硒(Se)作为动物生命必需的一种微量元素，有着较窄的安全阈值[1-4]，同时其生物活性依赖于其在不同组织的存在形态[5]，因此关于硒在不同基质中的分析方法研究一直引起广泛的关注[6]。此外，亚硒酸盐和有机硒化合物还常作为一种饲料添加剂加入饲粮中[7]。因此，建立可靠、简便的硒含量测定方法是非常有必要的。目前测定硒含量的方法有很多，包括原子吸收光谱(AAS)法[8]、原子发射光谱(AES)法[9]、原子荧光光谱(AFS)法[10]、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法[11]和大气压化学电离质谱(APCI-MS)法[12]等，这些方法常用于测定土壤、食品、水和生物样品中的硒含量。目前广泛使用的硒含量测定方法是2, 3-二氨基萘(DAN)荧光法[13]，样品衍生后经液-液萃取，再利用荧光分光光度计检测，此过程溶剂消耗较大。迄今为止，对于硒螯合物的前处理方法主要有液-液萃取法[14]和分散液-液微萃取法[15]，液-液萃取法主要是以环己烷作为萃取剂对硒-DAN螯合物(Se-DAN螯合物)进行萃取，而分散液-液微萃取法是以甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃以及离子液体等为分散剂，以四氯化碳、氯仿、二氯甲烷、四氯乙烯、氯苯、溴乙烷、对氯甲苯以及二硫化碳等为萃取剂，让体系形成萃取液滴，实现提取和预浓缩一步到位。Zhou等[15]利用分散液-液微萃取和反相C18柱高效液相色谱紫外检测法测定了茶叶中硒含量，但是在应用此方法对硒蛋白多糖中硒含量进行测定时发现，前处理过程中对萃取剂的浓缩会造成Se-DAN螯合物的损失，更重要的一点是普通C18色谱柱对于Se-DAN螯合物和体系中的干扰物并不能有效分离。本研究团队自行筛选、纯化、分离得到了1株高产胞外多糖的细菌菌株Z0206。研究表明，该菌株能耐受高浓度的亚硒酸钠(Na2SeO3)，并且能够将无机硒转化为有机硒和单质硒，该菌株发酵制备得到的主要产物被命名为Z0206硒蛋白多糖[16]，在小鼠和家禽上应用发现其具有较强的抗氧化和免疫功能[17-20]。因此，本试验旨在建立一种利用分散液-液微萃取前处理并将一种新型反相色谱柱应用于高效液相色谱-荧光检测测定硒蛋白多糖中硒含量的方法，以促进硒蛋白多糖作为一种新型饲料添加剂在饲料生产中的广泛应用，同时为畜牧业中硒产品中硒含量的测定提供更简便、更易普及的分析方法。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试剂及配制方法Na2SeO3标准品(纯度99%)、乙腈(色谱纯)、DAN(纯度95%)为Sigma公司产品。乙二胺四乙酸二钠、盐酸羟胺、盐酸、硝酸、高氯酸、氯苯等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。酵母硒样品由浙江科盛饲料有限公司提供。
DAN试剂(1.0 g/L)的配制：参照《饲料中硒的测定》(GB/T 13883—2008)。
1.1.2 主要仪器数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)、pH计(美国Mettler Toledo公司)、Softmax pro5多功能连续光谱酶标仪(美国Molecular Devices公司)、纯水仪(日本Yamato公司)、Ultimate 3000高效液相色谱仪配置紫外检测器和荧光检测器(美国Thermo Scientific公司)、高速离心机(美国Thermo Scientific公司)。
1.2 硒蛋白多糖样品的制备硒蛋白多糖的制备参考本课题组前期研究报道[18]，该样品将作为本试验的待测材料。
1.3 硒蛋白多糖样品的前处理及分析样品按《饲料中硒的测定》(GB/T 13883—2008)规定进行湿法消解，调节pH至1.5~2.0，并用0.1 mol/L HCl定容至250 mL，同时设置空白对照。取出3 mL样品至5 mL具塞离心管中，向其中加入0.5 mL DAN，沸水浴反应10 min，流水冷却后，再向其中先后加入400 μL乙腈和120 μL氯苯，振摇5 min，然后静置5 min，最后以5 000 r/min的转速离心5 min。移取100 μL氯苯并向其中加入100 μL乙腈，混匀后进样，经高效液相色谱-紫外检测器串联荧光检测器(HPLC-UVD-FLD)分析。
1.4 标准曲线的制备准确称取适量Na2SeO3，溶解在500 mL 0.1 mol/L HCl中，用0.1 mol/L HCl逐步稀释成250.0、100.0、50.0、25.0、10.0和5.0 μg/L的硒(Ⅳ)标准工作液。经过1.3步骤操作后，利用HPLC-UVD-FLD分析测定Se-DAN螯合物含量。
1.5 HPLC-UVD-FLD分析条件Welch Ultimate PFP色谱柱[250 mm×4.6 mm，3 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；Xbrige C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国Waters公司)；进样量5 μL；流动相：乙腈。紫外检测器(UVD)：波长378 nm；荧光检测器(FLD)：激发波长376 nm，发射波长520 nm。
比较Se-DAN螯合物在不同的色谱柱(C18色谱柱与PFP色谱柱)和不同的流速(0.3、0.4与0.5 mL/min)下串联紫外检测器与荧光检测器色谱保留行为。
1.6 方法的准确度与精密度考虑到饲料中硒含量的测定湿法消解已经有相应的国家标准，并且方法已经很成熟，本试验分别取1.0、2.5和5.0 μg/mL 3个浓度的硒标准工作液加入到50 mL硒蛋白多糖消解液(从定容的250 mL样品溶液中分取)中，得到最终计算值为1.0、2.5和5.0 μg的3个添加水平，计算回收率及变异系数。
2 结果与分析 2.1 PFP色谱柱与C18色谱柱分析Se-DAN螯合物分别使用PFP色谱柱和C18色谱柱，以乙腈作为流动相，设置流速为0.3 mL/min，分析硒蛋白多糖样品中Se-DAN螯合物，紫外检测结果如图 1所示，荧光检测结果如图 2所示。由图 1可知，无论使用PFP色谱柱还是C18色谱柱，用紫外检测器都不能对硒蛋白多糖样品中Se-DAN螯合物进行完全基线分离。而由图 2可知，选择PFP色谱柱，用荧光检测器时，样品中的Se-DAN螯合物能呈现出很好的峰形，这一点在C18色谱柱上则不能实现。
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高效液相色谱分析条件：流速0.3 mL/min，紫外吸收波长378 nm。 The HPLC analysis condition: flow rate, 0.3 mL/min; UV absorption wavelength 378 nm. 图 1 PFP色谱柱(上)和C18色谱柱(下)分析硒蛋白多糖中Se-DAN螯合物色谱图(紫外检测器) Fig. 1 Chromatograms of Se-DAN complex in selenium-enriched polysaccharides analyzed by PFP chromatographic column (up) and C18 chromatographic column (down) (UVD) |
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高效液相色谱分析条件：流速0.3 mL/min，激发波长376 nm，发射波长520 nm。 The HPLC analysis condition: flow rate, 0.3 mL/min; excitation wavelength 376 nm; emission wavelength 520 nm. 图 2 PFP色谱柱(上)和C18色谱柱(下)分析硒蛋白多糖中Se-DAN螯合物色谱图(荧光检测器) Fig. 2 Chromatograms of Se-DAN complex in selenium-enriched polysaccharides analyzed by PFP chromatographic column (up) and C18 chromatographic column (down) (FLD) |
针对PFP色谱柱分别考察了不同流速对仪器灵敏度和分离度的影响。流动相乙腈的流速分别设置为0.3、0.4和0.5 mL/min，结果如图 3所示，可知使用低流速(0.3 mL/min)乙腈可获得更高的灵敏度和分离度。
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从上到下流速分别为0.3、0.4和0.5 mL/min。 From up to down, the flow rate was 0.3, 0.4 and 0.5 mL/min, respectively. 图 3 PFP色谱柱在不同流速下分析硒蛋白多糖中Se-DAN螯合物色谱图 Fig. 3 Chromatograms of Se-DAN complex in selenium-enriched polysaccharides analyzed by chromatographic PFP column with different flow rates |
使用PFP色谱柱，在流速为0.3 mL/min的条件下分析Se-DAN螯合物色谱图，如图 4所示。以硒标准工作液浓度为横坐标(x)，荧光检测积分面积为纵坐标(y)，拟合计算得到硒(Ⅳ)含量的标准曲线方程及相关系数(R2)。在5.0~250.0 μg/L浓度范围内，线性方程式为y=10 608.3x+24 532.8(R2=0.999 8)。
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图 4 硒标准工作液(250.0 μg/L)色谱图 Fig. 4 Chromatogram of selenium standard (250.0 μg/L) working solution |
本试验选定硒(Ⅳ)含量的检出限为2.5 μg/L，检出限大于3倍信噪比，定量限为5.0 μg/L，定量限大于10倍信噪比，满足国际分析方法性能的要求。
2.5 所建立方法的准确度与精密度在50 mL硒蛋白多糖消解液中(从定容的250 mL毫升溶液中分取)，加入硒标准工作液，得到的回收率及相对标准偏差(RSD)如表 1所示。在1.0、2.5和5.0 μg 3个添加水平范围内，硒蛋白多糖中硒的回收率为82.1%~105.2%，RSD为2.7%~3.9%。采用《饲料中硒的测定》(GB/T 13883—2008)中的荧光分光光度法测得硒蛋白多糖样品中硒含量为1 327.8 μg/g。经过分散液-液微萃取后利用高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)测得硒蛋白多糖样品中硒平均含量为1 337.0 μg/g，RSD为0.3%。2种方法的测定结果十分接近。
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表 1 硒蛋白多糖中硒回收率和相对标准偏差 Table 1 Recovery and RSD of seleniu in selenium-enriched polysaccharides (n=3) |
将5.0、10.0、25.0、50.0、100.0和250.0 μg/L系列浓度的硒(Ⅳ)与DAN反应生成的Se-DAN螯合物在室温下放置，分析10 h前后的荧光强度，结果如表 2所示，可知Se-DAN螯合物的稳定性较好。
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表 2 利用HPLC-FLD测定10 h前后Se-DAN螯合物结果 Table 2 Results of Se-DAN complex determined by HPLC-FLD before and after 10 h |
为考察本试验所建立方法在常见的饲料添加剂总硒含量检测中的适用性，对酵母硒样品进行酸水解和液相分析，色谱图如图 5所示，可以看到酵母硒中基质对Se-DAN螯合物的吸收峰没有产生干扰。
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图 5 酵母硒中Se-DAN螯合物色谱图 Fig. 5 Chromatograms of Se-DAN complex in selenium yeast |
PFP色谱柱除具有苯基官能团的疏水相互作用与π-π键相互作用外，还因其具有高电负性氟官能团，增加了其与化合物的偶极-偶极及电荷转移作用，从而改善了其对结构相近化合物的选择性，适合于极性较小的化合物[21]。而C18色谱柱主要作用模式是疏水作用，主要用适合于极性和中等非极性分子的化合物。因此，本试验选择PFP色谱柱替代常用的C18色谱柱以增强选择性，用荧光检测器替代紫外检测器以排除样品中具用紫外吸收的物质可能造成的基质干扰，本试验最终选择PFP色谱柱和荧光检测器。
3.2 不同的流速对结果的影响使用PFP色谱柱，乙腈流速分别为0.3、0.4和0.5 mL/min时，流速越低，Se-DAN螯合物和其他杂质峰分离情况更好，并且，在低浓度范围，当流速减小时，仪器会有更高的灵敏度，故最终选择流速为0.3 mL/min。
3.3 氮气吹干浓缩对结果的影响Zhou等[15]对萃取液进行氮吹浓缩至干再用甲醇复溶后经HPLC分析，本研究在对萃取液氮气吹干浓缩过程中发现，浓缩过程尤其是吹干结束时，空气对Se-DAN螯合物荧光的猝灭影响很大，这一点与文献报道[22]一致。因此，为了避免氮吹浓缩过程中空气对荧光的猝灭，本试验直接采用乙腈对萃取剂进行1 : 1稀释后进样，表现出良好的线性和准确度。并且，10 h前后Se-DAN螯合物的HPLC-FLD测定结果显示，Se-DAN螯合物在室温下放置10 h仍然十分稳定。
3.4 所建立方法的准确度和适用性国标法中对于硒含量的测定，通常采用的是荧光分光光度法，将该方法作为本试验所建立方法测定结果的对照。采用本试验所建立方法测定的硒蛋白多糖中硒含量为1 337.0 μg/g，与国标法测定结果(1 327.8 μg/g)高度一致，说明该方法的准确度较高。利用所建立方法对酵母硒中硒含量进行测定时，酵母硒中基质对Se-DAN螯合物的吸收峰没有产生干扰，说明本试验所建立的前处理步骤和仪器分析方法在其他含硒样品中同样得到了很好的应用。
3.5 所建立方法的优越性《饲料中硒的测定》(GB/T 13883—2008)中，对于消解后样品需要加入甲酚红指示剂、盐酸羟胺、乙二胺四乙酸二钠等试剂，并且需要多次转移，最重要的一点是还需要5 mL环己烷萃取，再经荧光分光光度计检测。而本试验仅需对消解后的样品调节pH和定容，用微升级分散剂和萃取剂进行萃取，不需要转移。因此，与GB/T 13883—2008相比较，在分析结果一致的情况下，本试验前处理过程中相对简便、试剂消耗更少。
4 结论本试验建立了一种分散液-液微萃取前处理和一种新型反相色谱柱应用于HPLC-FLD测定硒蛋白多糖中总硒含量的方法，最优化的条件为：Se-DAN螯合物以400 μL乙腈为分散剂，120 μL氯苯为萃取剂进行分散液-液微萃取后，经乙腈稀释后直接采用PFP色谱柱分离，以流速为0.3 mL/min的乙腈洗脱，设置激发波长376 nm、发射波长520 nm进行荧光检测器检测，外标法定量。采用本方法测定的硒蛋白多糖中总硒含量为1 337.0 μg/g，国标法测定结果高度一致，并且该方法可用于常见饲料添加剂酵母硒中总硒含量的检测。本方法具有操作简便、易普及、试剂消耗少、分离度好、回收率高和适用性强等特点。
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