2. 国家胶类中药工程技术研究中心, 东阿阿胶股份有限公司, 东阿 252201
2. National Engineering Research Center for Gelatin-Based Traditional Chinese Medicine, Dong-E-E-Jiao Co., Ltd., Dong'e 252201, China
我国的毛驴养殖历史悠久，存栏量曾长期居于世界首位[1]。但随着农业机械化的程度不断提高，毛驴役用价值的丧失导致其存栏量不断下降，据国家统计局《2018年中国统计年鉴》显示，从1998年到2016年，我国毛驴存栏量从955.8万头持续下降至259.3万头，以年均6.5%的速度在不断萎缩。近年来，随着全民保健意识的增强，毛驴的皮、肉和奶的商用化价值持续走高，供需矛盾进一步加剧[2]。对比传统的养殖，规模化养殖可更好地满足原料品质的均一性，但同时也加大毛驴感染性或传染性疾病的发生风险[3]。一个基于49个规模化驴场腹泻病的调查显示，驴驹腹泻的发病率约为23.1%[4]，而幼龄驴驹免疫系统发育不完善，常规的抗生素治疗对驴驹腹泻治疗效果甚微[5]。目前，微生态制剂作为一种潜在的抗生素替代品受到愈来愈多的饲料企业和养殖户的关注，微生态制剂不仅可以提高动物的生长性能，且对维持动物肠道菌群平衡效果良好[6-7]。目前研究以猪、鸡等单胃动物或牛、羊等反刍动物居多[8-10]，但在毛驴上的相关研究较少。我国已将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)纳入《中国饲料添加剂品种目录(2013)》中，地衣芽孢杆菌可以分泌多种淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，这些酶可将宿主自身难以消化的饲料成分分解，再次被宿主吸收利用，提高动物饲粮利用率[11-12]。地衣芽孢杆菌在猪、家禽及水产动物的养殖上已广泛应用。李宁等[13]研究发现，饲粮中添加0.15%的地衣芽孢杆菌可提高仔猪的抗氧化能力、免疫力和生长性能。袁慧坤[14]在北京鸭上同样发现饲粮添加1×106 CFU/g地衣芽孢杆菌可有效改善北京鸭的生长性能和免疫指标。杨帆[15]和李晓斌[16]研究发现，饲粮中添加1×109 CFU/g枯草芽孢杆菌可显著提高马驹的体增重。因此，本试验旨在研究饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴生长性能、血清生化指标及直肠菌群多样性的影响，以期为地衣芽孢杆菌在驴驹生产中的应用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验菌种试验用地衣芽孢杆菌是本实验室前期从健康成年驴盲肠中分离鉴定保藏的。经冻干后，复苏并使用MRS培养基计数，按1×109 CFU/g添加量(参考杨帆[15]和李晓斌[16]在马驹上的试验结果)逐级稀释到精料补充料中。
1.2 试验设计及饲养管理选取4~7月龄体况良好的雌性驴驹10头，平均体重(111.80±15.69) kg，随机分为2组，每组5个重复，每个重复1头。对照组饲喂基础饲粮，试验组在基础饲粮中添加1×109 CFU/g地衣芽孢杆菌。预试期7 d，正试期60 d。
本研究动物饲养试验于2018年10月10日至2018年12月10日山东省聊城市东阿县黑毛驴繁育中心进行。每头每天10：00和16：30各饲喂1次，先精后粗，精料补充料添加量固定为初始体重的1.3%，粗饲料自由采食，自由饮水。精料补充料组成及营养水平见表 1。粗饲料为豆秸，其营养水平为：粗蛋白质(CP)8.75%，粗脂肪(EE)1.17%，有机物(OM)90.03%，中性洗涤纤维(NDF)72.75%，酸性洗涤纤维(ADF)54.63%，钙(Ca)1.26%，磷(P)0.17%，消化能7.61 MJ/kg[消化能计算参照NRC(2007)[17]马营养需要]。
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表 1 精料补充料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate supplement (air-dry basis) |
试验第45天，晨饲前麻醉动物，颈静脉采血10 mL，3 500×g、4 ℃离心10 min，收集血清，-20 ℃保存，用于后续血清相关指标的测定。试验第50天，通过直肠采集内容物5 g用于微生物总DNA的提取。试验样品的检测在吉林省长春市中国农业科学院特产研究所进行
1.4 指标的测定及方法 1.4.1 生长性能的测定试验第1、15、30、45、60天晨饲前称量动物体重，计算平均日增重(average daily gain，ADG)和总增重(total weight gain，TWG)。每隔3 d对每头驴精饲料补充料和粗饲料的投食量和剩食量进行记录，用于精确计算试验期间每头驴的干物质采食量(dry matter intake，DMI)和料重比(feed/gain，F/G)。
1.4.2 饲粮营养成分测定饲粮的干物质(DM)含量采用GB/T 6435—2014方法测定；粗蛋白质含量参照GB/T 6432—2018采用凯氏定氮法测定；粗脂肪含量参照GB/T 6433—2006采用索氏抽提法测定；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量参照GB/T 20806—2006采用范氏(Van Soest)纤维分析法测定；钙含量参照GB/T 6436—2018采用乙二胺四乙酸(EDTA)络合滴定法测定；磷含量参照GB/T 6437—2018采用钒钼酸铵比色法测定。
1.4.3 血清生化指标测定血清甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、葡萄糖(glucose，GLU)、尿素(urea，UREA)、总蛋白(total proteins，TP)、白蛋白(albumin，ALB)含量及丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspertate aminotransferase，AST)、乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性均使用Beckman AU 480全自动生化分析仪测定，试剂盒采购于中生北控生物科技有限公司。球蛋白(globulin，GLOB)含量采用TP与ALB含量的差值表示。血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)和免疫球蛋白M(immunoglobulin M，IgM)含量均使用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定。
1.4.4 微生物总DNA的提取直肠内容物使用Fast DNA spin kit for feces试剂盒[安诺伦(北京)生物科技有限公司]进行微生物总DNA提取。提取后的DNA送到北京诺禾致源公司使用MiSeq测序平台对细菌基因组的16S rRNA V3~V4区进行测序。
1.5 数据分析试验数据使用Excel 2013整理后采用SPSS 22.0软件中独立样本t检验(independent-samples t test)进行均值的差异性检验，以P＜0.05为差异显著。微生物测序结果通过Flash v1.3.0软件融合双末端序列。采用Prinseq-lite 0.19.5软件截掉质量低的数据，按照97%相似性将序列聚类操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)。OTU聚类采用的软件为Uclust v1.1.579，采用RDP classifier软件进行物种分类。使用QIIME 1.9.0软件对菌群进行α多样性分析、主坐标分析(PCoA)和Adonis分析[18]。
2 结果与分析 2.1 饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴生长性能影响如表 2所示，对照组和试验组第15、30、45和60天体重均无显著差异(P＞0.05)，对照组和试验组的总增重、平均日增重、干物质采食量和料重比也无显著差异(P＞0.05)。
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表 2 饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴生长性能影响 Table 2 Effects of dietary Bacillus licheniformis on growth performance of black donkeys |
如表 3所示，对照组的血清ALB含量显著高于试验组(P＜0.05)，对照组和试验组的血清TP和GLOB含量无显著差异(P＞0.05)。对照组和试验组的肝功相关指标(血清ALP、ALT、AST、LDH活性)和脂肪代谢相关指标(血清TG、HDL-C、LDL-C、TC含量)均无显著差异(P＞0.05)。试验组的血清GLU和UREA含量较对照组有所降低，但无显著差异(P＞0.05)。试验组的血清IgG含量显著高于对照组(P＜0.05)，对照组和试验组的血清IgA和IgM含量无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴血清生化指标影响 Table 3 Effects of dietary Bacillus licheniformis on serum biochemical indexes of black donkeys |
如表 4所示，对照组和试验组的覆盖度指数均高于0.995，说明测序深度足够，结果可呈现99.5%以上的菌群组成。试验组的香农(Shannon)和辛普森(Simpson)指数均高于对照组，但差异不显著(P＞0.05)。对照组的Chao1和ACE指数均高于试验组，但差异不显著(P＞0.05)。这表明饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴直肠内容物菌群α多样性无显著影响。
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表 4 饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴直肠内容物菌群α多样性的影响 Table 4 Effects of dietary Bacillus licheniformis on bacteria α diversity in rectum contents of black donkeys |
饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴直肠微生物组成门水平相对丰度的影响如图 1所示，2组中相对丰度较高的前3种细菌门分别为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门。其中，试验组的拟杆菌门和螺旋体门相对丰度明显高于对照组，而对照组中2个重复的变形菌门相对丰度高达36.46%~48.45%，这表明饲粮添加地衣芽孢杆菌会提高黑毛驴的拟杆菌门和螺旋体门相对丰度，可能会抑制变形菌门相对丰度。
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Ⅰ1、Ⅰ2、Ⅰ3、Ⅰ4、Ⅰ5为对照组的5个重复，Ⅱ1、Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅱ4、Ⅱ5为试验组的5个重复。图 2同。 Ⅰ1, Ⅰ2, Ⅰ3, Ⅰ4 and Ⅰ5 were 5 replicates in the control group, Ⅱ1, Ⅱ2, Ⅱ3, Ⅱ4 and Ⅱ5 were 5 replicates in the experimental group. The same as Fig. 2. 图 1 门水平相对丰度 Fig. 1 Relative abundance at phylum level |
饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴直肠微生物组成属水平相对丰度的影响如图 2所示，对照组中的变形菌门相对丰度较高的2个重复，其不动杆菌属相对丰度亦较高，达34.35%~48.12%。2组中其他相对丰度较高的细菌分别为土壤芽孢杆菌属、链球菌属、未鉴定梭菌目、未鉴定瘤胃球菌科。
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图 2 属水平相对丰度 Fig. 2 Relative abundance at genus level |
如图 3所示，PCoA显示，2个坐标轴相加已解释77.75%的变量组成。结合图中所示和Adonis分析结果(P=0.078)，均表明饲粮添加地衣芽孢杆菌对黑毛驴直肠内容物细菌组成无显著影响。
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图 3 主坐标分析图 Fig. 3 PCoA figure |
本试验中，饲粮添加1×109 CFU/g地衣芽孢杆菌对黑毛驴生长性能并无显著影响，这与杨帆[15]、李晓斌[16]在马驹上的研究结果并不一致，原因可能是本试验养殖试验处于冬季，黑毛驴饲养于室外，温度较低。研究发现，冷应激会导致动物营养物质消化率的降低[19]，且低温环境下动物采食的饲粮优先用于产热维持体温，这对动物的生长性能影响较大[20]。综合前人和本试验研究结果，低温环境饲养下的黑毛驴，益生菌的添加水平需要增高，才可获得与常温条件相似的促生长性能，但这一推测仍需进一步的试验验证。
本试验中，试验组的血清IgG含量显著高于对照组，这与郭军蕊[21]、Elzey等[22]在其他动物上的试验结果一致。IgG约占血清免疫球蛋白总含量的75%，是机体最主要的抗感染球蛋白，其含量可以表示免疫功能的强弱[14]，这一指标的升高可为地衣芽孢杆菌对驴驹腹泻的预防起到重要作用。
已有大量研究证明添加益生菌可以改善动物肠道菌群组成及促进肠道健康[23-25]。本试验中，黑毛驴直肠内容物门水平下优势细菌组成与Liu等[26]在驴粪便中的研究结果类似。但Liu等[26]研究发现，细菌属水平上优势微生物分别是艾克曼菌属、Sporobacter和密螺旋体属，这与本试验结果并不一致。原因可能是Liu等[26]试验采集的是排出的粪便，与本试验直肠采集的内容物环境有一定差异，此外，动物的饲粮和养殖环境均会对直肠微生物组成造成影响[27]。本试验中，优势的微生物菌属有土壤芽孢杆菌和链球菌属，这些细菌都被大量的发现于土壤与环境中[28]，直肠位于消化道末端，这为外界细菌在直肠内的定植带来了机会[29]。对照组2个重复的直肠内不动杆菌属相对丰度较高，且不动杆菌属可引起动物胃肠炎的发生[30]，试验组并未发现这样的个体，这也从侧面证明了地衣芽孢杆菌可在一定程度上维持肠道稳态。对照组动物直肠微生物组成中，链球菌属和不动杆菌属相对丰度较高，这类条件致病菌的存在提示我们，驴驹的规模化饲养所面临的腹泻疾病与动物肠道健康息息相关。饲粮添加地衣芽孢杆菌提高了拟杆菌门相对丰度，拟杆菌门的细菌主要对类固醇、胆汁酸及多糖起代谢作用，从而促进多糖的吸收以及蛋白质的合成[31]。饲粮添加地衣芽孢杆菌并未显著改变黑毛驴直肠微生物组成，Zhou等[32]和Wang等[33]在獭兔上研究均发现，益生菌的添加对其小肠菌群结构组成的影响效果优于大肠。这可能与单胃草食类动物发达的盲肠和结肠结构与丰富的微生物组成有关。
4 结论饲粮添加地衣芽孢杆菌并未显著提高黑毛驴的生长性能和显著影响黑毛驴直肠细菌组成，但提高了黑毛驴血清IgG的含量，同时降低其直肠内容物中不动杆菌属相对丰度，对动物的肠道健康有积极作用。
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