原位尼龙袋技术可测定饲料在反刍动物瘤胃中的降解速度和程度，是评价反刍动物饲料营养价值的一种常用方法，又称瘤胃尼龙袋法，属于半体内法。与体外法相比，该方法考虑了瘤胃内环境、食糜外流速率，使检测结果更接近体内法；与体内法相比，该方法所需样品少、操作简单、测定迅速、成本低、重复性好。自1979年∅rskov等[1]提出第一动力学模型，并拟合得到饲料蛋白质瘤胃动态降解参数来评价饲料瘤胃降解情况，极大地推动了瘤胃尼龙袋法由静态研究向动态研究方向的发展，也使得该方法近40年里在世界上被广泛应用。虽然瘤胃尼龙袋法已经被广泛应用，但是在不同实验室之间，甚至在同一实验室内部，瘤胃尼龙袋法测定结果存在差异，需要对此方法进行规范或标准化[2]。国际上有一些关于用瘤胃尼龙袋法测定瘤胃降解率的标准程序或者建议方案(∅rskov[3]、AFRC[4]、Madsen等[5]、Wilkerson等[6])，在国内，冯仰廉等[7]提出了在牛上用瘤胃尼龙袋法评定饲料蛋白质降解率的建议方案，并不完全适用于羊。本实验室曾对饲粮精粗比、投放方式、冲洗方法、饲喂频率、投袋时间、样品重等因素对瘤胃尼龙袋法测定饲料瘤胃降解特性的影响有过相关研究[8-9]。目前，国内在新尼龙袋使用之前有几种处理方法：不浸泡、用水浸泡、瘤胃中浸泡，其中在瘤胃中浸泡的较多。我们推测新尼龙袋在瘤胃中浸泡，瘤胃食糜可能会在尼龙袋的表面堆积，尼龙袋的孔径可能会堵塞，进而影响饲料的瘤胃降解率，即使经过洗涤程序也不能完全洗净。因此，本试验通过使用瘤胃预浸泡和未浸泡的新尼龙袋，分批测定玉米、豆粕、麦秸、黑麦干草4种常用饲料中干物质(DM)和粗蛋白质(CP)在瘤胃内的动态降解率，研究新尼龙袋使用前在瘤胃中浸泡与不浸泡是否会影响饲料的瘤胃降解特性，以期为羊上瘤胃尼龙袋法相关规程或标准的制定提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物选用3周岁、体重64.9~72.1 kg、体质接近、健康状况良好、进行正常驱虫和免疫并且装有永久性瘤胃瘘管的云南半细毛羊公羊为试验动物。
1.2 饲粮配制与饲养管理试验所用饲粮参考1.3倍NRC(2007)[10]维持营养需要配制，其组成及营养水平见表 1。饲粮精粗比为3 : 7，日采食量分别为：精料0.48 kg，豆糠0.72 kg，青贮1.14 kg(含水量65%)，每天07：00和17：00分2次等量饲喂，先喂青贮，采食完后再饲喂混合均匀的精料和豆糠，料水比为1 : 1。试验期间，单栏饲养，保证自由饮水。定期打扫圈舍和护理瘤胃瘘管。试验前空腹称重，每期试验包含预试期7 d，正试期3 d。每期试验结束后，试验羊休息2 d。试验于昆明易兴恒畜牧科技有限公司羊场进行。
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表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
采用单因素完全随机试验设计。选择300目(孔径48 μm)的新尼龙布，规格为6 cm×10 cm。试验组中新尼龙袋使用前在瘤胃中浸泡72 h，取出后冲洗、烘干恒重、编号备用。对照组中新尼龙袋用清水冲洗后使用(烘干至恒重、编号备用)。选取体重相近、健康状况良好的装有永久性瘤胃瘘管的云南半细毛羊公羊8只，随机分为2组(对照组和试验组)，每组4只，分批对玉米、豆粕、麦秸、黑麦干草4种饲料中DM和CP在瘤胃内的动态降解率进行测定。待测样品粉碎并通过8目筛，使用前65 ℃烘8 h，回潮24 h，称取精料4.0 g或者粗料2.5 g左右放入已知重量的尼龙袋中。每2个袋子作为平行，4只羊为4个重复。尼龙袋系在内径为3 mm、长25 cm的半软塑料管底部，橡皮筋固定，确保样品不丢失、尼龙袋不脱落。试验采用“同时投入，依次取出”的方法。于07：00饲喂前投入瘤胃腹囊，精料于2、4、8、16、24、36、48 h从瘤胃瘘管中取出，粗料于4、8、16、24、36、48、72 h从瘤胃瘘管中取出，并立即用儿童洗衣机(长虹XPB30-875S，3 kg)，标准状态下最高水位冲洗3次，每次5 min，换水3次。将洗净的尼龙袋放入65 ℃的烘箱中烘48 h至恒重，称取尼龙袋及残渣的重量，并将尼龙袋中瘤胃未降解的残渣收集于自封袋。待测样品的DM和CP含量见表 2。
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表 2 待测样品的DM和CP含量(干物质基础) Table 2 DM and CP contents of tested samples (DM basis) |
DM和CP含量按照《饲料分析及饲料质量检测技术》(第3版)[11]中方法进行测定。其中DM含量使用恒温鼓风干燥箱(上海精宏)测定，CP含量使用FOSS半自动凯式定氮仪(北京福斯)测定。
1.4.2 瘤胃降解动力学参数估计首先根据公式计算饲料中营养物质在不同时间点的实时瘤胃降解率：
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饲料中营养物质的实时瘤胃降解率符合指数曲线：
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式中：dp为t时刻某营养物质的实时瘤胃降解率(%)；a为该营养物质的快速降解部分(%)；b为该营养物质的慢速降解部分(%)；c为该营养物质慢速降解部分的降解速率(%/h)；t为饲料在瘤胃内停留的时间(h)。
利用各时间点的实时瘤胃降解率和时间，计算a、b和c值。
1.4.3 饲料中营养物质瘤胃有效降解率的计算采用下式计算饲料中营养物质的瘤胃有效降解率：
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式中：ED为某营养物质的有效降解率(%)；a为该营养物质的快速降解部分(%)；b为该营养物质的慢速降解部分(%)；c为该营养物质慢速降解部分的降解速率(%/h)；k为瘤胃外流速率(%/h)，本试验对干草类饲料的瘤胃外流速率取3.14%/h[12]，精料取5%/h[3]。
1.5 统计分析所有数据用Excel 2010初步整理后，用SAS 9.2统计软件中NLIN程序计算a、b、c值，降解率和降解参数采用SPSS 22.0统计分析，数据均采用平均值±标准差表示。P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 新尼龙袋使用前瘤胃浸泡处理对玉米DM和CP瘤胃降解特性的影响由表 3可知，试验组玉米DM 4、8和24 h的瘤胃降解率以及潜在降解部分显著低于对照组(P < 0.05)，其他各时间点的瘤胃降解率和降解参数与对照组均无显著差异(P>0.05)。试验组玉米CP仅36 h的瘤胃降解率和潜在降解部分显著低于对照组(P < 0.05)，DM和CP其他各时间点的瘤胃降解率和降解参数与对照组均无显著差异(P>0.05)。试验组玉米DM和CP的有效降解率低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。
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表 3 新尼龙袋使用前瘤胃浸泡处理对玉米DM和CP瘤胃降解特性的影响 Table 3 Effects of rumen soaking treatment on rumen degradation characteristics of DM and CP of corn before using new nylon bags |
由表 4可知，新尼龙袋使用前瘤胃浸泡处理与否对豆粕DM和CP的瘤胃降解特性无显著影响(P>0.05)。DM和CP的瘤胃有效降解率均以试验组低于对照组。
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表 4 新尼龙袋使用前瘤胃浸泡处理对豆粕DM和CP瘤胃降解特性的影响 Table 4 Effects of rumen soaking treatment on rumen degradation characteristics of DM and CP of soybean meal before using new nylon bags |
由表 5可知，试验组麦秸DM 16 h的瘤胃降解率、CP 8 h的瘤胃降解率均与对照组差异显著(P < 0.05)，DM和CP其他时间点的瘤胃降解率与对照组无显著差异(P>0.05)。试验组麦秸DM的所有瘤胃降解参数以及CP的慢速降解部分和慢速降解部分的降解速率与对照组无显著差异(P>0.05)，但麦秸CP的快速降解部分、潜在降解部分与对照组差异显著(P < 0.05)。试验组麦秸DM的有效降解率与对照组无显著差异(P>0.05)，但CP的有效降解率显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 5 新尼龙袋使用前瘤胃浸泡处理对麦秸DM和CP瘤胃降解特性的影响 Table 5 Effects of rumen soaking treatment on rumen degradation characteristics of DM and CP of wheat straw before using new nylon bags |
由表 6可知，试验组仅黑麦干草DM的慢速降解部分的降解速率、潜在降解部分与对照组差异显著(P < 0.05)，DM和CP其他各时间点的瘤胃降解率、降解参数和有效降解率均与对照组无显著差异(P>0.05)。
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表 6 新尼龙袋使用前瘤胃浸泡处理对黑麦干草DM和CP瘤胃降解特性的影响 Table 6 Effects of rumen soaking treatment on rumen degradation characteristics of DM and CP of rye hay before using new nylon bags |
本试验通过测定玉米、豆粕、麦秸、黑麦干草4种饲料使用瘤胃预浸泡和未浸泡的新尼龙袋在瘤胃中的降解特性发现，玉米、豆粕、黑麦干草DM和CP的有效降解率在试验组和对照组之间均没有出现显著差异，试验组麦秸DM的有效降解率与对照组无显著差异，但CP的有效降解率显著高于对照组。另外，对于玉米、豆粕2种精料，试验组DM和CP的有效降解率均低于对照组；对于麦秸、黑麦干草2种粗饲料，试验组DM的有效降解率低于对照组，CP的有效降解率高于对照组。这说明新尼龙袋使用前瘤胃浸泡与否对精、粗饲料的影响不同。
在瘤胃尼龙袋法程序中，新尼龙袋使用前有不同的处理方式，分别为用清水冲洗、用清水浸泡、在瘤胃中浸泡。查阅相关文献发现，∅rskov[3]、Madsen等[5]、高新梅等[13]、李洪涛[14]、李海文等[15]在文章中没有提到试验之前尼龙袋是怎么处理的；Wilkerson等[6]、冯仰廉[16]、孟春花等[17]、靳玲品等[18]、朱亚骏等[19]、汪水平等[20]是在新尼龙袋使用前在瘤胃中浸泡72 h，取出后洗净、烘干、编号备用；王文奇等[21]、吴仙等[22]是在新尼龙袋使用前投入瘤胃中浸泡24 h，再取出洗净、烘干、检查有无破损、编号备用；李志威等[23]则是在新尼龙袋使用前用自来水浸泡冲洗、烘干恒重、编号备用。可以看出，关于新尼龙袋使用之前的预处理存在差异。新尼龙袋使用之前在瘤胃中预浸泡理论上可以增强微生物对待测饲料的及时接触，尤其是对在瘤胃中培养时间短的样品来说[24]；但是，新尼龙袋使用前在瘤胃中浸泡之后，即使进行了仔细的洗涤程序，一些瘤胃食糜和残渣仍然会吸附在尼龙袋表面，堵塞尼龙袋的孔径，通过影响瘤胃微生物和待测底物的充分接触，进而影响饲料瘤胃降解率。这可能是试验组玉米、豆粕DM和CP以及麦秸和黑麦干草DM的有效降解率低于对照组的原因；至于试验组麦秸CP的有效降解率显著高于对照组，可能与粗饲料本身DM的降解率低及饲料性质有关，具体原因有待进一步研究。
另外，Weakley[25]认为，瘤胃尼龙袋中的样品在瘤胃发酵过程中容易发生粘连现象，造成袋子孔隙的堵塞。我们推测重复利用会导致尼龙袋表面附着物的大量积累，孔径堵塞增多并导致孔径变小，影响饲料的瘤胃降解率。如果尼龙袋打算后续多次使用，那么新尼龙袋在第1次使用前浸泡，可以减小后续利用带来的差异；如果新尼龙袋仅打算使用1次，那么使用前无需在瘤胃中浸泡处理。
4 结论利用瘤胃尼龙袋法测定羊常用饲料DM和CP的瘤胃降解特性时，新尼龙袋瘤胃预浸泡处理仅对麦秸CP的有效降解率产生显著差异。由此建议，若新尼龙袋只使用1次，可以不在瘤胃中浸泡。
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