2. 天津农学院动物科学与动物医学学院, 天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室, 天津 300384
2. Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
肠产毒性大肠杆菌(ETEC)是引起仔猪腹泻的主要致病菌之一[1],ETEC通过多种类型的菌毛黏附素与小肠黏膜上皮细胞的微绒毛和细胞表面的受体相结合,从而在肠道内大量繁殖,释放肠毒素引致腹泻[2],同时可损伤肠上皮细胞结构的完整性、增加肠道的通透性[3-4]。闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和闭锁蛋白(occludin)是构成肠上皮细胞紧密连接结构的重要蛋白,能够有效封闭细胞间隙,阻止病原菌侵入,紧密连接蛋白的表达异常将导致肠道屏障功能损伤、肠道通透性增加。现有研究表明,ETEC通常会引起肠黏膜发炎和上皮细胞凋亡,随后导致肠内稳态和肠屏障功能的破坏[5]。核转录因子-κB(NF-κB)是一种多亚基核转录因子,在许多基因的调控中起重要作用,包括参与免疫和炎症、促进或抑制趋化性及相关凋亡蛋白的表达、细胞增殖以及肿瘤发生[6]。有研究表明,当细胞被炎症介质或氧化应激等因素诱导时,NF-κB进入细胞核调节细胞因子和炎症介质的表达,从而调节组织和细胞的生理和病理过程[7]。Toll样受体(TLR)是一种先天性免疫模式识别受体,其中TLR2和TLR4主要参与细菌及其产物的识别,一旦被激活就会通过信号级联反应激活其通路中关键分子NF-κB,进而产生肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素(IL)等免疫分子,调节机体炎症反应[8]。Kim等[9]已经证实TNF-α诱导的相关促炎因子能在肠上皮细胞中过度表达和分泌。很少有研究检测肠部位TLR介导的细胞因子对ETEC感染的反应。本课题组前期研究发现,ETEC处理显著增加了断奶仔猪肠系膜淋巴结中TLR2和TLR4的mRNA表达量以及血清中TNF-α、IL-8的含量[10]。
Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路在调节细胞增殖、极性、凋亡以及组织的内环境平衡中起着重要作用[11],在肠上皮中,Wnt信号通路促进肠隐窝中干细胞的增殖和分化[12]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的核心转录因子,β-catenin一旦被激活便转位到细胞核,启动人髓细胞增生原癌基因(c-Myc)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)等Wnt特异性基因的转录,从而促进细胞增殖,有助于受损细胞的修复[13-14]。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分,是大肠杆菌致病的主要因素,可引起机体的炎症反应。Shu等[15]研究表明,LPS能够激活小鼠软骨细胞ATDC5中NF-κB信号通路产生炎症反应,同时LPS刺激显著降低细胞中β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白表达量。
由此可见,LPS能够通过NF-κB/β-catenin信号通路影响细胞生理功能。然而,NF-κB/β-catenin信号通路是否参与ETEC引起的细胞损伤目前尚不清楚。因此,本试验拟通过ETEC感染建立IPEC-J2细胞炎症损伤模型,研究ETEC感染IPEC-J2细胞后对细胞中紧密连接蛋白、TLR、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的mRNA表达量以及细胞培养上清液中TNF-α、IL-8含量和LDH活性的影响,并基于NF-κB/β-catenin信号通路研究ETEC引起IPEC-J2细胞损伤的分子机制,为有效改善仔猪肠道屏障功能奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 细胞和菌株IPEC-J2细胞购于上海某生物工程有限公司,ETEC K88为天津农学院动物科学与动物医学学院实验室保存菌株。
1.2 主要试剂RPMI 1640基础培养基、0.25%胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司;青链霉素、二甲基亚砜(DMSO)和辣根过氧化物酶(HRP)-山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)均购自北京索莱宝生物公司;IL-8、TNF-α、LDH检测试剂盒均购自美国BD公司;RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自美国GeneCpoeia公司;BAY11-7082购自Sigma-Aldrich公司;β-catenin干扰RNA由上海生工生物工程有限公司合成;兔抗ZO-1多抗和兔抗occludin单抗均购自Abcam公司;兔抗NF-κB p65和磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)单抗均购自Cell Signaling公司。
1.3 细胞培养及处理将复苏后的IPEC-J2用含10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基培养,将生长至对数生长期的细胞接种于6孔细胞培养板中,待细胞融合度达到80%(细胞浓度为2×106个/孔),在培养基中加入浓度为1×103 CFU/mL的ETEC K88刺激细胞,同时以未经ETEC K88处理的细胞作为对照组,每组设3个重复。作用一定时间后,收集细胞培养上清液及细胞,于-80 ℃保存备用。
1.4 细胞培养上清液中IL-8、TNF-α含量和LDH活性的测定按照相应的酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒说明书检测细胞培养上清液中IL-8、TNF-α含量和LDH活性。
1.5 细胞中紧密连接蛋白表达量的测定将裂解后的细胞与上样缓冲液充分混匀后煮沸10 min,即为待测蛋白样品。待测蛋白样品经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,参考Li等[16]的方法进行Western blotting试验以鉴定目的蛋白的表达,其中一抗用兔抗ZO-1多克隆抗体、兔抗occludin单克隆抗体、兔抗NF-κB p65单克隆抗体和兔抗p-NF-κB p65克隆抗体,二抗选用HRP标记的山羊抗兔IgG。使用Gel-Pro analyzer软件分析各组条带浓度,并进行定量分析。
1.6 细胞中NF-κB/β-catenin信号通路相关基因mRNA表达量的测定按照Taco公司的核酸提取试剂盒说明书对细胞进行RNA的提取。根据反转录试剂盒说明书对RNA进行反转录。将RNA反转录产物cDNA作为模板进行定量分析。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因,参考李海花等[17]的方法检测目的基因的mRNA表达量。
参考文献设计ZO-1[18]、occludin[18]、TLR2[19]、TLR4[19]和GAPDH[19]的引物。在NCBI上搜索猪NF-κB、β-catenin、cyclin D1和c-Myc基因的全序列,使用Primer Premier 5软件设计特异性引物(表 1),引物序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
将IPEC-J2细胞接种至6孔细胞培养板中,待细胞贴壁后,用DMSO溶解BAY11-7082(NF-κB抑制剂),用终浓度为10 μmol/L[20]的NF-κB抑制剂处理细胞1 h,再用1×103 CFU/mL的ETEC K88分别刺激IPEC-J2细胞6和24 h。试验设空白对照组(Control组)、仅用ETEC K88感染细胞组(ETEC组)、用NF-κB抑制剂处理细胞后再添加ETEC K88感染细胞组(Inhibitor+ETEC组)、仅用10 μmol/L DMSO处理细胞组(DMSO组)、用10 μmol/L DMSO处理细胞后再用ETEC K88感染细胞组(DMSO+ETEC组),每组设3个重复。收集细胞培养上清液及细胞后按照1.6方法提取细胞RNA并反转录。按照1.6的方法分析细胞中ZO-1、occludin和NF-κB的mRNA表达量,按照1.4的方法检测细胞培养上清液中IL-8、TNF-α含量和LDH活性。
1.8 细胞转染猪β-catenin干扰序列:正向5′-GCCCAUGAUGUCUCUGUTT-3′和反向5′-AUCAGAGAUGAUGGCTT-3′序列委托生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成。将IPEC-J2细胞接种至6孔细胞培养板,待细胞贴壁后,用β-catenin的小干扰RNA(siRNA)处理细胞6 h,再用完全培养基培养18 h后用1×103 CFU/mL的ETEC K88分别刺激IPEC-J2细胞6和24 h。试验设空白对照组(Control组)、转染阴性对照组(NC组)、用siRNA处理细胞组(siRNA组)、用siRNA处理细胞后再用ETEC K88感染细胞组(siRNA+ETEC组)、用转染阴性对照处理细胞后再用ETEC K88感染细胞组(NC+ETEC组),每组设3个重复。收集细胞及其培养上清液,按照1.6的方法分析细胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的mRNA表达量,按照1.4的方法检测细胞培养上清液中LDH活性。
1.9 数据处理与分析使用Excel 2016软件对数据进行初步处理,采用SPSS 20.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用t检验进行组间差异性分析,以P<0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果与分析 2.1 ETEC K88对IPEC-J2细胞的影响由图 1可知,与对照组相比,ETEC组紧密连接蛋白ZO-1和occludin的蛋白表达量在6和24 h时均极显著降低(P<0.01)(图 1-A、图 1-B);ETEC组LDH活性在3 h时无显著变化(P>0.05),在6 h时显著升高(P<0.05),在12和24 h时极显著升高(P<0.01)(图 1-C)。上述结果表明,ETEC K88能引起紧密连接蛋白表达量降低、LDH活性升高,破坏细胞紧密连接的屏障作用引起IPEC-J2细胞损伤。
由图 2可知,与对照组相比,ETEC组TLR2的mRNA表达量在3 h时没有显著变化(P>0.05),在6和12 h时极显著上升(P<0.01),TLR4的mRNA表达量在3、6和12 h时均极显著上升(P<0.01)(图 2-A)。与对照组相比,ETEC组TNF-α含量在6、12和24 h时均极显著上升(P<0.01),且呈现时间依赖性(图 2-B);ETEC组IL-8含量在3 h时无显著变化(P>0.05),在6、12和24 h时均极显著升高(P<0.01)(图 2-C)。p65 NF-κB的磷酸化水平在1、3和6 h时均极显著上升(P<0.01)(图 2-D、图 2-E)。这说明ETEC K88处理增加了细胞TLR2和TLR4的mRNA表达量,从而激活NF-κB信号通路,刺激下游促炎性细胞因子的释放。
由图 3可知,与Control组相比,DMSO组NF-κB的mRNA表达量在6 h时无显著变化(P>0.05)(图 3-A),ZO-1(图 3-B)和occludin的mRNA表达量(图 3-C)及TNF-α(图 3-E)和IL-8的含量(图 3-F)在6和24 h时均无显著变化(P>0.05),LDH的活性在24 h时亦无显著变化(P>0.05)(图 3-D)。与Control组相比,ETEC组NF-κB的mRNA表达量在6 h时极显著降低(P<0.01),ZO-1的mRNA表达量及TNF-α、IL-8的含量和LDH的活性在各时间点均无显著变化(P>0.05)。与Control组相比,DMSO+ETEC组NF-κB的mRNA表达量及TNF-α、IL-8的含量和LDH的活性在各时间点均极显著升高(P<0.01),ZO-1和occludin的mRNA表达量在各时间点均极显著降低(P<0.01)。与DMSO+ETEC组相比,Inhibitor+ETEC组TNF-α、IL-8的含量和LDH的活性在各时间点均极显著降低(P<0.01),ZO-1、occludin和NF-κB的mRNA表达量在各时间点均极显著升高(P<0.01)。上述结果表明,抑制NF-κB信号通路可降低ETEC K88引起的IPEC-J2细胞损伤。
由图 4可知,与对照组相比,ETEC组cyclin D1的mRNA表达量在6和12 h时分别显著(P<0.05)和极显著降低(P<0.01)(图 4-A),β-catenin和c-Myc的mRNA表达量在6和24 h时均极显著降低(P<0.01)(图 4-B、图 4-C)。这说明ETEC K88通过抑制β-catenin信号通路的活化,降低β-catenin、cyclin D1和c-Myc的mRNA表达量,引起IPEC-J2细胞损伤。
由图 5可知,与Control组相比,NC组cyclin D1(图 5-A)、β-catenin(图 5-B)和c-Myc的mRNA表达量(图 5-C)在6和24 h时均无显著变化(P>0.05),LDH的活性在24 h时亦无显著变化(P>0.05)(图 5-D)。与Control组相比,siRNA组和siRNA+ETEC组cyclin D1、β-catenin和c-Myc的mRNA表达量在各时间点均极显著降低(P<0.01),LDH的活性在各时间点均极显著升高(P<0.01)。与NC+ETEC组相比,siRNA+ETEC组cyclin D1、β-catenin和c-Myc的mRNA表达量在各时间点均极显著降低(P<0.01),LDH的活性在各时间点均显著上升(P<0.05)。
肠道不仅是营养物质消化吸收的场所,而且是抵抗外部环境的重要防御线[21]。仔猪肠道完整性在抵抗细菌感染和为生物体提供营养方面发挥着关键作用,肠道通透性增加会导致许多器官的功能障碍[22]。肠道上皮细胞的完整性和通透性主要取决于细胞间的紧密连接作用。其中,ZO-1和occludin是构成紧密连接结构和功能的重要蛋白[23-24]。这2种重要蛋白表达的减少或结构损伤会破坏肠道的屏障功能,导致肠道的通透性增加[25]。致病性大肠杆菌由ETEC K88、肠致病性大肠杆菌(EPEC)和产志贺毒素大肠杆菌(ESIEC)等组成,其中ETEC K88是引起仔猪腹泻最主要的致病菌[26]。但是,ETEC K88引起IPEC-J2细胞炎症和对IPEC-J2细胞增殖影响的分子机制尚不清楚。本研究发现,ETEC K88感染导致IPEC-J2细胞中ZO-1和occludin的蛋白表达量降低,这与Yi等[27]的研究结果一致,表明ETEC K88能破坏肠道屏障功能,增加肠道的通透性。此外,Li等[16]证明经ETEC K88处理的断奶仔猪也得到了同样的结果。LDH是细胞内的酶,正常条件下细胞外的活性很低,但是当细胞受损时LDH就会从细胞内释放出来,因此可以用细胞培养上清液中LDH的活性来评价细胞的损伤情况[28]。Wu等[29]报道,LPS处理增加了IPEC-J2细胞中LDH的释放。本研究发现,ETEC K88感染导致IPEC-J2细胞培养上清液中LDH的活性增加且呈时间依赖性,表明培养时间越长细胞受损越严重。
NF-κB是一种多亚基核转录因子,可启动不同细胞因子和趋化因子的转录。在健康状态下,非活性形式的NF-κB复合物通过与其抑制物核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)非共价相互作用被隔离在细胞质中[30]。TLR是一种在多种组织和细胞中广泛表达的免疫受体[31]。TLR信号通路一旦被病原菌激活,IκBα就会解除对NF-κB的束缚,导致NF-κB的核易位[32],进入胞核内的NF-κB启动核内相关基因表达,产生相应的mRNA,合成细胞因子,如IL-8和TNF-α等,最终释放到胞外,引起炎症反应。有研究表明,ETEC的LPS可通过识别TLR4和引发TLR4来触发炎症反应,从而激活NF-κB信号途径,导致促炎性细胞因子分泌增加[33]。TLR/NF-κB信号通路在ETEC K88引起IPEC-J2细胞炎症反应中的作用尚不明确。为了探明NF-κB信号通路在ETEC K88感染IPEC-J2细胞产生炎症反应的作用,本试验在ETEC K88感染IPEC-J2细胞后,检测了细胞中NF-κB、TLR2和TLR4的mRNA表达量以及细胞培养上清液中TNF-α和IL-8含量的变化,发现ETEC K88可诱导IPEC-J2细胞大量表达NF-κB、TLR2和TLR4,且其mRNA表达量与细胞培养上清液中TNF-α和IL-8含量呈正相关。与此相似,Sargeant等[34]研究发现,ETEC感染显著增加了IPEC-J2细胞培养上清液中TNF-α、IL-8的含量以及细胞中TLR4的mRNA表达量。Lan等[35]的研究同样表明,LPS上调了IPEC-J2细胞中TLR4的mRNA表达量,降低了细胞培养上清液中TNF-α、IL-8的含量,同时紧密连接蛋白的表达量也有所下降。IL-8是一种白细胞趋化激活细胞因子,由各种类型的细胞在受到炎症刺激后产生,并在白细胞尤其是中性粒细胞中发挥多种功能[36]。因此,推测ETEC K88感染IPEC-J2细胞后细胞中白细胞增多,引起炎症反应,造成细胞损伤,可能与细胞因子TNF-α和IL-8的分泌增加有关。
当前,NF-κB信号通路的抑制对IPEC-J2细胞影响的相关研究较少,仅Shi等[37]用TLR4抑制剂预处理IIPEC-J2细胞后发现,LPS诱导的NF-κB信号通路激活受到了一定程度的抑制,促炎性细胞因子含量显著降低,表明LPS诱导IPEC-J2相比过度分泌促炎性细胞因子是TLR4/NF-κB信号通路的重要机制。此外,彭成璐等[38]的研究表明,添加NF-κB抑制剂后IPEC-J2细胞的存活率及贴壁细胞数量显著提高。本研究发现,利用NF-κB抑制剂处理IPEC-J2细胞后,细胞中NF-κB的mRNA表达量与对照组相比显著降低,说明NF-κB抑制剂抑制了细胞中NF-κB的活化;与DMSO+ETEC组相比,抑制剂+ETEC组细胞培养上清液中TNF-α、IL-8含量和LDH活性均极显著降低,ZO-1、occludin和NF-κB的mRNA表达量均极显著升高。本试验研究结果证明了TLR是通过激活NF-κB信号通路而诱导促炎性细胞因子的产生,进而引起机体炎症反应,破坏紧密连接结构,引起肠黏膜屏障通透性的改变,最终造成IPEC-J2细胞损伤。
Wnt信号通路是高度进化保守的,可调节细胞增殖和细胞形态等多个生物学过程[39]。β-catenin是经典Wnt/β-catenin信号通路中的中心介质,是将信号传递到细胞核,启动Wnt特异性基因转录并决定各种细胞和组织特异性的重要因子[13]。c-Myc和cyclin D1参与细胞和组织的广泛发育,是细胞增殖的关键下游效应因子[14]。有研究发现,cyclin D1和c-Myc是Wnt/β-catenin信号通路重要的调控因子,当这个信号通路被激活时,大量的β-catenin进入细胞质和细胞核中,促进下游cyclin D1和c-Myc基因的表达,从而促进细胞增殖[40]。据报道,β-catenin表达量增加对肠道细胞增殖有促进作用[41]。当前,有关β-catenin信号通路在ETEC K88引起的IPEC-J2细胞损伤中的作用的研究还未见报道。鉴于此,本试验检测了ETEC K88感染IPEC-J2细胞后β-catenin、cyclin D1和c-Myc基因的表达情况,发现ETEC K88感染IPEC-J2细胞6和24 h时β-catenin、cyclin D1和c-Myc的mRNA表达量均显著降低。本研究结果显示,用siRNA干扰β-catenin基因后再用ETEC K88处理细胞,细胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的mRNA表达量均极显著降低,细胞培养上清液中LDH的活性显著上升。Fan等[42]和Li等[43]研究均发现,激活Wnt/β-catenin信号通路能刺激IPEC-J2细胞增殖,抑制Wnt/β-catenin信号通路可抑制IPEC-J2细胞增殖。这些结果提示,ETEC K88通过抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,降低β-catenin、cyclin D1和c-Myc的mRNA表达量,引起IPEC-J2细胞损伤,Wnt/β-catenin信号通路在机体抗炎症反应中发挥着重要的调节作用。
4 结论综上所述,ETEC K88通过上调NF-κB信号通路引起炎症反应,下调β-catenin信号通路活化抑制细胞增殖,从而诱导IPEC-J2细胞损伤。
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