替代品[9-10]。然而，越来越多的学者认识到，单一饲料添加剂很难完全替代饲用抗生素及有效控制饲粮霉菌毒素的危害[11-13]，动物生产中联合应用2种及以上饲料添加剂必将是未来养殖业的趋势。饲粮受霉菌毒素污染和有害菌引发的肠道疾病是当前蛋鸡养殖中普遍存在的问题，基于MA、OA、EO的作用，推测联合应用MA和OA或MA和EO也许能有效降低有害菌和霉菌毒素等对蛋鸡的危害，提高机体健康水平，进而改善生产性能，有助于实现蛋鸡健康高效养殖。因此，本试验旨在探讨饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡生产性能、蛋品质及血浆激素、抗氧化和免疫指标的影响，为其在蛋鸡生产中的合理应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料MA-OA复合物和MA-EO复合物均为市售产品。MA-OA复合物主要成分含量为：MA(蒙脱石)80%，OA(主要为甲酸、丙酸和丁酸)含量>10%。MA-EO复合物主要成分为：MA(蒙脱石)75%，EO(主要为丁香酚和肉桂醛)含量>4%。
1.2 试验设计与饲养管理选择270只29周龄的健康罗曼粉壳蛋鸡，随机分为3组，每组6个重复，每个重复15只。对照组(Ⅰ组)饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮中添加0.65 g/kg MA-OA复合物(Ⅱ组)和0.70 g/kg MA-EO复合物(Ⅲ组)的试验饲粮。预试期7 d，正试期70 d。预试期所有鸡只饲喂基础饲粮，每日统计产蛋率，并适当调整鸡只，使各组蛋鸡产蛋率差异不显著(P＞0.05)。基础饲粮参照《鸡饲养标准》(NY/T 33—2004)设计，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
所有蛋鸡采用3层笼养的方式进行饲养，每笼3只，每5笼为1个重复。每日喂料2次(08:00和15:00)，每日捡蛋2次。各组蛋鸡饲养管理条件相同，正试期鸡舍内平均温度为(25.55±2.78) ℃，相对湿度为(77.23±6.25)%。蛋鸡自由饮水，每日光照时间为16 h。
1.3 样品采集与分析 1.3.1 饲粮霉菌毒素含量按照《饲料采样》(GB/T 14699.1—2005)方法采集试验第1天、第18天、第35天、第53天、第70天的饲粮样品，送至湖南农业大学检测饲粮常见霉菌毒素的含量。由表 2可知，本试验所用蛋鸡基础饲粮常见霉菌毒素的含量均在我国《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)的限定范围内，说明本试验蛋鸡饲粮的霉菌毒素含量在安全范围以内。
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表 2 基础饲粮中霉菌毒素含量实测值 Table 2 Measured values of mycotoxins content in the basal diet |
正试期内，每日记录各组(以重复为单位)产蛋数、蛋重、软破壳蛋数及死淘鸡数，每周统计1次采食量。计算试验第1~5周、第6~10周、第1~10周的平均日采食量、产蛋率、平均蛋重、料蛋比、日产蛋重和死淘率。
1.3.3 蛋品质试验第35天、第70天，分别从每个重复随机选取5枚鸡蛋(每组30枚)，于12 h内进行常规蛋品质测定。使用电子数显卡尺(SH14100025，上海申韩量具有限公司)测量鸡蛋的长径、短径、蛋黄高度和蛋黄直径，计算蛋形指数(长径/短径)和蛋黄指数(蛋黄高度/蛋黄直径)。用蛋壳强度测定仪(EFR-01，Orka公司，以色列)测定鸡蛋的蛋壳强度。用蛋品质分析仪(EA-01，Orka公司，以色列)测定蛋重、蛋黄颜色和哈氏单位。用蛋壳厚度测定仪(NFN380，FHK公司，日本)测定鸡蛋钝端、尖端和中间部分的厚度，计算平均蛋壳厚度。
1.3.4 血浆激素、抗氧化和免疫指标试验第70天，以重复为单位随机选取2只蛋鸡，采血前禁食12 h，自由饮水。通过翅下静脉采集5 mL左右血液于肝素抗凝管中，于3 000 r/min离心10 min制备血浆，-20 ℃保存。采用酶标仪(Multiskan GO，赛默飞世尔科技公司，美国)和南京建成生物工程研究所的试剂盒测定血浆中过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量及总抗氧化能力(T-AOC)。使用北京华英生物技术研究所生产的试剂盒测定血浆免疫球蛋白(Ig)G、IgM、白细胞介素(IL)-2、IL-4、干扰素-γ(INF-γ)、雌二醇(E2)、孕酮、促卵泡激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、皮质醇(CORT)和促肾上腺皮质激素(ACTH)含量。
1.3.5 肝脏抗氧化指标试验第70天，以重复为单位随机选取1只蛋鸡，颈静脉放血后剖开腹腔，用剪刀剪取适量肝脏样品于离心管中，-20 ℃保存。测定前，先将肝脏样品用预冷的生理盐水按1 : 9(质量:体积=g : mL)在冰浴条件下用手持匀浆机(T10BS25，IKA公司，德国)制备成10%的组织匀浆，将匀浆液于4 ℃离心10 min，小心吸取上清液。使用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定上清液中CAT、T-SOD活性和MDA含量及T-AOC。
1.4 数据统计与分析应用SAS 9.2软件进行单因素方差分析，差异显著者用Duncan氏法进行多重比较。试验结果采用平均值±标准差表示，P < 0.05表示差异显著，0.05≤P < 0.10表示有变化趋势。产蛋率和死淘率数据在统计前进行反正弦转换。
2 结果 2.1 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡生产性能的影响由表 3可知，饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡生产性能均无显著影响(P>0.05)。第6~10周，与Ⅰ组相比，Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡产蛋率有提高趋势(P=0.094)，分别了提高了2.79%、2.35%。
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表 3 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of dietary MA-OA complex and MA-EO complex on performance of laying hens |
由表 4可知，第35天，与Ⅰ组相比，Ⅲ组哈氏单位显著提高(P < 0.05)，蛋黄指数有提高趋势(P=0.084)；第70天，Ⅲ组蛋重显著高于Ⅰ组、Ⅱ组(P < 0.05)，分别提高了4.05%、3.57%；第35天、第70天，Ⅱ组、Ⅲ组蛋黄颜色均显著低于Ⅰ组(P < 0.05)。
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表 4 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡蛋品质的影响 Table 4 Effects of dietary MA-OA complex and MA-EO complex on egg quality of laying hens |
由表 5可知，各组间蛋鸡血浆FSH、LH和孕酮含量均无显著差异(P>0.05)。与Ⅰ组、Ⅲ组相比，Ⅱ组血浆E2含量显著提高(P < 0.05)；与Ⅰ组相比，Ⅲ组血浆CORT、ACTH含量显著降低(P < 0.05)。
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表 5 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡血浆激素指标的影响 Table 5 Effects of dietary MA-OA complex and MA-EO complex on plasma hormone indices of laying hens |
由表 6可知，各组间蛋鸡血浆T-AOC及CAT、T-SOD活性均无显著差异(P>0.05)；Ⅲ组血浆MDA含量显著低于Ⅱ组(P < 0.05)。各组间蛋鸡肝脏CAT活性和MDA含量均无显著差异(P>0.05)；Ⅱ组、Ⅲ组肝脏T-SOD活性显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅲ组肝脏T-AOC显著高于Ⅰ组、Ⅱ组(P < 0.05)。
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表 6 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡血浆、肝脏抗氧化指标的影响 Table 6 Effects of dietary MA-OA complex and MA-EO complex on plasma and liver antioxidant indices of laying hens |
由表 7可知，各组间蛋鸡血浆IgG和IgM含量均无显著差异(P>0.05)。Ⅱ组、Ⅲ组血浆IL-2和INF-γ含量显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅲ组血浆IL-4含量显著高于Ⅰ组、Ⅱ组(P < 0.05)。
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表 7 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡血浆免疫指标的影响 Table 7 Effects of dietary MA-OA complex and MA-EO complex on plasma immune indices of laying hens |
本试验发现，试验所在鸡场同批产蛋高峰期蛋鸡的产蛋率低于94.5%，这可能与以下因素有关：蛋鸡饲养试验正值我国南部地区的7—9月份，环境温度高、相对湿度大，蛋鸡长期处于这种环境中机体新陈代谢和健康水平会受到负面影响；此外，本试验蛋鸡的饲粮被多种霉菌毒素污染，虽然所检测的6种常见霉菌毒素的含量均在我国《饲料卫生标准》(GB 13078—2017)范围内，但霉菌毒素间存在互作效应，几种低浓度霉菌毒素协同作用后的毒性加强，同时毒素在体内逐渐蓄积，对动物机体会造成潜在危害[14]。试验结束时，Ⅰ组蛋鸡产蛋率低于94.0%，而Ⅱ组、Ⅲ组蛋鸡产蛋率均在95.5%以上，且试验全期日产蛋重和平均蛋重较Ⅰ组均有一定提高；另外，Ⅲ组第70天的蛋重(每组随机选取30枚鸡蛋的平均蛋重)显著高于Ⅰ组，以上结果说明饲粮添加MA-OA复合物、MA-EO复合物均在一定程度上改善了夏季产蛋高峰期蛋鸡的生产性能，有利于延长产蛋高峰期，这可能与它们能够抑制肠道病原菌、维护肠道功能及改善机体抗氧化和免疫性能有关[5, 7-9]。目前，已有较多学者开展了以上3种饲料添加剂单独应用于蛋鸡生产中的研究，尽管试验结果存在差异，但总体上表明它们能在不同程度上提高蛋鸡的生产性能[7, 13, 15]，本试验结果与前人的报道基本相符。
3.2 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡蛋品质的影响蛋壳厚度和蛋壳强度是评价蛋壳质量的主要指标，本试验发现，饲粮添加MA-OA复合物、MA-EO复合物对蛋壳厚度和蛋壳强度均无显著影响。课题组前期研究发现，饲粮添加0.5 g/kg MA(主要为蒙脱石)不影响以上蛋壳质量指标[13, 16]；而当添加水平为0.6~1.2 g/kg时，鸡蛋蛋壳厚度和蛋壳强度呈线性提高或有线性提高的趋势[17]，提示黏土类吸附剂对蛋壳质量的影响与其添加量有关。蛋黄指数和哈氏单位可用来衡量蛋黄品质和蛋的新鲜度，二者值越高，蛋就越新鲜。Chen等[13]和Qu等[17]报道，饲粮添加蒙脱石显著提高了鸡蛋蛋黄指数；Akbari等[18]研究指出，薄荷精油和百里香精油能够显著提高鸡蛋哈氏单位。本试验结果显示，饲粮添加MA-EO复合物显著提高了第35天鸡蛋哈氏单位，且蛋黄指数也有提高趋势，提示其可能提高了蛋黄品质，有利于保持鸡蛋新鲜度，与以上学者的研究结果基本一致，我们推测可能是由于MA-EO复合物改善了鸡蛋抗氧化水平。另外，本试验发现，MA-OA复合物、MA-EO复合物均显著降低了蛋黄颜色，由于2种复合物中含有蒙脱石，蒙脱石对饲料中某些色素(例如叶黄素和胡萝卜素)具有一定吸附作用，进而不利于蛋黄色素沉积，Qu等[17]研究也表明，饲粮添加蒙脱石会显著降低鸡蛋蛋黄颜色。
3.3 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡血浆激素指标的影响蛋鸡的产蛋活动与血液激素含量有一定关联。本试验结果表明，饲粮添加MA-OA复合物显著提高了蛋鸡血浆E2含量，且在一定程度上提高了血浆FSH、LH和孕酮含量，提示其可能有利于体内生殖激素分泌。E2可加速卵细胞的发育、成熟，并调节LH释放，蛋鸡血液中E2含量与产蛋率呈正相关[19]。本研究中，Ⅱ组蛋鸡产蛋率最高，第6~10周、第1~10周产蛋率较Ⅰ组分别提高了2.79%、1.57%，综上所述，Ⅱ组蛋鸡血浆生殖激素含量和产蛋率的结果基本可以相互佐证。此外，本研究发现，MA-EO复合物降低了血浆ACTH和CORT含量。这2种激素在家禽机体发生应激时分泌变化最明显，被称为“应激激素”，通常大量产生于热应激、病原菌感染等情况下[19]。我国南部地区夏季环境温度高、湿度大，蛋鸡长期处于此环境中会引起机体不同程度的应激；另外，MA-EO复合物能够较好地控制肠道中霉菌毒素、有害菌及其毒素等，减少它们对机体造成的危害，由此可见，饲粮添加MA-EO复合物可能利于减少机体应激，饲粮长期添加MA-EO复合物有利于改善蛋鸡生产性能。
3.4 饲粮添加MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡抗氧化及免疫功能的影响家禽血液、组织中抗氧化酶活性和脂质过氧化产物如MDA含量能够反映机体的氧化和抗氧化状况。本试验结果显示，饲粮添加MA-EO复合物、MA-OA复合物提高了蛋鸡肝脏T-AOC和T-SOD活性，提示它们有利于改善机体抗氧化水平，其可能作用机制如下：一方面，MA-OA复合物或MA-EO复合物能较好地控制肠道中霉菌毒素、有害菌及其毒素等，减少病原体对机体抗氧化系统造成的损伤，可能利于抗氧化酶的正常表达和维持较高的活性；另一方面，2种复合物中含有蒙脱石，其晶层间含有镁、铜、锌等金属离子，它们可能在肠道中被置换出来而被机体吸收利用，这些金属离子是部分抗氧化酶的组成成分或活性中心，进而有利于维持抗氧化酶的活性。许多研究表明，饲粮单独添加蒙脱石、OA或EO能够在一定程度上改善家禽的抗氧化性能[10-11, 15-16]，本试验的结果进一步证实了此结论。
Ig是家禽直接参与体液免疫的主要效应分子，本试验结果显示，饲粮添加MA-EO或MA-OA复合物不影响蛋鸡血浆IgG、IgM含量，提示它们可能不影响机体体液免疫功能，与前人的研究结果[17, 20]基本一致。动物体内细胞因子水平与机体免疫性能有着密切关系，本试验发现，饲粮添加MA-EO复合物或MA-OA复合物均显著提高了蛋鸡血浆IL-2和INF-γ含量，且饲粮添加MA-EO复合物还显著提高了血浆IL-4含量。课题组前期研究也发现，蒙脱石能够显著提高蛋鸡血浆IL-2含量，有提高血浆INF-γ含量的趋势[13]。IL-2和IL-4在T细胞介导的细胞免疫应答中发挥重要作用[21]；INF-γ主要来源于活化的T细胞和自然杀伤(NK)细胞，具有广泛地免疫调节作用[22]。以上试验结果提示，饲粮添加MA-EO复合物、MA-OA复合物可能对蛋鸡细胞免疫功能有一定促进作用，但其相关作用机制还需深入研究。肝脏作为最大的网状内皮细胞吞噬系统，是机体免疫系统的重要组成部分。上文中提到，MA-EO复合物、MA-OA复合物均能提高肝脏中部分抗氧化酶的活性，有利于维持肝脏健康及肝功能的正常发挥，因此MA-EO复合物、MA-OA复合物也可能通过保护肝脏功能而间接改善机体免疫性能。
3.5 MA-OA复合物和MA-EO复合物对蛋鸡生产性能、蛋品质及机体健康水平影响的比较本试验结果显示，在生产性能方面，2种复合物的添加效果无显著差异；从蛋重、蛋黄颜色和哈氏单位等指标可以得出，MA-EO复合物对改善蛋品质的效果优于MA-OA复合物；血浆激素指标方面，MA-OA复合物可能更有利于促进生殖激素分泌，而MA-EO复合物可能对减少机体应激更有效；另外，MA-EO复合物对提升蛋鸡抗氧化及免疫性能的作用优于MA-OA复合物。综上所述，饲粮添加MA-EO复合物对改善蛋鸡生产性能及机体健康水平的效果相对更好。据报道，EO能够降解细菌细胞壁，破坏致病菌细胞质膜，导致其质子泵功能失调，可以直接抑制杀灭细菌[6]；此外，EO还能干扰细菌群体感应系统，抑制致病菌产生毒力因子[23]，据此推测，与OA相比，EO可能更有效、快速地控制肠道致病菌，抑制其毒力。课题组前期研究表明，试验所用的MA还能显著降低蛋鸡肠道致病菌如大肠杆菌数量[24]，有效“绑定”内毒素[25]，作者推测EO与MA联合可以发挥出更强的抑菌和“抗细菌毒力”作用，提升肠道健康水平。
4 结论饲粮添加0.65 g/kg MA-OA复合物、0.70 g/kg MA-EO复合物有提高第6~10周蛋鸡产蛋率的趋势，能够提升机体抗氧化能力及免疫性能；饲粮添加0.70 g/kg MA-EO复合物可减少机体应激，改善蛋品质。
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