2. 河北科技师范学院动物科技学院, 河北省特色动物种质资源挖掘与创新重点实验室, 秦皇岛 066004
2. Hebei Key Laboratory of Specialty Animal Germplasm Resources Innovation and Utilization, College of Animal Science and Technology, Hebei Normal University of Science and Technology, Qinhuangdao 066004, China
铜是畜禽生长的必不可少的微量元素，在畜禽的造血、免疫、抗氧化、骨骼和毛色发育上有重要作用，此外铜离子还是铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)、铜蓝蛋白(CER)等多种酶的重要组成部分。前人研究发现，仔猪饲喂添加铜的饲粮可以提高生长性能[1]。随后铜对畜禽的作用广泛被国内外学者关注。张永翠等[2]在獭兔上的研究发现，饲粮中铜水平为40~80 mg/kg时，不仅会提高生长性能、产毛性能，还会提升血清中抗氧化酶的活性。在蓝狐、水貂的研究中发现，饲粮中添加铜会提高体重、饲料利用率和机体抗氧化能力；硫酸铜的消化利用率低于蛋氨酸铜和碱式氯化铜[3-4]。铜可以提高畜禽的生产性能已达成共识。目前市场的铜添加剂的主要形式为价格低廉的硫酸铜，由于运输、储存过程中硫酸铜易潮解、机体对其吸收利用率低、对肠道易产生刺激作用，并且硫酸根离子可破坏维生素等活性成分[5-7]，这对实际生产具有严重影响，因此开发稳定性强、利用率高并且安全性良好的铜源迫在眉睫。研究表明，碱式氯化铜是硫酸铜的优质替代，与硫酸铜相比，饲粮中添加碱式氯化铜、有机铜可更好地提高狐、猪的生长性能[8-9]。但也有学者通过对鸡、鸭的研究发现，饲粮中添加不同铜源对动物生长影响不大[10-11]。由此可见，不同动物对不同铜源的吸收利用率有着明显差异。貉是我国重要的毛皮动物，但是貉对不同铜源的吸收利用效果尚不明确，为确定貉对不同铜源的吸收利用率、明确不同铜源对貉的抗氧化能力的影响，本试验通过在貉饲粮中添加相同剂量的碱式氯化铜、硫酸铜及蛋氨酸铜，通过对貉的生产性能、血清生化指标、器官指数及肝脏相关基因表达量等指标的检测，探讨不同铜源对貉生长发育的作用效果，为貉生产中选择高效铜源提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及分组选择农业部长白山野生生物资源重点野外科学观测试验站饲养的乌苏里貉，随机选取(135±5)日龄、健康、体重[(6.33±0.02) kg)]相近的雄性乌苏里貉60只，随机分成4组(Ⅰ~Ⅳ组)，每组15只，每只单笼饲养，各组间初重差异不显著(P>0.05)。
1.2 试验设计及饲粮采用单因素试验设计，在基础饲粮中分别添加硫酸铜(Ⅰ组)、碱式氯化铜(Ⅱ组)、混合铜(Ⅲ组，碱式氯化铜和蛋氨酸铜，添加比例为1 : 1，以铜元素计)和蛋氨酸铜(Ⅳ组)，以铜元素计添加水平均为60 mg/kg。
参考NRC(1982)[12]以及生产实践中饲喂效果较好的冬毛期乌苏里貉饲粮配方配制基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验开始前，按常规免疫程序对动物进行免疫。预试期7 d，正试期60 d，试验于2018年9月30日至2018年12月5日进行。每日定时定量饲喂，07：00与15:30各饲喂1次，自由饮水，定时清洁打扫笼舍。
1.4 生产性能测定正式试验第1天早晨，称量乌苏里貉空腹体重，作为初重，试验结束最后1 d早晨，空腹称其重量，作为末重。随后处死，乌苏里貉的体长是把处死的貉平放于水平地面，其鼻尖至尾根的距离。鲜皮重为貉皮去油后重量。鲜皮长为貉皮去油后，上楦板，测量鼻尖到尾根的距离。之后按随机取样方法在貉背中部取带毛囊的样本3束，分别放入自封袋内。带回实验室后，使用游标卡尺分别测定貉的针毛和绒毛长度，采用光学纤维直径分析仪测定貉背部针、绒毛细度，以最粗部位直径进行数据记录。
1.5 样品采集与测定 1.5.1 饲粮养分含量的测定粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)测定；粗脂肪含量采用索氏浸提法(GB/T 6433—2006)测定；钙含量采用乙二胺四乙酸(EDTA)络合滴定法(GB/T 6436—2002)测定；磷含量采用钒钼酸铵比色法(GB/T 6437—2002)测定；铜含量采用火焰原子吸收光谱法(GB/T 5009.13—2017)测定。
1.5.2 血清生化指标的测定饲养试验结束时，每组随机选取8只健康乌苏里貉，活体空腹称重后采心血10 mL并处死，血液收集于促凝采血管中，经3 500 r/min离心8 min，将分离出的血清分装在1.5 mL编好号的Eppendorf管中，置于-80 ℃保存，备用。
血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、乳糖脱氢酶(LDH)活性及葡萄糖(GLU)含量采用试剂盒(中生北控生物科技股份有限公司)测定，使用仪器为VITALIB-E全自动生化分析仪。
血清中总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu-Zn SOD)、铜蓝蛋白(CER)活性采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定，使用仪器为紫外分光光度计测定吸光度并计算酶活性。
1.5.3 脏器指数的测定各组中选8只乌苏里貉处死，取皮后迅速取出心脏、肝脏、脾脏和肾脏，用滤纸吸干脏器表面的血液后进行称重记录，然后计算各脏器指数：
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貉肝脏样品中的RNA提取使用TransZolU方法，试剂盒由北京全式金生物技术有限公司提供。按照试剂盒说明，进行反转录，反应体系为20 μL。
1.5.4.2 引物设计与合成内参基因参考文献[13]，引物设计参考犬类的mRNA序列，利用Primer premier 5.0和Oligo 6.0软件设计相关基因特异性引物。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
以各组貉肝脏的cDNA为模板，使用SYBR Green Ⅰ嵌合荧光进行PCR，试剂盒采购于北京全式金生物技术有限公司，具体反应体系为：1 μL模板，上、下游引物各0.5 μL，Transstart Tip Green qPCR SuperMix为10 μL，Passive Reference Dye为0.5 μL，7.5 μL的ddH2O，总反应体系为20 μL。具体反应条件为：95 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共40个循环。使用2-ΔΔCt法对目的基因的相对表达量进行计算。
1.6 数据统计结果以平均值和标准误表示，试验数据通过SAS 9.4中单因素方差分析(one-way ANOVA)进行显著性检验，采用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 不同铜源对冬毛期乌苏里貉生产性能的影响如表 3所示，Ⅰ组貉末重显著低于其余各组(P < 0.05)。Ⅳ组针毛长显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.05)。各组间鲜皮长、体长、鲜皮重、针毛细度、绒毛长、绒毛细差异不显著(P>0.05)，其中Ⅳ组的鲜皮长、体长、鲜皮重、针毛细度与绒毛长有最大值，Ⅰ组的鲜皮长、体长、针毛细度与绒毛细度有最小值。
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表 3 不同铜源对冬毛期乌苏里貉生产性能的影响 Table 3 Effects of different copper sources on performance of raccoon dogs in winter fur-growing period |
如表 4所示，各组间肝脏指数、心脏指数、脾脏指数与肾脏指数差异不显著(P>0.05)。
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表 4 不同铜源对冬毛期乌苏里貉脏器指数的影响 Table 4 Effects of different copper sources on organ indexes of raccoon dogs in winter fur-growing period dogs |
如表 5所示，Ⅰ、Ⅱ组血清GLU含量显著低于Ⅲ、Ⅵ组(P < 0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ组血清CER活性显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅲ、Ⅵ组血清T-SOD活性显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅵ组血清Cu-Zn SOD活性显著高于Ⅰ组(P < 0.05)。各组间血清ALP、LDH、ALT与AST活性差异不显著(P>0.05)。
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表 5 不同铜源对冬毛期乌苏里貉血清生化指标的影响 Table 5 Effects of different copper sources on serum biochemical indexes of raccoon dogs in winter fur-growing period |
如图 1所示，Ⅳ组肝脏CER基因相对表达量显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅲ、Ⅳ组肝脏生长激素受体(GHR)基因相对表达量显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅲ、Ⅳ组肝脏胰岛素生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)基因相对表达量显著高于Ⅰ组(P < 0.05)，Ⅲ、Ⅳ组肝脏Cu-Zn SOD基因相对表达量显著高于Ⅰ、Ⅱ组(P < 0.05)。
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数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05). 图 1 不同铜源对冬毛期乌苏里貉肝脏CER、GHR、Cu-Zn SOD与IGF-Ⅰ基因相对表达量的影响 Fig. 1 Effects of different copper sources on relative expression levels of liver CER, GHR, Cu-Zn SOD and IGF-Ⅰ genes of raccoon dogs in winter fur-growing period |
毛皮质量的高低严重影响毛皮动物的经济效益，而铜对机体被毛有重要影响，机体铜缺乏会出现毛发脱色、弯曲、质脆和易折断的现象，因此在貉饲粮中添加易吸收的铜具有重要意义。在毛皮动物的研究中发现，动物体重与体长、毛皮长、毛皮面积呈正相关[14]。本试验中发现，不同铜源对乌苏里貉体长、鲜皮长和皮重没有显著影响，但是蛋氨酸铜组和混合铜组的体长、鲜皮长有一定幅度的升高，这可能是蛋氨酸铜和混合铜对貉体重的促进效果更优异导致。毛皮重量和毛皮的韧性息息相关，毛皮过轻时，毛皮的韧性降低，易拉断。李向辉等[15]研究发现，通过在北京鸭饲粮中添加硫酸铜和氨基酸螯合铜，氨基酸螯合铜组的末重高于硫酸铜组。高风仙等[16]在猪的研究中同样发现不同铜源对体重的提升效果不明显。Jegede等[17]也同样得出相似结论。但是本试验中发现，铜源对针毛的长度有一定影响，其中蛋氨酸铜组和混合铜组的针毛长度增加明显。针毛具有长、直、粗、弹性好等特点，具有稳定被毛结构的作用[18]。此外，针毛的长度和髓质腔的大小呈正相关，髓质腔内容纳静止空气的量越多，毛皮的保温效果越好[19-20]。哺乳动物被毛的隔热性效果主要通过被毛容纳空气含量多少决定，一种通过提升毛皮密度而提升髓质腔的数量，从而提升毛皮的隔热性，另一种通过提高髓质腔的体积来提高容纳空气的含量，从而提升其保温效果[21]。本试验结果显示，铜源对绒毛的长度、针绒毛的细度没有显著影响，不会通过降低针绒毛细度提升毛皮密度[22]，但是还额外提升了毛皮的结构稳定性，间接地提升了毛皮品质。综上所述，饲粮中添加蛋氨酸铜和混合铜会提升貉的末重，使貉的体长和鲜皮长有增加趋势，这有利于获得更大的毛皮面积，而且毛皮重量没有显著变化，说明不会影响貉皮的延展性。此外，蛋氨酸铜和混合铜对貉的毛皮密度没有显著影响，但是针毛长度增加，提高了毛皮的稳定性，由此得出，饲粮中添加蛋氨酸铜和混合铜更适合冬毛期乌苏里貉的毛皮发育。
3.2 不同铜源对冬毛期乌苏里貉脏器指数的影响脏器指数可以在一定程度上反映机体的器官功能的强弱，如脾脏指数的提升，证明机体免疫器官能力的增强，肾脏指数的升高，表明肾脏有水肿的可能[23-24]。肝脏是储存铜的主要器官，当其铜含量过高时，会导致肝脏受损[25]。本试验中，饲喂不同铜源对貉的脏器指数没有显著影响，表明该剂量的不同铜源对貉的脏器发育不会产生损伤，但是用碱式氯化铜和蛋氨酸铜混合饲喂时，貉的心脏指数有明显增高趋势。当饲粮中饲喂高铜饲粮时，会造成心肌肥大、心肌中线粒体自噬[26]。但是本试验中所有组别添加铜的剂量相同，这可能与机体对不同铜源的吸收利用率的高低所导致[27-28]。无机铜通过分解为铜离子，然后结合为氨基酸螯合铜的方式被机体吸收，但是蛋氨酸铜以胞饮的方式进入体内，这可能导致了机体对混合铜组的铜吸收利用率增高。由此推断，混合饲喂方式使貉对铜的吸收利用途径变得不再单一，在一定程度上提升了铜的有效利用率。
3.3 不同铜源对冬毛期乌苏里貉血清生化指标的影响血糖是身体细胞、组织、器官重要的能量来源。血清中铜和锌含量严重影响血清中血糖含量，锌与胰岛素的合成、分泌、降解等功能相关，缺锌可诱导产生胰岛素的抵抗，从而导致血糖升高，而铜和锌之间的吸收相互拮抗[29]。血清ALT与AST是反映肝脏健康的重要指标，当肝脏受损时，其活性会显著升高[30]。LDH在血清中的活性较少，大部分存在于内脏器官中，主要参与糖酵解过程[31]。ALP与骨骼的发育密切相关，在生长阶段血清ALP活性显著高于体成熟阶段的活性[32]。本试验中，铜源对血清GLU含量有显著影响，可能机体对有机铜的吸收利用率高，由于铜和锌之间的拮抗效应所引起锌的继发性缺乏，从而导致胰岛素分泌降低，血清GLU含量降低速率慢。但此时的剂量对貉的骨钙化没有影响，这是由于在冬毛期貉骨骼发育完全，所以血清ALP活性没有显著差异。不同铜源对LDH、AST、ALT活性影响不显著。这可能是由于饲粮的铜含量较低，可以被脏器充分代谢，不会造成机体负担。
铜是Cu-Zn SOD的活化中心和辅助中心，主要清除机体内O2-离子自由基，是机体重要的抗氧化酶，CER是一种含铜的具有氧化活性的糖蛋白，具有抗氧化、维持血液铜铁平衡的功能[33-35]。肝脏贮存铜的含量与血清中Cu-Zn SOD与CER活性密切相关，在一定范围内，肝脏铜的含量越高，合成的Cu-Zn SOD与CER越多。本试验研究发现，不同铜源对CER与SOD活性有显著影响，这可能是由于不同铜源的有效利用率不同，导致肝脏内贮存铜的含量也有差异。在水貂上的研究表明，蛋氨酸铜的吸收利用率显著高于碱式氯化铜又高于硫酸铜[36]。由此可知，在饲粮中铜含量相同的情况下，蛋氨酸铜组和混合铜组的血清Cu-Zn SOD与CER活性高于碱式氯化铜组和硫酸铜组。
3.4 不同铜源对冬毛期乌苏里貉肝脏相关基因相对表达量的影响貉的生长主要通过生长激素(GH)轴调控，而GH轴的中心环节是GH，GH主要通过作用与于靶细胞的GHR，从而分泌IGF-Ⅰ，进而调控其生长[37]。刘国文等[38]研究表明，铜可以提升血清中IGF-Ⅰ的含量，进而影响猪的生长。吴金节等[39]研究表明，铜也可以促进仔猪垂体GH分泌，这可能会导致靶细胞GHR的增多。CER与Cu-Zn SOD都是体内的含铜酶，主要产生于肝脏，通过血液运输到身体各个组织。张永翠等[2]在獭兔研究中发现，铜会增高血清中CER与Cu-Zn SOD的活性。饲粮中铜水平的升高，也会影响CER与Cu-Zn SOD基因的表达[40]。本试验结果表明，混合铜组与蛋氨酸铜组肝脏中GHR与IGF-Ⅰ基因相对表达量提高，肝脏是铜的主要储存器官，而体内的IGF-Ⅰ主要来自于肝脏，铜刺激了GHR基因表达，GHR受体增多，更利于GH的结合，诱导IGF-Ⅰ基因表达增多。此外肝脏铜的含量增多，会使CER与Cu-Zn SOD基因表达量升高，促进肝脏CER与Cu-Zn SOD的合成，使血清中CER与Cu-Zn SOD活性升高。由此得知，由于铜源不同，导致蛋氨酸铜组和混合铜组的肝脏内IGF-Ⅰ、GHR、CER与Cu-Zn SOD基因相对表达量高于碱式氯化铜组和硫酸铜组，也导致了貉的末重和血清CER与Cu-Zn SOD活性升高。
4 结论综上所述，蛋氨酸铜组和混合铜组冬毛期乌苏里貉末重和血清CER与Cu-Zn SOD活性高于碱式氯化铜组和硫酸铜组。蛋氨酸铜和混合铜会显著提高其肝脏GHR、IGF-Ⅰ、CER与Cu-Zn SOD基因相对表达量。添加相同剂量的铜，蛋氨酸铜和混合铜对机体的作用效果好于单一添加碱式氯化铜和硫酸铜。虽然蛋氨酸铜作用效果优于碱式氯化铜和硫酸铜，但由于其价格昂贵，单一添加无疑会增加饲养成本。在本次试验中，混合铜组的作用效果与蛋氨酸铜组的作用效果相似，但是会降低饲粮成本，因此建议实际生产中，无机铜和有机铜混合使用。
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