2. 家蚕基因组生物学国家重点实验室, 重庆 400715;
3. 重庆市水产技术推广总站, 重庆 401121
2. State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400715, China;
3. Chongqing Municipal Aquatic Technology Extension Station, Chongqing 401121, China
桑叶提取物(mulberry leaf extract,MLE)因含有大量的多糖类、黄酮类、生物碱类、植物甾醇类等活性物质而备受关注[1],但其作为饲料添加剂在水产养殖上的应用较少。本课题组研究发现,饲料中添加7.3~7.5 g/kg的MLE可显著增加大鲵(Andrias davidianus)摄食量,并提高其肠胃消化吸收、肝脏抗氧化及机体免疫能力[2]。1-脱氧野尻霉素(1-deoxynojirimycin,DNJ)是一种多羟基哌啶生物碱,因具有降血糖、降血脂、抗病毒、抗肿瘤及抗氧化等生物活性而被认为有较高的食用价值和药用价值[3-4]。尽管这些特性使得DNJ在食品和医药领域广泛应用,但关于NDJ作为功能性饲料添加剂在水产动物中的应用研究尚未见报道。
大鲵为我国特有且体型最大的珍稀两栖动物,原生态、仿生态和工厂化养殖3种模式的大鲵人工养殖技术已经基本成熟且已形成一定规模。目前,对大鲵人工配合饲料的研究报道很少,且停留在基础性的营养需求探索及动物饵料之间或单纯的人工饲料与天然饵料之间的对比阶段[5-7]。人工养殖过程中还是以鲜活鱼虾为主要饲料,人工规模化养殖难以推行。本课题组前期已成功研发能满足大鲵生长过程中营养供给的人工配合饲料,在重庆、四川、贵州、广西等多地的养殖基地通过试验证明其均保持较低的饲料系数(feed conversion ratio,FCR) [2]。另外,因MLE中含有DNJ,但MLE和DNJ分别添加在大鲵饲料中的效果差异不得而知。鉴于此,本试验旨在研究MLE和DNJ对大鲵生长性能、肝脏功能及免疫能力的影响,为生产安全、绿色、优质的大鲵人工配合饲料添加剂的选择及应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所选用的大鲵购于陕西省汉中市绿源大鲵养殖场,MLE由西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室提供,DNJ(高相液相色谱分析标准品,其纯度≥98%)购于北京世纪奥科生物技术有限公司,饲料所需原料均购于重庆市大发饲料有限公司。
以鱼粉、鸡肉粉等为蛋白质源,以大豆油为脂肪源,配制大鲵基础饲料;在基础饲料中分别添加7.5 g/kg的MLE和0.04 g/kg的DNJ(MLE添加量参照本课题组前期试验[2],该添加量下饲料中DNJ实测含量为0.04 g/kg),经膨润土调平,配制成3种等氮等脂的试验饲料。试验饲料组成及营养水平见表 1。饲料原料均过40目筛,用混合制粒机(四川棉丰农业机械制造厂9FZ-35C型)制成直径3 mm、长6~8 mm的软颗粒饲料,冷却后低温晾干,再用双层塑料袋包装并封口,置于-20 ℃冰柜中保存备用。
选择初始均重为(47.81±0.23) g的大鲵72尾,随机分为3组,每组3个重复,每个重复8尾。对照组饲喂基础饲料,试验组分别饲喂基础饲料中添加7.5 g/kg MLE(MLE组)和0.04 g/kg DNJ(DNJ组)的试验饲料。试验期90 d。
试验大鲵购回后静养2 d,用1%氯化钠溶液浸泡消毒5 min,饥饿暂养5 d再以大鲵基础饲料驯食15 d,待大鲵体质恢复后开展正式试验。试验大鲵放养在室内蓝色塑料方形箱(70.5 cm×45.5 cm×17.5 cm,水深5 cm)中,水源为经12 h曝气的自来水。因大鲵消化食物时间较长,故连续投喂2 d间歇1 d,每天1次(17:00),饱食投喂,投喂当天(20:00)及时用网孔密集的网兜收集残余饵料并计重。每天早晚各换水1次。饲养期间避光,水温19~22 ℃,溶解氧含量>6.0 mg/L,氨氮含量<0.10 mg/L,亚硝酸盐含量<0.10 mg/L,pH在6.5~7.5。
1.3 样品采集与制备养殖试验结束后,试验大鲵停喂3 d,用MS-222(0.1 g/L)麻醉后,每组每个重复的8尾大鲵全用于体质量、体长的测定。其中5尾大鲵在冰盘中解剖,用1 mL无菌注射器吸取1%肝素钠进行腹部动脉采血,4 ℃静置3 h后,4 000 r/min离心提取血浆,立即放入液氮速冻,后置于-80 ℃冰箱中,用于血浆生化指标测定;采血后取出内脏并称重,分离出肝脏,用磷酸盐缓冲液(PBS)小心冲洗,并将肝脏迅速液氮速冻,后置于-80 ℃冰箱中,用于肝脏营养成分及相关酶活性测定;将背部肌肉皮肤去除后取出肌肉,置于-80 ℃冰箱中,用于肌肉营养成分测定。
1.4 指标测定生长性能指标测定:养殖试验结束后,停食3 d,准确称量各组大鲵体重、内脏重和残饵重,计算其增重率(weight gain rate,WGR)、摄食量(feed intake,FI)、特定生长率(specific growth rate,SGR)、FCR和存活率(survival rate,SR),计算公式如下:
式中:W0为起始均重(g);Wt为终末均重(g);d为养殖试验天数(d);F0为每次投喂量(g);Fr为每次残饵量(g);F为摄食量(g);N0为初始尾数;Nt为终末尾数。
试验饲料及组织常规营养成分的测定:水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量分别采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2006)、凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)、索氏抽提法(GB/T 6433—1994)、550 ℃灼烧法(GB/T 6438—1992)进行测定。肝脏粗脂肪含量采用氯仿-甲醇法测定。
肝脏抗氧化指标的测定:肝脏总抗氧化能力(T-AOC)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性和丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。
肝脏功能和血浆免疫指标的测定:血浆肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)活性和免疫球蛋白M(IgM)、活性氧(ROS)含量均采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。
1.5 数据处理试验结果用SPSS 22.0对数据进行方差齐性检验和单因素方差分析(one-way ANOVA),并用Duncan氏多重比较法分析组间差异显著性,P < 0.05表示差异显著。数据用平均值±标准差(mean±SD)表示。
2 结果 2.1 MLE和DNJ对大鲵生长性能及饲料利用的影响由表 2可知,MLE组和DNJ组的终末均重、WGR、SGR和FI均显著高于对照组(P < 0.05),而MLE组和DNJ组之间无显著差异(P>0.05)。MLE组和DNJ组的WGR较对照组分别升高了38.88%和45.55%。MLE组和DNJ组的FCR均显著低于对照组(P < 0.05),较对照组分别降低了17.39%和21.74%。各组大鲵存活率均为100%。
由表 3可知,MLE组和DNJ组的肌肉和肝脏粗脂肪含量均显著低于对照组(P < 0.05)。MLE组和DNJ组的肌肉粗蛋白质含量显著高于对照组(P < 0.05),较对照组分别升高了13.13%和8.31%。MLE组的肌肉水分含量显著低于对照组(P < 0.05),MLE组和DNJ组的肝脏水分含量显著低于对照组(P < 0.05)。
由图 1可知,MLE组和DNJ组的血浆CPT-1、ACC活性及CPT-1/ACC均显著高于对照组(P < 0.05),且DNJ组的血浆CPT-1、ACC活性及CPT-1/ACC显著高于MLE组(P < 0.05)。
由表 4可知,MLE组和DNJ组的肝脏T-AOC、T-SOD活性显著高于对照组(P < 0.05),肝脏MDA含量显著低于对照组(P < 0.05)。MLE组的肝脏T-AOC、T-SOD活性显著高于DNJ组(P < 0.05),肝脏MDA含量显著低于DNJ组(P < 0.05)。
由图 2可知,MLE组和DNJ组的血浆AST和ALT活性显著低于对照组(P < 0.05),MLE组的血浆AST和ALT活性显著低于DNJ组(P < 0.05)。
由图 3可知,MLE组和DNJ组的血浆IgM含量显著高于对照组(P < 0.05),MLE组的血浆IgM含量显著高于DNJ组(P < 0.05)。MLE组和DNJ组的血浆ROS含量显著低于对照组(P < 0.05),DNJ组的血浆ROS含量显著低于MLE组(P < 0.05)。
MLE中的某些活性物质已应用于多种动物饲料并在改善动物生长性能方面有良好的饲用价值。在断奶犊牛[8]、绵羊[9]上的研究证实,适宜桑叶黄酮的添加有利于改善胃肠道结构、增强相关消化酶活性,从而提升了动物对营养物质的消化吸收能力。本研究结果显示,饲料中添加MLE和DNJ能促进大鲵生长,与对照组相比,MLE组和DNJ组的FCR显著降低,WGR显著提高。这说明大鲵的生长性能得到改善,饲料中添加MLE和DNJ具有同等效应。MLE中的多种单体活性物质可通过不同方式促进不同种类动物的生长,因而MLE具有多种单体物质联合产生协同效应的优势。Li等[10]发现DNJ可特异性调节高脂饮食小鼠肠道菌群,更好地参与机体能量代谢和营养物质吸收过程,进而影响机体生长状况。本研究结果也显示,MLE中的DNJ对大鲵的生长有同样的促进效果。关于DNJ促进机体生长发育机制有待进一步研究。与以上结果不同的是,在育肥猪上的研究显示,桑叶粉的添加会降低其生长性能[11]。一方面,养殖对象的不同、桑叶的不同加工处理方式或添加量可能对生长性能造成不同效果;另一方面,高剂量的添加也增加了其中抗营养物质的含量,从而阻止机体对营养物质的吸收。作为植物性添加剂,MLE和DNJ的添加反而增加了大鲵的FI,这与在犊牛上的研究结果[8]一致;这可能与MLE特征性的气味具有一定诱食性有关。本研究团队在前期的研究中已证实,适量添加MLE可提高大鲵消化吸收酶活性并改善肠道发育状况,从而促进其对营养物质的消化吸收和利用[2]。因而,MLE和DNJ促进大鲵生长的原因可能是大鲵摄食量、消化吸收能力、生长性能三者之间相互作用。
3.2 MLE和DNJ对大鲵体组成的影响本研究表明,MLE在增加肌肉粗蛋白质含量方面的效果显著优于DNJ。这可能是由于MLE中含有甾醇,它可在机体内形成植物甾醇核糖核蛋白复合体,该复合体具有促进动物蛋白质合成的功能[12]。桑叶中氨基酸含量丰富,尤其是必需氨基酸,因此可作为饲料强化剂,与其他氨基酸互补,有利于蛋白质在体内的合成[13]。同时,两者的添加都能降低肌肉和肝脏的粗脂肪含量。王玲等[14]研究发现,DNJ对控制饮食的肥胖大鼠重量的主要调控途径是通过调节脂肪细胞因子的分泌来控制脂肪酸代谢过程中的相关酶活性,进而减少脂肪积累。大鲵相比其他鱼类其水分含量高,粗脂肪含量低。本研究中,饲料中添加MLE和DNJ均能降低大鲵肌肉水分和粗脂肪含量,因而机体粗蛋白质占比有所提升。这也为生产优质动物产品以及拓宽饲料桑叶或MLE新用途提供了新思路。
3.3 MLE和DNJ对大鲵肝脏功能的影响大鲵作为两栖类动物已进化出独立的肝脏且在机体中占有重要地位,肝脏承担体内代谢、排泄和解毒等重要生理功能,最能反映机体的营养、生理和病理状态[15]。
3.3.1 MLE和DNJ对大鲵肝脏脂质代谢指标的影响众所周知,桑叶不仅在改善动物生长性能方面效果良好,且因其具降血糖、降血脂[16]功能而引起医药、畜禽饲料行业的广泛关注。本试验结果表明,饲料中添加MLE和DNJ均能显著提高血浆中作为β-氧化的关键限速酶CPT-1和脂肪酸从头合成途径关键限速酶ACC的活性。这表明两者均可通过影响与肝脏脂质代谢相关的酶活性而达到调节脂质代谢的目的。在小鼠上的研究认为MLE的降血脂作用归因于抑制脂质合成和促进脂质降解[17]。此外,DNJ可刺激腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)mRNA的表达,一定程度上激活动态平衡中脂肪酸β-氧化系统AMPK→ACC→CPT-1通路,从而抑制脂质在肝脏的聚积及肌内脂肪沉积[18]。与此同时,MLE组和DNJ组的CPT-1/ACC显著高于对照组,则进一步说明大鲵整体脂肪酸分解代谢能力强于合成代谢能力,这也与肝脏中粗脂肪的含量在添加MLE和DNJ后表现为降低相符合,更进一步证实了MLE和DNJ可减少脂肪在肝脏的储存,因而对肝脏功能的健康有积极影响。
3.3.2 MLE和DNJ对大鲵肝脏抗氧化指标的影响T-AOC和T-SOD活性大小代表生物体清除体自内由基能力,是抗氧化系统功能的重要指标,在免疫系统中也有极为重要的作用[19]。本研究中,饲料中添加MLE和DNJ提高了肝脏T-AOC和T-SOD活性,且MLE的添加效果更优。MLE可增强抗氧化指标的活性与MLE应用于吉富罗非鱼上的研究结果[20]一致。这可能与MLE中含有丰富的黄酮类化合物槲皮素、芸香苷、生物碱化合物DNJ及其衍生物[21]以及多糖、多酚等[22-23]具有清除自由基、抗氧化功能的多种活性物质共同作用的结果。Horng等[24]证实MLE具有保护小鼠肝脏免受对乙酰氨基酚(APAP)诱导的炎症作用,其保护机制可能与MLE调节抗氧化状态、降低氧化应激有关。目前,NDJ作为单体应用于动物人工配合饲料中的研究仍是空白。在本研究中,DNJ应用于大鲵基础饲料中在抗氧化能力方面的效果不及MLE。脂质过氧化可诱导机体产生炎症反应,MDA正是脂质过氧化物稳定的终产物,可反映出细胞受损伤的程度[25]。本试验中,饲料中添加MLE和DNJ后肝脏MDA含量均显著降低,可进一步证实MLE和DNJ的摄取和补充通过提升肝脏T-AOC和T-SOD活性来增加大鲵抗氧化能力,减少氧化应激,从而清除自由基和ROS,降低MDA含量,减缓肝脏发生脂质过氧化的程度并提高非特异性免疫,最终达到保证肝脏行使其正常功能的目的。
3.3.3 MLE和DNJ对大鲵血浆转氨酶活性的影响AST和ALT主要存在于肝脏细胞中,机体早期肝脏受损或疾病常伴有血液中AST和ALT活性的升高。本研究结果表明,饲料中添加MLE和DNJ显著降低了血浆AST和ALT活性,且MLE组的血浆AST和ALT活性显著低于DNJ组。这表明MLE和DNJ的添加对大鲵肝功能具有改善作用,因此,因肝损伤进入血液中的AST和ALT活性有所降低。这也进一步证实MLE和DNJ可以有效保护脂肪对肝细胞的伤害,进而改善肝脏健康,且MLE的作用效果优于DNJ。
3.4 MLE和DNJ对大鲵免疫能力的影响研究表明,众多植物提取物中的活性物质因对免疫系统有一定的影响而被用作免疫应答调节剂[26-27]。本研究表明,饲料中添加MLE和DNJ显著提高了血浆IgM含量,但DNJ提升效果不及MLE。目前,关于MLE对动物免疫能力的改善多集中在桑叶多糖的研究上,IgM作为血液循环中的主要抗体之一,参与中和抗原和促进抗原吞噬等重要的体液免疫反应[28],陈晓兰等[29]研究表明,桑叶粗多糖和桑叶水提物在合适浓度下能促进小鼠脾脏B、T淋巴细胞的增殖。Zhao等[30]将桑叶多糖与桑叶黄酮共同应用于断奶仔猪饲粮中可增强免疫能力,降低腹泻发生率。ROS是细胞信号传导、基因表达、细胞增殖调控的胞内信使,其含量异常将导致氧化应激和抗氧化防御间平衡失调,进一步破坏机体免疫能力甚至组织损伤[31]。本试验中,饲料中添加MLE和DNJ显著降低了血浆ROS含量,这说明ROS的产生受到抑制或已产生的ROS得到清除。这些研究结果表明,MLE具有一定的免疫调节作用。本研究认为MLE中的多糖或与MLE中的多酚、DNJ等活性物质共同作用改善大鲵的免疫能力,而DNJ作为单体作用效果不如MLE。两者均具有一定的清除ROS效果,DNJ对ROS清除效果更佳,其具体机理有待进一步研究。
4 结论① 饲料中添加MLE和DNJ均能改善大鲵的生长性能、肝脏功能,提高免疫能力。
② 在改善体组成、肝脏功能方面MLE作用效果优于DNJ,而DNJ对ROS清除效果更佳;MLE的整体添加效果优于DNJ。
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