2. 湖北省水生动物病害防控工程技术中心, 武汉 430070;
3. 华中农业大学水产养殖国家级实验教学示范中心, 武汉 430070
2. Hubei Engineering Technology Research Center for Aquatic Animal Diseases Control and Prevention, Wuhan 430070, China;
3. National Demonstration Center for Experimental Aquaculture Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China
克氏原螯虾(Procambarus clarkii),俗称淡水龙虾、小龙虾,在动物分类学上隶属节肢动物门(Arthropoda),甲壳纲(Crustacea),十足目(Orgerdecapoda),螯虾科(Cambaridae),原螯虾属(Procambams),原产于美国和墨西哥,20世纪30年代从日本传入中国[1-3]。因其营养丰富、味道鲜美,现已成为我国重要的经济养殖虾类。但是,随着克氏原螯虾养殖集约化水平提高,养殖病害也呈现上升趋势,因抗生素等药物使用而导致的问题也随之而来,因此,寻找一种安全健康的抗生素替代品成为当代水产养殖的热点之一。
壳寡糖(chitosan oligosaccharide,COS)是通过甲壳素脱乙酰化的产物壳聚糖(chitosan)降解得到的由2~10个氨基葡萄糖通过β-1, 4糖苷键连接而成的低聚糖。壳寡糖具有多种生理功能,应用比较广泛,具有提高养殖动物生长性能、调节肠道微生态、改善肠道组织形态、影响血液生化指标和增强免疫能力等功能[4-6]。目前,壳寡糖作为饲料添加剂在水产动物中应用较少,仅在刺参(Apostichopus japonicus Selenka)、凡纳滨对虾(Litopemaeus vannamei)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)等水产动物中有相关报道[7-14]。但是,关于壳寡糖在克氏原螯虾养殖中的应用未见报道,研究尚在起步阶段。因此,本试验旨在探究壳寡糖对克氏原螯虾消化酶活性、肠道菌群、血清非特异性免疫及抗病力的影响,为壳寡糖在虾蟹水产饲料中的应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验饲料壳寡糖购于济南某生物工程有限公司,为黄色粉末状,相对分子质量为3 000,脱乙酰基含量≥85%,水分含量≤10%,粗灰分含量≤1%。
基础饲料为商品料,颗粒状,购于某生物科技有限公司,主要原料包括大豆粕、鱼粉、菜籽粕、高筋面粉、玉米蛋白粉、氨基酸、维生素、矿物质元素及其络合物等。经二硝基水杨酸(DNS)法[15-16]检测,该基础饲料中不含壳寡糖。在基础饲料中分别添加0、200、400、800 mg/kg的壳寡糖,制成4种试验饲料,分别命名为C0、C200、C400和C800。基础饲料经粉碎后过60目筛,与溶于水的壳寡糖溶液混合均匀后挤压制粒为直径2 mm的颗粒饲料,自然阴干,密封保存。表 1为4种试验饲料的主要营养水平。
试验虾购于梁子湖克氏原螯虾养殖基地,试验开始前暂养7 d,期间投喂基础饲料,试验开始前禁食24 h。养殖试验在华中农业大学水产基地进行,挑选附肢完整、健壮活泼、初始体重为(17.39±1.20) g的克氏原螯虾240尾,随机分为4组,每组3个重复,每个重复20尾虾。各组分别饲喂添加0(C0组,对照组)、200(C200组)、400(C400组)和800 mg/kg(C800组)壳寡糖的试验饲料。克氏原螯虾饲养于70.0 cm×45.5 cm×15.5 cm的水族缸中,水族缸内水深约5 cm,并放入适当的聚氯乙烯(PVC)管作为隐蔽物。每日于09:00和17:00各投喂1次,投喂量为虾体重的2%~3%,并根据虾当天的摄食状况进行调整,保证饱食。每天虹吸出残饵及粪便,并更换充分曝气的自来水,换水量约为总水量的1/3。试验期间,水温保持在(25±1) ℃,溶解氧含量≥6 mg/L,pH为7.4~8.2,并使用增氧机连续充氧。试验期14 d。
1.3 样品采集及指标测定 1.3.1 消化酶活性测定养殖试验结束后禁食24 h。每个重复随机选取6尾虾,分别取其肠道和肝胰腺。将样品称重后,使用移液器吸取4倍于组织块体积的磷酸盐缓冲液(PBS),使用全自动低温组织研磨机充分匀浆后,使用冷冻离心机以2 000 r/min离心10 min,取上清液于4 ℃冰箱中保存,并于24 h内测定。肠道和肝胰腺胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
1.3.2 肠道菌群的测定养殖试验结束后禁食24 h。每个重复随机选取3尾虾,使用75%的酒精擦拭消毒,并在无菌操作条件下解剖取出完整的后肠,肠道样品迅速置于液氮中冷冻,随后转移至-80 ℃冰箱保存,送至上海派森诺生物科技有限公司通过Illumina MiSeq平台对肠道菌群进行高通量测序。16S rRNA的V3~V4区片段的扩增引物为341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)。对原始数据进行过滤处理并得到优化序列,对获得的序列按97%的序列相似度进行归并和操作分类单元(operational taxonomic units,OTU)划分,并选取每个OTU中丰度最高的序列作为该OTU的代表序列。基于OTU进行α多样性分析(Simpson指数、ACE指数、Chao1指数和Shannon指数),基于OTU划分和分类地位鉴定结果,进行群落结构的统计分析。
1.3.3 血清非特异性免疫指标的测定养殖试验结束后禁食24 h。每个重复随机选取10尾克氏原螯虾,使用1 mL的无菌注射器从克氏原螯虾头胸甲后方插入心脏取血淋巴,注入1.5 mL的离心管中,置于4 ℃冰箱中静置过夜,使用冷冻离心机以4 ℃、3 000 r/min离心10 min,取上清液置于-20 ℃冰箱中备用,并在24 h内测定。血清总抗氧化能力(T-AOC)及超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和过氧化氢酶(CAT)活性均使用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
1.4 攻毒试验养殖试验结束后,使用白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)进行攻毒试验。攻毒所使用的WSSV由华中农业大学水产学院病毒实验室提供。每个重复随机取出10尾克氏原螯虾进行攻毒试验,每组共30尾,从每尾克氏原螯虾第2腹节肌肉注射1.0×108拷贝的WSSV病毒悬液100 μL。每天记录死亡数,连续观察7 d,计算累积死亡率(cumulative mortality rate,CMR)。
1.5 数据处理试验数据用平均值±标准误表示,使用SPSS 22.0软件对试验数据进行处理及单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用Duncan氏法进行多重比较,显著性水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 壳寡糖对克氏原螯虾肠道及肝胰腺中消化酶活性的影响如表 2所示,饲料中添加壳寡糖能够提高克氏原螯虾肠道及肝胰腺中淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性。C200组和C800组的肠道淀粉酶活性显著高于C0组(P < 0.05),其中,C200组的肠道淀粉酶活性最高;C200组、C400组和C800组的肠道脂肪酶、胰蛋白酶活性及肝胰腺淀粉酶、脂肪酶活性均显著高于C0组(P < 0.05),其中,C200组的肠道脂肪酶活性及肝胰腺淀粉酶活性最高,C800组的肠道胰蛋白酶活性及肝胰腺脂肪酶活性最高;C200组和C400组的肝胰腺胰蛋白酶活性显著高于C0组(P < 0.05),其中,C200组的肝胰腺胰蛋白酶活性最高。
如表 3所示,C200组的Simpson指数、Chao1指数、ACE指数及Shannon指数均显著高于C0组(P < 0.05);C400组的Simpson指数显著低于C0组(P < 0.05);C800组的Shannon指数显著低于C0组(P < 0.05)。
各组的肠道菌群结构在门水平上的组成如图 1所示,4个组的菌群组成在门水平上,主要由变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、软壁菌门(Tenericutes)、放线菌门(Actinobacteria)等门类组成。各组中变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和软壁菌门的相对丰度均达到90%以上,但是在各组所占比例有所不同。与C0组相比,C200组、C400组和C800组的变形菌门的相对丰度均有所下降,厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门的相对丰度均有所上升。
各组的肠道菌群结构在属水平上的组成如图 2所示,肠道菌群一共发现404个菌属,其中主要有红细菌属(Rhodobacter)、拟杆菌属(Bacteroides)、沙雷氏菌属(Serratia)、希瓦氏菌属(Shewanella)、乳球菌属(Lactococcus)等菌属。选取各组中相对丰度排名前10位的菌属,并计算其在各样品中的比例如表 4所示。在C0组中,红细菌属(40.17%)、乳球菌属(11.67%)、沙雷氏菌属(9.87%)为优势菌属;在C200组中,红细菌属(31.39%)、沙雷氏菌属(20.86%)、拟杆菌属(13.19%)为优势菌属;在C400组中,红细菌属(47.43%)、沙雷氏菌属(13.83%)、拟杆菌属(11.45%)为优势菌属;在C800组中,拟杆菌属(64.66%)、希瓦氏菌属(17.95%)和红细菌属(7.09%)为优势菌属。各组中相对丰度较高并且共有的菌属有红细菌属、乳球菌属、希瓦氏菌属和拟杆菌属,这4个菌属总比例达到60%以上。红细菌属在C400组中比例最高,C800组中比例最低;拟杆菌属在C0组中比例最低,在C200组、C400组和C800组中的比例都有所增加,并在C800组时达到最大;希瓦氏菌属在C800组中的比例最高,在其他各组的比例都有所降低。
如表 5所示,各组之间血清T-AOC无显著差异(P>0.05);C200组的血清SOD活性显著低于C0组(P < 0.05),C400组和C800组的血清SOD活性与C0组无显著差异(P>0.05);C200组、C400组和C800组的血清AKP活性较C0组均有不同程度的提高,其中,C400组和C800组的血清AKP活性显著高于C0组(P < 0.05),C200组的血清AKP活性与C0组无显著差异(P>0.05);C400组的血清ACP活性显著高于C0组(P < 0.05),C200组和C800组的血清ACP活性与C0组无显著差异(P>0.05);C200组、C400组和C800组的血清CAT活性均显著低于C0组(P < 0.05)。
如图 3所示,感染WSSV后第7天,克氏原螯虾的累积死亡率随着壳寡糖添加水平的增加而下降。其中,C0组和C200组在第7天的累积死亡率均达到了63.33%,C400组和C800组在第7天的累积死亡率分别为36.67%和26.67%,相较于C0组分别降低了42.10%和57.89%。
消化酶活性在很大程度上反映出动物从食物中获取营养的能力与效率,进而影响动物的生长发育情况[17-19]。在本试验中,C200组、C400组和C800组的肠道消化酶活性较C0组均有不同程度的增加,其中,C200组的肠道淀粉酶活性和脂肪酶活性均显著高于其他各组,分别较C0组提高了16.76%和239.16%;C800组的肠道胰蛋白酶活性显著高于其他各组,较C0组提高了108.03%。Su等[17]研究发现,红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肠道中蛋白酶和脂肪酶活性随着饲料中壳寡糖添加水平的增加而呈现上升趋势,并于2‰添加水平时达到最大值。潘金露[20]研究发现,在饲喂0、0.02%、0.05%、0.20%和0.50%的壳寡糖饲料后,大菱鲆的肠道消化酶活性较对照组有不同程度的增加。胡晓伟等[18]研究发现,在花鲈(Lateolabrax japonicus)幼鱼饲料中添加0.6%~1.0%的壳寡糖能够显著提高肠道的胰蛋白酶活性,添加0.4%~0.8%的壳寡糖能显著提高肠道的脂肪酶活性。
当前,有关于寡糖对水产动物肝胰腺的消化酶活性影响的报道不多,Sang等[21]研究发现,0.4%的甘露寡糖可以增加天空蓝魔虾(Cherax destructor)肝胰腺中的蛋白酶活性。熊沈学[22]研究发现适量的低聚木糖可以增加异育银鲫(Allogynogenetic crucian Carp)肝胰脏的蛋白酶活性。王艳[23]研究发现,果寡糖可以显著增加银鲫(Carassius auratus)肝脏中的消化酶活性。在本试验中,C200组、C400组和C800组的肝胰腺消化酶活性较C0组均有不同程度的增加,其中,C200组的肝胰腺淀粉酶、胰蛋白酶活性均显著高于其他各组,分别较C0组提高了5.76%和9.28%;C800组的肝胰腺脂肪酶活性较C0组提高了161.62%。壳寡糖对于不同的水产动物的肠道及肝胰腺消化酶活性有着不同的效果,可能与其食性、生活环境等条件相关。
3.2 壳寡糖对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响虾类消化道中的细菌大多是通过环境或者食物进入消化道中定植并在此生长繁殖的,并成为了虾类消化道中重要的组成成分,与虾体的健康密切相关。肠道利于细菌定植、环境相对稳定且营养丰富,因此成为消化道内细菌数量最多的一个部位[24]。肠道是虾类重要的消化吸收器官,不同的肠道菌群在宿主的肠道中共同生存、相互制约,形成了一个动态平衡的菌群结构。寡糖通常被认为是一种肠道功能的调节剂,能够改善动物肠道菌群结构,促进有益菌的生长,从而抑制有害菌的繁殖。
蔡雪峰等[11]研究发现,在饲料中分别添加20、40和60 mg/kg的壳寡糖对虹鳟幼鱼肠道内细菌的总数没有影响,但是各组的肠道优势菌产生了变化。司滨等[8]研究发现,饲料中添加壳寡糖可以增加刺参肠壁菌群的多样性和菌落丰度。本试验结果显示,C200组克氏原螯虾肠道菌群的多样性和丰富度均增加,C400组和C800组的肠道菌群多样性有所下降,这可能是因为壳寡糖在酸性的肠道环境中,其分子中游离的氨基被质子化,后与带正电的细菌细胞膜作用,阻碍细胞膜的正常功能、抑制了一部分细菌的生长[4]。
本试验中,各组克氏原螯虾肠道菌群结构在门水平上主要由变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和软壁菌门组成,这表明克氏原螯虾的肠道菌群的组成在门水平上具有一定的保守性,但是各个门类分别所占的比例有所变化,说明壳寡糖对克氏原螯虾的肠道结构起到一定的调节作用。张立强等[25]对武汉市江夏区金水闸某养殖场的健康与患病克氏原螯虾的肠道菌群进行比较,结果表明门水平上主要由厚壁菌门、变形菌门、软壁菌门等组成,与本试验结果一致;洪斌等[26]利用高通量测序和变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对凡纳滨对虾和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的肠道微生物进行分析,发现凡纳滨对虾和罗氏沼虾肠道菌群在门水平上主要由变形菌门、软壁菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门组成,这说明克氏原螯虾与其他虾类的肠道菌群结构有一定的共性。变形菌门与鱼类样品腐败有着密切的关系[27],并且有报道证实,患病动物肠道内的变形菌门的相对比例会显著升高[25, 28]。在本试验中,C200组、C400组和C800组克氏原螯虾肠道内变形菌门的相对丰度低于对照组,这说明壳寡糖可以改善肠道的健康状况。
通过对比各组克氏原螯虾肠道菌群中相对丰度前10位的菌属后发现,各组之间只有4种共有菌属,并且各菌属的比例也有较大差别,其比例与壳寡糖添加水平之间的关系并不明显。红细菌属是一种广泛存在于水体中的光合细菌,可以产生各种消化酶,协同动物体本身的消化酶降解饲料中的营养物质并提高免疫力与抗病力[29],有的红细菌属还可以合成叶黄素和β-类胡萝卜素,并在鱼类发育中作为自由基清除剂参与了免疫防御机制[30],乳球菌属于乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)的一种[31],乳球菌属多数为致病菌,可以影响多种鱼类并造成严重的经济损失[32],但目前并未有相关报道证明其对虾类也有致病性,并且也有报道称乳球菌属的某些菌株可以生产用于防腐保鲜作用的细菌素[33]。部分希瓦氏菌属是人类和水产动物的潜在病原,对多种海水、淡水养殖的水产动物均有感染性[34],但目前未有相关研究证实希瓦氏菌属可以让甲壳动物患病。拟杆菌属是人体和动物体内普遍存在的肠道微生物区系的正常组成部分,有报道称在克氏原螯虾体内分离到可以降解木聚糖、分解纤维素的拟杆菌属[35],也有研究表明拟杆菌属可以增强机体的免疫力[36]。
3.3 壳寡糖对克氏原螯虾血清非特异性免疫指标的影响甲壳动物体内没有脊椎动物那样的引起特异性免疫的相关因子,因此非特异性免疫在克氏原螯虾的免疫防御中发挥着极其重要的作用。SOD可以清除生物体内多余的自由基,保证动物机体内部的稳态,还在抗衰抗炎方面有着重要的作用。CAT普遍存在于各种动物体内,在生物防御中起着维持氧化还原平衡起着重要的作用。AKP在虾体内主要由肝胰腺产生,在调控代谢方面有着重要的作用[37]。ACP是甲壳动物体内吞噬溶酶体重要组成部分,ACP通常随着血细胞进行吞噬和包囊反应的进行而释放[38]。
关于壳寡糖对水产动物非特异性免疫影响的结果并不一致。陈伟军等[9]研究发现,在饲料中添加一定水平的壳寡糖可以增强凡纳滨对虾的总抗氧化能力和超氧化物歧化酶活性;孙立威等[12]研究发现,在饲料中分别添加0.10%、0.30%、0.50%的壳寡糖能够显著提高吉富罗非鱼幼鱼血清SOD和AKP活性。但也有报道表示壳寡糖对大黄鱼(Pseudosciaena crocea)幼鱼血清SOD和CAT活性没有显著影响[38-39]。本试验结果显示,C200组、C400组和C800组的血清AKP活性较C0组有所提高;C400组的血清ACP活性显著提高,但其他各组较C0组有所下降;C200组、C400组和C800组的血清SOD和CAT活性较C0组均有不同程度地下降。与本试验结果相似的是,一些研究报道也发现壳寡糖会降低大菱鲆和花鲈血清中超氧化物歧化酶等免疫指标的活性[14, 18]。在本试验中,壳寡糖对克氏原螯虾的非特异性免疫在部分指标(SOD和CAT活性)上呈现出抑制的趋势,这可能是因为对于同一添加剂,不同的免疫因子产生反应的时间长短不同、产生的反应也会有差异,并且这些差异也可能与试验中使用的壳寡糖的理化因子、添加水平或者试验动物的种类有关。
3.4 壳寡糖对克氏原螯虾抗病力的影响白斑综合征(white spot disease,WSD)是严重威胁虾类养殖业持续健康发展的重要疾病之一,其病原为WSSV。WSSV是一种具有囊膜结构的杆状病毒[40],有着分布广、流行范围大、传染性强、发病时间短等特点,是多种甲壳动物的主要病原[41]。本试验结果显示,在饲料中添加壳寡糖能降低累积死亡率,增强克氏原螯虾对WSSV的抗病力,在感染WSSV第7天,C400组和C800组的累积死亡率分别为36.67%和26.67%,相较于C0组分别降低了42.10%和57.89%。目前,壳寡糖对于抗细菌病感染影响的相关报道较多。研究证明,壳寡糖能够提高凡纳滨对虾对副溶血弧菌(Vibrio parahemolyticus)的抗感染能力[42],增强卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)对哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)的抗病力[43],提高吉富罗非鱼幼鱼抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的能力[12],在一定程度上增强刺参对灿烂弧菌(Vibrio splendidu)的抗病能力[7]。壳寡糖多被报道用于植物的抗病毒研究[44-46],但有关壳寡糖对动物病毒病影响的研究报道很少。壳寡糖作为一种益生元,可以选择性地促进肠道内有益菌群的生长,从而抑制有害菌群的繁殖,能够在一定程度上改善动物肠道内的微生态环境[4],国内外有许多报道已经证实了益生菌能够提高虾类抗WSSV的能力[47-48]。此外,壳寡糖还可能是通过提高克氏原螯虾的非特异性免疫能力,增强了机体抗WSSV的能力,从而降低了克氏原螯虾感染WSSV之后的累积死亡率。
4 结论① 饲料中添加200 mg/kg壳寡糖可以提高克氏原螯虾肠道中的淀粉酶和脂肪酶活性及肝胰腺中的淀粉酶和胰蛋白酶活性,添加800 mg/kg可以促进克氏原螯虾肠道中的胰蛋白酶活性及肝胰腺中的脂肪酶活性。
② 饲料中添加壳寡糖可以促进克氏原螯虾肠道中厚壁菌门、拟杆菌门和软壁菌门的增殖,抑制变形菌门的增殖,添加200 mg/kg时可以增加克氏原螯虾肠道菌群的丰富度和多样性。
③ 饲料中添加壳寡糖可在一定程度上降低克氏原螯虾血清SOD和CAT活性,抑制非特异性免疫反应。
④ 饲料中添加400和800 mg/kg壳寡糖会降低克氏原螯虾感染WSSV后的死亡率,提高抗WSSV感染的能力。
⑤ 综上所述,若以改善克氏原螯虾肠道健康为目的,建议壳寡糖添加水平为200 mg/kg;若以增强克氏原螯虾对WSSV的抗病力为目的,建议壳寡糖添加水平为800 mg/kg。
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