2. 北京市饲料监察所, 北京 100061;
3. 中国农业科学院饲料研究所, 农业农村部动物产品质量安全饲料源性因子风险评估实验室, 北京 100081
2. Beijing Institute of Feed Control, Beijing 100061, China;
3. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Animal Products of China Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Feed Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
胆汁酸(bile acids，BAs)是胆汁的主要成分，是胆固醇在肝脏中经一系列的酶促反应、新陈代谢过程后合成的具有两性分子结构的化合物[1]。胆汁酸的亲脂性质对营养物质的消化吸收代谢，尤其是糖脂代谢有着重要意义。此外，近年来的相关研究表明，在机体的生命活动中，胆汁酸可以激活对机体生命活动有重要作用的法尼醇X受体(FXR)、G蛋白偶联BA受体1(GPBAR1)和维生素D受体(VDR)，从而在糖脂类代谢、能量代谢、免疫调节和稳态调节方面发挥着重要作用[2-9]。
作为调节机体糖脂代谢的重要物质，在鱼类尤其是肉食性鱼类养殖业中，胆汁酸常被用作保肝护肝产品。有研究报道发现，胆汁酸可显著降低乌鳢血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量，从而改善糖脂代谢[10]；0.15 g/kg的胆汁酸可以促进罗非鱼对脂质的消化吸收，从而调节脂代谢[11]；在针对草鱼的研究中也发现，适量的胆汁酸能提高草鱼生长性能，促进其脂肪代谢，降低机体脂肪沉积，改善其肌肉品质[12]。作者所在研究团队的研究结果也发现，肉食性鱼类大口黑鲈饲喂商业化配合饲料(淀粉含量12%)后，大口黑鲈肝脏会出现胆汁淤积症状，而在饲料中添加胆汁酸(1.5 g/kg)后，大口黑鲈肝脏状态得到显著改善[13]。目前哺乳动物(人、鼠和猪)胆汁酸的研究已经较为深入，但只有少部分文献报道鱼类胆汁酸组成及相关研究。张晶等[14]对草鱼胆汁酸进行分析，发现草鱼胆汁酸以胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)为主，还含有少量脱氧胆酸(DCA)，并且草鱼的肥满度与CA、CDCA的含量呈负相关。在其他水产动物的研究报道中发现了石胆酸(LCA)、DCA的存在[15]。由于缺乏对鱼类胆汁酸谱的系统研究，目前市面上鱼用的胆汁酸产品一般由猪胆汁制成，由于不同物种间胆汁酸存在很大差异，所以这些胆汁酸产品的效果不一。因此，对养殖鱼类进行全面系统的胆汁酸轮廓分析，明确鱼类胆汁酸的种类、含量是十分有必要的。
目前胆汁酸轮廓分析主要的方法包括酶联免疫吸附(ELISA)法、薄层色谱(TLC)法、高效液相色谱(HPLC)法、气质联用(GC-MS)法以及液质联用(LC-MS/MS)法，Dutta等[16]详细阐述了不同检测方法的优劣，其中LC-MS/MS法能够满足复杂样品中多种胆汁酸的同时定性定量分析，已成为研究胆汁酸谱的普遍公认的最可靠方法。
大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)肉质鲜美、营养价值高，是典型的肉食性鱼类，也是我国重要的海水养殖品种之一。但在养殖中其深受营养性脂肪肝病的困扰。因此研究人员尝试使用胆汁酸对大菱鲆进行糖脂代谢调节，达到保肝护肝的目的。在先前的研究报道中发现，添加胆汁酸后，大菱鲆幼鱼血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶活性显著提高，总蛋白及白蛋白的含量显著升高，而血浆中甘油三酯、总胆固醇及高、低密度脂蛋白胆固醇含量显著下降，均表明胆汁酸可以起到保护大菱鲆肝脏健康、降低营养性肝病发生率的作用[17]。基于此，本文以大菱鲆为研究对象，利用LC-MS/MS法建立胆汁和血浆中胆汁酸的分析方法，对大菱鲆体内胆汁酸谱进行轮廓分析研究，明确胆汁酸的种类和含量，为利用胆汁酸进行糖脂代谢特定调节提供基础。本研究结果也将为丰富鱼类胆汁酸谱库提供数据，为分析肉食性鱼类糖脂代谢及营养性肝病的发生发展及利用特定胆汁酸进行精准防治、保肝护肝提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试剂与耗材30种非结合型和结合型胆汁酸标准品：CA、α-鼠胆酸(αMCA)、β-鼠胆酸(βMCA)、ω-鼠胆酸(ωMCA)、猪胆酸(HCA)、Murco CA、CDCA、DCA、熊去氧胆酸(UDCA)、猪去氧胆酸(HDCA)、7, 12-二酮石胆酸(7, 12KLCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸(GCA)、甘氨鹅胆酸(GHCA)、甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸(GDCA)、甘氨熊去氧胆酸(GUDCA)、葡糖石胆酸(GLCA)、甘氨脱氢胆酸(GDHCA)、牛磺胆酸(TCA)、牛磺α-鼠胆酸(TαMCA)、牛磺β-鼠胆酸(TβMCA)、牛磺ω-鼠胆酸(TωMCA)、牛磺猪胆酸(THCA)、牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)、牛磺脱氧胆酸(TDCA)、牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)、牛磺猪去氧胆酸(THDCA)、牛磺石胆酸(TLCA)和牛磺脱氢胆酸(TDHCA)均购买于美国IsoSciences公司；氘代胆汁酸对照品胆酸-d4(CA-d4)、鹅脱氧胆酸-d4(CDCA-d4)、石胆酸-d4(LCA-d4)和甘氨胆酸(GCA-d4)均购于美国Steraloids公司；牛磺胆酸钠盐-d5(TCA-d5)、牛磺-β-鼠胆酸钠盐-d5(TβMCA-d5)和牛磺熊脱氧胆酸-d5(TUDCA-d5)均购自加拿大Toronto Research Chemicals公司；β-鼠胆酸-d5(βMCA-d5)购买于美国IsoSciences公司；脱氧胆酸-d4(DCA-d4)、甘氨石胆酸-d4(GLCA-d4)、甘氨熊脱氧胆酸-d4(GUDCA-d4)、牛磺脱氧胆酸钠盐-d4(TDCA-d4)、甘氨鹅脱氧胆酸-d4(GCDCA-d4)、甘氨脱氧胆酸-d4(GDCA-d4)和熊脱氧胆酸-d4(UDCA-d4)均购于美国剑桥同位素实验室公司；SPE柱购于美国Grace Davison Discovery Sciences公司(GracePureTM C18-Aq 500 mg/3 mL)；甲醇、乙腈等有机试剂均为UPLC级，购于美国Merck公司。
1.1.2 仪器安捷伦超高效液相色谱仪(1290 Infinity Ⅱ)、安捷伦串联四极杆质谱联用仪(6470A QQQ)、Eppendorf高速冷冻离心机(5430R)。
1.2 样品采集和处理试验用6条大菱鲆购自青岛市亿海丰水产有限公司，初始体重为(7.41±0.02) g。鱼苗首先使用商业化配合饲料饲养2周，饲料组成及营养水平见表 1。之后采用表 1所示的饲料饲养70 d(表观饱食投喂)，养殖系统为室内流水养殖系统，水源为地下海水。大菱鲆首先饥饿48 h，之后复食，复食24 h后进行取样。取样时6条大菱鲆的平均体重为(27.14±0.26) g。大菱鲆鱼体经消毒后静脉取血，无菌剥离胆囊组织，样品于-80 ℃冷冻保存。
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表 1 饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
所有胆汁酸标准品和相关同位素标准品均配制成浓度为1 mg/mL的单标准品储备液。取所有胆汁酸标准品储备液，混合，使用50%甲醇水溶液(V甲醇/V水=50 : 50)稀释得到浓度为10 μg/mL的混合标准品工作液。在此基础上，对混合工作液(10 μg/mL)进行梯度稀释，得到浓度为0.002~10.000 μg/mL的混合标准品溶液。将以上梯度稀释的胆汁酸标准溶液与同位素内标溶液等体积混合，得到最终浓度在0.001~5.000 μg/mL的定量校正标准曲线。
1.4 胆汁酸的测定 1.4.1 样品前处理胆汁和血浆样品的处理参考Gu等[18]方法进行。
胆汁样品：胆囊组织经冰水浴解冻后，取5 μL混匀的胆汁样本，加入1 995 μL 80%甲醇水溶液(V甲醇/V水=80 : 20)，涡旋振荡1 min，-20 ℃静置30 min后离心15 min(转速16 000 r/min，4 ℃)。取40 μL上清液，加20 μL 50%甲醇水溶液(V甲醇/V水=50 : 50，含250 ng/mL混合胆汁酸同位素内标)，加40 μL 20%甲醇水溶液(V甲醇/V水=20 : 80)，涡旋混匀，待后续UPLC-MS/MS分析。
血浆样品：冰水浴解冻，涡旋混匀后经固相萃取柱处理。固相萃取过程：取C18-Aq SPE柱，经2 μL甲醇活化和2 μL 2%乙腈水溶液(V乙腈/V水=2 : 98)平衡；取100 μL解冻血清样本，加1 μL混合胆汁酸同位素内标(1 ng/mL)混合，缓慢上样到SPE小柱；加2 μL去离子水清洗SPE小柱，2 μL甲醇洗脱目标物，收集洗脱液；氮气干燥洗脱液，干燥样本复溶于20 μL 50%甲醇水溶液(V乙腈/V水=50 : 50)；离心15 min(转速16 000 r/min，4 ℃)，上清液用UPLC-MS/MS分析。
1.4.2 仪器条件 1.4.2.1 色谱条件色谱柱为Waters公司UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)。采用线性梯度洗脱模式进行色谱分离，流速为0.45 mL/min。柱温为40 ℃。流动相组成为：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸乙腈。液相色谱洗脱条件如表 2所示。
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表 2 液相色谱洗脱条件 Table 2 Liquid chromatography elution conditions |
采用电喷雾离子源(ESI)负离子模式对经色谱分离的胆汁酸进行离子化。
质谱参数：干燥气温度为300 ℃；干燥气流速为5 L/min；雾化器压力为45 psi；鞘气温度为300 ℃；鞘气流速为11 L/min，毛细管电压为4 000 V。
采用动态多反应监测(dMRM)模式进行定性定量检测，每个扫描周期时间设定为300 ms。
1.5 数据分析MassHunter软件(版本B.08.00)用于控制仪器和采集数据。使用SPSS 20软件对相关数据进行描述性统计学分析，以平均值±标准差的形式进行结果显示。
2 结果 2.1 检测方法的验证根据1.4中的仪器条件建立的胆汁酸检测方法进行分析时，标准品和相应胆汁、血浆样品的提取离子流图如图 1所示，各胆汁酸出峰时间不干扰，没有杂质峰干扰目标物质，分析时间短，在12.5 min内就可以完成30种胆汁酸的分离分析。相关方法学参数及指标如表 3所示，各待测胆汁酸在0.002 5~5.000 0 μg/mL内线性良好(R2>0.99)，满足胆汁和血浆样本中胆汁酸的准确定量测定。
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Counts vs. acquisition:计数与采集时间; ωMCA：ω-鼠胆酸omega-muricholic acid；CA：胆酸cholic acid；βMCA：β-鼠胆酸beta-muricholic acid；αMCA：α-鼠胆酸alpha-muricholic acid；HCA：猪胆酸hyocholic acid；CDCA：鹅去氧胆酸chenodeoxycholic acid；DCA：脱氧胆酸deoxycholic acid；UDCA：熊去氧胆酸ursodeoxycholic acid；HDCA：猪去氧胆酸hyodeoxycholic acid；Muro CA：鼠胆酸murocholic acid；7, 12KLCA：7.12-二酮石胆酸7, 12-keto lithocholic acid；LCA：石胆酸lithocholic acid；GCA：甘氨胆酸glycocholic acid；GHCA：甘氨鹅胆酸glycosylcholic acid；GCDCA：甘氨鹅脱氧胆酸glycochenodeoxycholic acid；GDCA：甘氨脱氧胆酸glycodeoxycholic acid；GUDCA：甘氨熊去氧胆酸glycoursodeoxycholic acid；GLCA：葡糖石胆酸glycolithocholic acid；GDHCA：甘氨脱氢胆酸glycodehydrocholic acid；TCA：牛磺胆酸taurocholic acid；TαMCA：牛磺α-鼠胆酸tauro-alpha-muricholic acid；TβMCA：牛磺β-鼠胆酸tauro-beta-muricholic acid；TωMCA：牛磺ω-鼠胆酸tauro-omega-muricholic acid；THCA：牛磺猪胆酸taurohyocholic acid；TCDCA：牛磺鹅去氧胆酸taurochenodeoxycholic acid；TDCA：牛磺脱氢胆酸taurodeoxycholic acid；TUDCA：牛磺熊去氧胆酸tauroursodeoxycholic acid；THDCA：牛磺猪去氧胆酸taurohyodeoxycholic acid；TLCA：牛磺石胆酸taurolithocholic acid；TDHCA：牛磺脱氢胆酸taurodehydrocholic acid；TCA-d5:牛黄胆酸-d5 taurocholic acid-d5。 图 1 标准品及样品中待测胆汁酸的提取离子流图 Fig. 1 Extracted ion chromatography of bile acids in standards and samples |
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表 3 不同种类胆汁酸的方法学参数及指标 Table 3 Analysis parameters and indexes of different bile acids |
根据上述建立的分析方法对大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸进行分析，检测到的胆汁酸种类及含量如表 4所示。
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表 4 大菱鲆胆汁和血浆中的胆汁酸 Table 4 Bile acids in bile and plasma of Scophthalmus maximus L. |
胆汁酸分为肝脏合成的初级胆汁酸和在肠道微生物作用下合成的次级胆汁酸。由表 4可知，在大菱鲆胆汁中检测到6种初级胆汁酸和4种次级胆汁酸，其中初级胆汁酸种类按照其含量高低排列分别为TCA、TCDCA、CA、GCDCA、GCA和CDCA；TCA的平均含量达到29 859.900 0 μg/mL，处在末位的CDCA平均含量只有5.394 7 μg/mL。次级胆汁酸检出种类按照其含量高低排列分别为TβMCA、TωMCA、GLCA和GHCA；其中TβMCA的平均含量为45.844 0 μg/mL，GHCA平均含量只有0.494 413 μg/mL。未检出其他20种胆汁酸。
2.4 大菱鲆血浆中的胆汁酸表 4列出了大菱鲆血浆中胆汁酸种类和含量，可以看出血浆中胆汁酸含量较低，检测到8种胆汁酸，其中5种初级胆汁酸和3种次级胆汁酸。初级胆汁酸按照其含量高低排列分别为CA、CDCA、GCDCA、TCA、TCDCA，含量在0.010 0~0.100 0 μg/mL；次级胆汁酸为ωMCA和TωMCA，含量在0.000 3~0.100 0 μg/mL。其余22种胆汁酸均未检出。
3 讨论 3.1 大菱鲆胆汁中的胆汁酸大菱鲆胆汁中检测到含量最高的2种初级胆汁酸为TCA和TCDCA，二者均为牛磺酸结合型胆汁酸，叠加含量占检测全部初级胆汁酸总含量的95%以上；这与啮齿动物小鼠的胆汁酸结合类型相似，小鼠大部分胆汁酸是牛磺酸结合型(约占95%)，胆汁酸池包含约60%的TCA和40%的Tα-MCA及Tβ-MCA，具有强亲水性，牛磺酸与胆汁酸的结合更有利于增加胆汁酸的亲水性，从而促进胆汁酸进入肠道发挥后续功能；而人类的胆汁酸池中CA约占40%，CDCA约占40%，DCA约占20%，甘氨酸与牛磺酸结合型胆汁酸的比例约为3 : 1，人类胆汁酸具有强疏水性[19]。在水产动物草鱼胆汁的相关研究报道[14]中发现，草鱼胆汁中检测到主要的初级胆汁酸为CA和CDCA，二者在本试验大菱鲆胆汁中也有检出，含量分别为2 179.63和7.061 3 μg/mL，其中CA的含量比草鱼报道中的含量高出100倍以上，这可能与取样时间有密切关系。本试验中大菱鲆投喂后禁食24 h采样，此时鱼体处于饥饿状态，肠道中的胆汁酸已经完成肝肠循环返回至胆汁中储存，更能反映鱼体本身的胆汁酸谱信息[14]。此外，在草鱼的研究报道中发现只有个别样品检测到了牛磺酸结合型胆汁酸TCDCA，而在本研究中TCDCA在所有大菱鲆胆汁样品中均有检出，说明胆汁酸的种类和含量在不同鱼之间存在差异。本试验中大菱鲆胆汁中主要初级胆汁酸的种类与含量与相关报道中大鼠[20]的研究结果相一致。大菱鲆胆汁中检测到主要的次级胆汁酸为TβMCA和TωMCA，而GLCA和含量较低的GHCA均为结合型胆汁酸，其他种类的次级胆汁酸未检出。由于肝脏不能合成次级胆汁酸，所以大菱鲆胆汁中的次级胆汁酸是经过肝肠循环后被肝脏重新吸收在胆汁中进行储存，可能存在一定生物学功能[14]。
在先前的研究报道中认为只有啮齿动物鼠类胆汁内才会出现鼠胆酸，其他哺乳动物如猪、羊、牛等都未检出[21-26]。另外，在草鱼[14]的研究报道中，由于没有涉及鼠胆酸类的分析检测，在其他分析的胆汁酸中发现草鱼胆汁中的次级胆汁酸主要为DCA和TDCA，与本试验结果中次级胆汁酸GLCA和GHCA也存在较大差异，说明胆汁酸的种类在不同鱼之间可能也存在较大差异。在大菱鲆的胆汁中检测到TβMCA和TωMCA，这是首次在鱼类胆汁中发现鼠胆酸类胆汁酸，可能与试验中大菱鲆的饲喂方式以及生理健康状态有关，值得在后期研究中引起关注及进一步在分子水平上确证挖掘。次级胆汁酸经肠道微生物作用而合成，并经过肝肠循环最终重吸收至胆囊中储存。次级胆汁酸和肠道微生物协调作用对机体的新陈代谢有着重要的调节作用[27]。由于ω-MCA是β-MCA主要代谢产物，通过6β-差向异构化形成[9]，本试验中出现的胆汁酸TβMCA和TωMCA可能是大菱鲆肝脏首先合成了MCA，之后在肠道微生物的作用下形成β-MCA并差向异构化形成ω-MCA，之后在体内与牛磺酸结合形成TβMCA和TωMCA。普遍认为只有在啮齿动物肝脏中存在的物种特异性固醇6β-羟化酶(CYP2C70)可以将大部分CDCA转化为α-MCA，接着α-MCA中7α-OH基团差向异构化为7β-OH基团，形成β-MCA[27-28]。MCAs及相关代谢产生的次级胆汁酸是啮齿动物体内主要的胆汁酸种类, 并且有着重要的生理功能[29]，人体在非健康状态下也会存在MCA，如孕妇在妊娠期患有肝胆淤积症(ICP)时[30]；并且值得引起注意的是，当ICP孕妇在使用UDCA进行治疗时，α-MCA对UDCA的代谢影响具有显著性意义，而β-MCA对UDCA和ω-MCA的代谢影响具有显著性意义。在大菱鲆或者其他鱼类体内，胆汁酸的合成路径研究尚处于起步阶段，目前只确定存在胆汁酸经典路径的合成酶胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)、胆固醇12α-羟化酶(CYP8B1)及胆固醇27α-羟化酶(CYP27A1)，对于可以将CDCA转化为MCA的相关酶或者控制相关酶表达的基因是否存在尚不清楚，有待后续进一步深入研究[15, 31]。
3.2 大菱鲆血浆中的胆汁酸血浆中的胆汁酸主要来源于肠道的吸收，但血浆中的胆汁酸会快速地被运送回肝脏，开启新一轮的肛肠循环，所以血浆中的胆汁酸含量一般较低[32]。本研究中检测到的血浆中的初级胆汁酸分别为TCDCA和CA，含量换算单位后分别约为0.23和0.21 μmo/L，此外还有较低含量的TCA和CDCA检出。这与胆汁中的胆汁酸种类和含量的分布基本一致。次级胆汁酸的含量很低，检出的只有ωMCA、GLCA和TωMCA，其余胆汁酸未检出。水产动物草鱼相关的研究报道中尚未在草鱼血浆中发现任何的胆汁酸，可能是由于草鱼血浆中的胆汁酸含量较低或者检测方法的建立等原因未检出[14]。
在哺乳动物大鼠的研究报道中发现正常大鼠血浆中的胆汁酸有初级胆汁酸CDCA、CA、GCA、TDCA、TCA、TCDCA、GCDCA以及次级胆汁酸HDCA、DCA、β-MCA、Tβ-MCA、UDCA、THDCA、GUDCA、GHDCA、和GDCA，其中含量较高的是HDCA、CA、DCA、GCA和β-MCA[23]，其中初级胆汁酸的种类与本研究相类似。由于β-MCA是啮齿动物鼠类主要的初级胆汁酸，其牛磺酸结合产物Tβ-MCA在血浆中含量也较高，为0.4 μmol/L[23]，与本研究中主要胆汁酸含量在同一水平。正常健康人体血浆中胆汁酸的含量较低，有文献报道中为GCDCA、HDCA、UDCA、CA和DCA，其中GCDCA的含量最高，为0.483 μmo/L[33]，与本研究和文献报道中的含量在同一水平。此外，上述研究报道中也指出，人体和啮齿动物血浆胆汁酸种类和含量在不同健康状态、环境因素的影响下会有较大差异，结合型胆汁酸水平也会随着机体状态的不同而发生种类和含量的改变。
3.3 胆汁酸对鱼类生命健康的影响近年来，由于对饲料中的高脂高糖物质代谢能力不足或者为降低养殖成本使用植物蛋白质替代鱼粉引起的养殖鱼类的营养性脂肪肝问题日益突出[13, 34-35]。在草鱼的相关研究中发现，草鱼的肥满度与胆汁中的胆汁酸含量呈负相关关系，鱼体越胖体内的胆汁酸CA和CDCA的含量越低[14]。其他动物相关研究结果也指出，代谢性疾病与胆汁酸的种类和含量变化有着密切关系，如在单纯性肥胖人类血浆胆汁酸谱的研究中发现，TCDCA和TCA的含量显著高于正常人对照组，二者在能量代谢相关疾病机制研究中可能存在有效作用[36]。目前，鱼类胆汁酸谱及轮廓分析研究尚处于起步阶段。从哺乳动物(人、小鼠和猪)的胆汁酸谱研究上看，不同种类的胆汁酸在调节非酒精性脂肪型肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、Ⅱ型糖尿病(TⅡDM)、代谢综合征(MS)、肠道相关炎症等疾病上的作用不尽相同[37-42]。由于客观条件限制，本研究中未涉及脂肪肝大菱鲆和正常健康状态大菱鲆胆汁酸的对比分析，如果可以实现此差异分析，明确在营养性肝病状态下胆汁酸的差异代谢路径和相关调控方式，可为后续大菱鲆或其他养殖鱼类营养性肝病的饲料靶向干预、特定种类胆汁酸定向治疗或者水产功能性饲料的开发提供技术基础。因此全面系统的分析养殖肉食性鱼类的胆汁酸轮廓，对后续利用胆汁酸进行营养调控、营养性肝病的预防治疗将有重大意义。
3.4 本试验研究局限性本试验通过固相萃取过程净化，利用UPLC-MS/MS法建立了30种初级和次级胆汁酸的定性定量分析方法，并实现了对大菱鲆胆汁和血浆中胆汁酸的种类及含量分析。本试验中采用内标校正，能够实现胆汁酸的准确定量分析。本试验中涉及的胆汁酸种类只有30种，大部分是文献的报道及现有商品化标准品的胆汁酸，但鱼类不同于哺乳动物及人类，其胆汁酸的种类可能有较大差异，一些尚未发现或缺乏商业化标准品的、或者含量微乎其微的胆汁酸检测给相关分析鉴定带来挑战。
4 结论本研究中利用UPLC-MS/MS法，采用同位素内标定量，建立了30种胆汁酸的分析方法，并对大菱鲆胆汁和血浆中胆汁酸的种类及含量进行分析。结果发现，大菱鲆胆汁中的初级胆汁酸主要是TCA、TCDCA、CA和CDCA，次级胆汁酸主要是TβMCA、TωMCA、GLCA和GHCA；血浆中初级胆汁酸主要是TCDCA、CA、TCA和CDCA，次级胆汁酸主要是ωMCA、GLCA和TωMCA。
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