豆渣(soybean residue，SR)是豆腐、豆浆、腐乳等豆制品加工过程中产生的副产品，在我国产量极为丰富，且非纤维碳水化合物和蛋白质含量高，因而具有很高的营养价值[1]。然而由于新鲜SR含水量大，导致其很难长期保存，因而限制了其在动物饲粮中的应用[2]。目前，青贮发酵是对含水量较高饲料进行长期保存的一种经济有效的方式，这种方式不仅可以缓解废物处理问题，还可以提高动物饲料的利用[3]。但饲料含水量过高，导致青贮过程中不良微生物大量繁殖，进而影响饲料的发酵品质[4]。由于SR的含水量过高(大于80%)，因而在青贮发酵时需将其与一些干物质(DM)含量较高的非常规饲料混合，以调整水分含量，进而达到最佳青贮条件。桑叶(mulberry leaf，ML)作为一种非常规饲料资源，在我国产量极为丰富[5]，目前主要是将新鲜ML晒干、磨碎制成桑叶粉后用于动物饲料中，这种方式简单、方便、易操作。然而，ML高粗纤维含量和一些抗营养因子能抑制动物对营养物质的消化吸收[6]，从而限制其在动物饲喂中的应用。因此，将SR与ML进行混合青贮，既可以调整水分含量，延长保存时间，还可以改善饲料的营养价值，这对于提高我国饲料资源利用具有重要意义。
微生物青贮技术可以抑制不良微生物生长、延长贮存时间并减少氨态氮(NH3-N)的产生[7]。崔彦召[8]研究表明，添加乳酸菌(LAB)不仅可以有效地改善发酵全混合日粮青贮的发酵品质和风味，还能够有效降低其霉菌毒素的含量，从而提高发酵全混合日粮青贮的营养价值和饲喂安全性。王昆昆等[9]发现添加LAB可以降低不同比例苜蓿和披碱草混贮的NH3-N含量，提高水溶性碳水化合物(WSC)含量，从而提高其发酵品质。纤维素酶(cellulose, CE)是一种复合酶，可增加发酵糖的供应量，为LAB快速繁殖提供底物，加速pH降低，从而进一步提高青贮发酵品质。李春霞[10]发现在甘蔗梢青贮中添加纤维素酶、木聚糖酶和果胶酶均能降低中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量，提高糖的生成量，进而大幅改善青贮发酵品质。Wang等[11]发现将紫花苜蓿与全株玉米混合青贮可降低不良微生物数量，提高发酵品质及有氧稳定性。
然而，目前有关LAB与CE的组合添加对SR和ML混贮发酵品质的影响鲜有报道，需进一步研究。为此，本试验评价了LAB和CE添加对SR与ML混合青贮发酵品质及体外瘤胃发酵特性的影响，以期为SR和ML的合理饲用提供理论依据和技术支持。
1 材料与方法 1.1 青贮饲料调制和样品采集 1.1.1 试验材料混贮原料：试验所用SR和ML均购自哈尔滨某股份有限公司。复合乳酸菌剂：由东北农业大学反刍动物营养研究所提供。CE：10 000 U/g，购于哈尔滨某生物技术有限公司。
1.1.2 青贮饲料调制将SC与ML按比例在玻璃盆中混合均匀，以鲜重为基础，调整含水量为65%。试验设置4个组，分别为对照组(CON组)、LAB组、CE组及LAB+CE组，每组3个重复，其中LAB和CE添加量分别为1×106 CFU/g和100 U/g。各组中各添加剂均充分溶解在10 mL蒸馏水中，随后用微型喷雾器喷洒在2 kg混合青贮上，CON组只喷洒10 mL蒸馏水。混合均匀后，将饲料放入聚乙烯袋(40 cm×50 cm)中，并用食品真空封口机密封，置于室温(28±3) ℃下进行8周青贮发酵。
1.2 样品分析 1.2.1 微生物分析发酵完成后取出样品，采用平板计数法对混合青贮饲料进行微生物分析[12]。首先，取样品10 g加入90 mL灭菌生理盐水中进行提取。其次，将提取液稀释为9个梯度(10-1~10-9)，并选取3个最适稀释倍数进行细菌群落计数。最后，取不同浓度的稀释液100 μL在MRS琼脂培养基和紫红色胆汁(VRB)琼脂培养基上均匀涂布，然后置于厌氧培养盒中30 ℃恒温培养48 h后进行LAB计数。与上述操作方法一致，分别通过孟加拉红培养基(Rose Bengal agar)和PDA琼脂培养基培养后进行酵母菌和霉菌计数(在28 ℃下培养72 h)。
1.2.2 发酵品质分析取20 g样品置于180 mL蒸馏水中匀浆1 min，经4层纱布过滤，制得青贮饲料并在4 ℃下保存过夜，然后用定性滤纸过滤。所得滤液立即用Sartorius PB-10型pH测定仪测定pH。滤液在4 ℃，12 000×g条件下离心10 min，取上清液用0.22 μm滤膜过滤后，用高效液相色谱仪(Waters-600，日本)进行乳酸(LA)含量测定。采用气相色谱仪(岛津GC-2010，日本)分析滤液中乙酸(AA)含量。NH3-N含量采用苯酚-次氯酸钠比色法进行测定[13]。
1.2.3 化学成分分析将取出的样品置于65 ℃烘箱中干燥48 h，然后用研磨机研磨过1 mm筛网。根据AOAC(1990)中描述的方法，测定样品DM含量，并计算干物质回收率(DMR)。使用凯氏定氮仪(Foss，2300自动分析仪，瑞典)测定样品粗蛋白质(CP)含量[14]。按照Van Soest等[15]所描述的方法，采用纤维分析仪(ANKOM)测定样品NDF和ADF含量。WSC含量采用3，5-二硝基水杨酸比色法进行测定[16]。钙(Ca)和磷(P)含量分别参考国际标准ISO 27085—2009(高锰酸钾法)和GOST R 50852—1996(磷钒钼酸比色法)进行测定。
1.3 体外发酵称取0.5 g样品放入经105 ℃烘干2 h恒重后的F75(北京正方兴达科技有限公司)滤袋中并进行封口。然后在早上饲喂前，从3头装有永久性瘤胃瘘管的奶牛瘤胃中收集新鲜瘤胃液(奶牛基础饲粮组成及营养水平见表 1)，并迅速带回实验室，整个过程中瘤胃液一直处于39 ℃下厌氧保存。根据Menke等[17]的报道配制缓冲溶液，并将饱和的二氧化碳(CO2)通入配制好的缓冲液中直至缓冲液呈无色透明，此期间缓冲液一直置于39 ℃水浴锅中。随后将缓冲液与瘤胃液按2 ∶ 1的比例混合均匀，配制发酵液。将装有样品的滤袋与30 mL发酵液放入对应编号的发酵瓶中，通入CO2后拧紧瓶盖，并在盖口涂抹少许石蜡，以防出现漏气的情况。将产气记录装置(Cerabar T PMP131)和Alltech公司记录系统相连接，以准确记录产气量。发酵瓶在39 ℃条件下连续培养48 h，且每个样品5个重复并设置3个空白，并在0、2、4、8、12、16、24、36和48 h时记录产气数值。体外发酵结束后，立即使用pH测定仪测定发酵液pH，随后取20 mL发酵液平均分装于2个15 mL离心管中，并分别加入2 mL 25%的偏磷酸，充分混匀后置于-20 ℃保存，直至用于挥发性脂肪酸(VFA)和NH3-N含量测定，测定方法与上述饲料测定相同[18]。将滤袋取出后立即冲洗至冲洗液清澈无味，随后置于烘箱内烘干(105 ℃，4 h)，恒重后称重，用于测定干物质回收率。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
发酵后产气量计算公式如下：
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式中：GPt指混贮后样本在t时间共积累的产气量(mL/g)；Vt为混贮后样本在t时间段产气量(mL/g)；V0为t时间段空白产气量(mL/g)；W为发酵底物的质量(g)。
产气参数根据Ørskov等[20]提出的产气模型计算：
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式中：GP表示t时间点的累计产气量(mL/g)；a表示快速产气部分(mL/g)；b表示慢速产气部分(mL/g)；c表示产气速率(mL/h)。
1.5 数据处理及统计分析数据采用SAS软件包(Version 9.4)中的GLM程序进行分析。采用Turkey’s作显著性检验，其中P＜0.05表示差异显著。
2 结果与分析 2.1 青贮原料化学组成如表 2所示，SR与ML的DM含量分别为16.52%和89.32%，且pH均大于6.0。SC中NDF和ADF含量均高于ML，但WSC含量较低，仅为2.5%。SR中检测到LAB和酵母菌菌落数分别为2.31和2.54 lg(CFU/g)，但未检测到霉菌。ML中霉菌和酵母菌菌落数分别为2.17和4.47 lg(CFU/g)，而SR和ML中大肠杆菌菌落数均低于检测水平[＜2.00 lg(CFU/g)]。
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表 2 混合青贮前SR和ML的营养组成及微生物群落数(干物质基础) Table 2 Nutrient composition and microbial community number of SR and ML before mixed silage (DM basis) |
由表 3可知，与CON组相比，CE组与LAB+CE组DM含量显著提高(P＜0.05)，而与LAB组相比无显著差异(P>0.05)。LAB组、CE组及LAB+CE组CP含量较CON组分别提高16.45%、11.30%、19.60%(P＜0.05)。与CON组相比，各试验组ADF含量显著下降(P＜0.05)，且CE组和LAB+CE组NDF含量显著降低(P＜0.05)，但LAB组NDF含量无显著变化(P>0.05)。此外，各试验组间WSC含量差异并不显著(P>0.05)，但均较CON组略微降低。
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表 3 LAB和CE对SR与ML混贮的化学成分的影响(干物质基础) Table 3 Effects of compound lactic acid bacteria and cellulase on chemical composition of mixed silage of soybean residue and mulberry leaves (DM basis) |
由表 4可知，与CON组相比，LAB+CE组干物质回收率显著提高(P＜0.05)，而LAB组和CE组间无显著差异(P>0.05)。各试验组pH均较CON组显著降低(P＜0.05)，其中LAB+CE组达到最低，LAB组和LAB+CE组之间差异不显著(P>0.05)。与CON组相比，LAB组和LAB+CE组NH3-N含量均显著下降(P＜0.05)，与CON组相比，各试验组乳酸含量均显著提高(P＜0.05)，且LAB+CE组达到最高。各试验组乙酸含量均显著高于CON组(P＜0.05)，且LAB+CE组达到最高。
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表 4 LAB和CE对SR与ML混贮的发酵品质影响 Table 4 Effects of compound lactic acid bacteria and cellulase on fermentation quality of mixed silage of soybean residue and mulberry leaves |
由表 5可知，混贮后CON组、LAB组、CE组、LAB+CE组的LAB菌落数分别为7.33、8.02、7.98和8.75 lg(CFU/g)。大肠杆菌菌落数除CON组为2.21 lg(CFU/g)外，其余各组均低于检测水平[＜2.00 lg(CFU/g)]。酵母菌菌落数在各试验组中均低于检测水平[＜2.00 lg(CFU/g)]，但在CON组中检测值为3.04 lg(CFU/g)。LAB组和LAB+CE组均未检测到霉菌，且CON组和CE组霉菌菌落数均低于检测水平[＜2.00 lg(CFU/g)]。
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表 5 LAB和CE对SR与ML混贮的微生物群落影响 Table 5 Effects of compound lactic acid bacteria and cellulase on microbial community of mixed silage of soybean residue and mulberry leaves |
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表 6 LAB和CE对SR与ML混贮的产气量及产气参数的影响 Table 6 Effects of compound lactic acid bacteria and cellulase on gas production and parameters of mixed silage of soybean residue and mulberry leaves |
由表 5可知，随发酵时间延长各组产气量均呈现上升趋势。与CON组相比，发酵2 h时LAB组产气量显著升高(P＜0.05)，而其他组无显著变化(P>0.05)。发酵4 h后，各试验组产气量均较CON组升高，且LAB+CE组产气量在各时间点均显著高于CON组(P＜0.05)。与CON组相比，各试验组快速发酵部分产气量(a)和慢速发酵部分产气量(b)均较CON组显著增加(P＜0.05)，且LAB+CE组达到最高。除CE组外，其他各试验组潜在产气量(a+b)均显著高于CON组(P＜0.05)，且LAB+CE组最高。此外，LAB组和CE组有效产气速率(c)均较CON组显著降低(P＜0.05)，但LAB+CE组无显著变化(P>0.05)。
2.6 LAB和CE对SR与ML混贮体外瘤胃发酵参数影响由表 7可知，LAB组和CE组发酵液中乙酸、丙酸和丁酸含量均较CON组显著升高(P＜0.05)，但各试验间差异不显著(P>0.05)。与CON组相比，各试验组发酵液中总挥发性脂肪酸含量显著提高(P＜0.05)，且LAB+CE组产量最高。各试验组乙酸/丙酸均较CON组显著降低(P＜0.05)，且LAB组达到最低。
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表 7 LAB和CE对SR与ML混贮体外瘤胃发酵特性的影响 Table 7 Effects of compound lactic acid bacteria and cellulase on rumen fermentation characteristics in vitro of mixed silage of soybean residue and mulberry leaves |
本试验中，LAB组和LAB+CE组DM含量均较CON组显著升高，原因可能是由于LAB在混贮过程中能产生更多的乳酸，从而导致pH快速降低，抑制不良微生物生长，进而减小DM流失[21]。各试验组WSC含量均较CON组降低，原因可能是由于LAB在混贮发酵过程中会消耗大量的WSC，从而促进LAB快速生长与繁殖，进而促进有机酸的产生。王力生等[22]研究指出添加微生物制剂能够显著降低笋壳青贮中WSC含量，与本研究结果一致。NDF和ADF是反映饲料中纤维质量好坏的重要指标。由于ADF在动物体内很难消化吸收，所以ADF含量越低，说明混贮发酵质量越高[23]。本试验中，LAB+CE组中NDF和ADF含量较CON组显著降低。一方面可能是由于CE添加促进了SR和ML混贮中纤维的降解；另一方面可能是由于LAB在混贮发酵过程中会降解碳水化合物产生CO2，从而导致纤维含量降低。这与赵华等[24]试验结果相符。同时Mu等[25]指出，CE与LAB混合添加对高水分苋菜和稻草混合青贮的化学成分、细菌群落及有氧稳定性均好于单一添加LAB。以上研究结果表明LAB和CE添加能够提高SR和ML混贮的营养价值。
3.2 LAB和CE对SR与ML混贮饲料发酵品质的影响在混贮发酵过程中，梭菌等不良微生物的存在会抑制LAB生长，促进丁酸产生，引起乳酸发酵路线出现偏离，从而导致蛋白质降解为NH3-N，进而引起饲料营养流失[26]。本试验中，LAB+CE组NH3-N含量较CON组显著降低，原因可能是添加CE能够将纤维降解为WSC，从而为LAB生长提供充足的营养物质，促进乳酸产生，进而抑制梭菌等不良微生物在混贮饲料中生长。此外，本研究中LAB组、CE组和LAB+CE组均为未检测到丁酸也证实了这一假设。
pH是评价青贮发酵质量好坏的重要指标，其变化取决于青贮DM、化学成分和青贮周期。Nishino等[27]研究发现添加LAB可显著降低全混合日粮青贮的pH，从而提高其发酵品质和有氧稳定性。本试验中，各试验组间pH均低于4.00，原因可能是接种LAB增加了初始乳酸菌数量，从而促进乳酸产生，进而导致pH下降[28]。Zhang等[29]试验结果表明添加干酪乳杆菌能够降低羊草青贮的pH，这与本研究结果相似。同时，Liu等[30]评估了添加剂对全混合日粮青贮发酵品质的影响，发现添加干酪乳杆菌和纤维素酶的全混合日粮青贮中乳酸含量达到3.8%(DM)，这与本试验中添加LAB和CE混贮产生的乳酸含量(4.12% DM)相近。Nishino等[31]在水分含量较高(85.5%)的豚草青贮饲料中观察到较高的乙酸含量(5.64 g/kg DM)。与此不同，本研究中3个试验组的乙酸含量较低。这种差异可能是由于混贮饲料中的细菌群落来自不同的环境、自身特性或原料上的微生物数量不同所致[32]。然而，菌酶协同改善饲料混贮发酵品质的机理还有待进一步研究。
一般来说，是否需要向青贮饲料中加入添加剂取决于附着在青贮饲料上的微生物数量和种类[33]。对于保存较好的混贮饲料，混贮时LAB的菌落数至少达到1×105 CFU/g[34]。然而，在原料中观察到SR的LAB菌落数仅为2.3 lg(CFU/g)。ML的LAB菌落数低于2.00 lg(CFU/g)，且不良微生物数量较高，这可能影响发酵品质。为保证混贮饲料快速发酵并抑制有害微生物的生长，在青贮饲料发酵的早期阶段，需要通过加入添加剂，如LAB或CE，提高LAB发酵能力，使其主导微生物发酵。
3.3 LAB和CE对SR与ML混贮体外瘤胃发酵特性的影响混贮经瘤胃微生物发酵后的产气量是评价混贮可发酵程度的重要指标，因为混贮后饲料产气量与养分可消化程度呈正相关[35]。本试验结果表明，LAB+CE组体外产气量较对照组显著升高，说明LAB和CE添加具有提高SR和ML混贮体外瘤胃消化率的潜力。一般来说，稳定的内部环境是保证瘤胃功能正常的必要条件，而pH则是反映瘤胃内部环境的主要指标，当pH不在正常范围内时，瘤胃微生物的活性就会受到影响[36]。本试验中，LAB+CE组和CE组发酵液pH显著降低，但仍处于正常范围内，说明瘤胃发酵环境处于稳定状态，能促进微生物的生长和代谢。本研究中瘤胃pH下降可能主要因为VFA的产生，且随着在混贮中添加LAB和CE，VFA含量显著提高，进而导致pH呈降低趋势。LAB+CE组VFA含量增加的原因可能是由于LAB和CE添加促进了混贮饲料中碳水化合物在瘤胃中的降解，进而改善瘤胃发酵。
4 结论本试验结果表明，LAB与CE组合添加可提高SR和ML混贮饲料乳酸和粗蛋白质含量，降低NH3-N含量和pH，从而提高其营养价值。此外，SR和ML混贮中添加LAB和CE后其体外瘤胃发酵特性也得到改善。因此，LAB和CE混合添加可大幅改善SR和ML混贮品质，使其具有应用在奶牛生产中的潜力。
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