2. 无锡三智生物科技有限公司, 无锡 214135
2. Wuxi Sanzhi Bio-Technology Co., Ltd., Wuxi 214135, China
水产动物受到体内与体外环境的影响会产生过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，包括自由基形式(超氧阴离子自由基、羟基自由基)和非自由基形式[过氧化氢(H2O2)、次溴酸等][1]。由ROS引起的氧化应激和氧化损伤是危害水产动物生理健康的主要因素，针对ROS的研究主要包括不同种类ROS对细胞、器官组织和机体的损伤作用及其作用路径，以及如何提高水产动物抗氧化应激能力，例如，筛选适用于水产动物抗氧化应激、抗氧化损伤作用物质的研究，这也是现代养殖学和营养学研究的重要领域之一。
利用离体细胞氧化损伤模型研究ROS的作用机制，并利用细胞氧化损伤模型筛选抗氧化损伤物质是较为有效的技术方法，其中H2O2损伤细胞模型是常用的细胞氧化损伤模型[2]。H2O2是一种常见的活性氧，极易透过细胞膜导致细胞结构的氧化损伤或诱发细胞凋亡。因此H2O2是被用作细胞体外建立氧化损伤模型的常用试剂[3]。在细胞氧化损伤模型应用方面，一个重要的应用方向就是将对照组、模型组和“造模剂+受试物”试验组在相同条件下进行试验，筛选和评价“受试物”抗氧化应激的能力、对氧化损伤的修复能力，最终筛选出有效的受试物应用于细胞、动物的抗氧化应激和氧化损伤修复。
一些植物多酚含量高的天然植物是抗氧化应激、氧化损伤修复受试物的主要来源，依赖其中含有的植物多酚(如多酚酸和多酚黄酮类物质)实现对ROS的清除，并对受到氧化损伤的细胞或器官组织进行修复[4]。
本试验以H2O2为造模剂，以草鱼的原代肝细胞为试验对象，依据细胞存活率与细胞形态变化、培养液中乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase, LDH)活性、细胞中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性、细胞凋亡率等指标，探索最佳的H2O2浓度及干预时间，旨在建立一种可靠性好、重复性高的H2O2诱导的草鱼原代肝细胞氧化损伤模型，并利用构建的草鱼原代肝细胞氧化损伤模型对8种天然植物的抗氧化能力进行综合评价，筛选具有较强抗氧化活性的天然植物。
1 材料与方法 1.1 试验草鱼试验用草鱼为1冬龄草鱼幼鱼，体重为20~30 g/尾，饲养于苏州大学室内养殖系统中。使用自制的含28%蛋白质、4%油脂的饲料喂养，每天按时投喂1次。
1.2 肝细胞氧化损伤模型的构建 1.2.1 H2O2的配制和使用无菌条件下，吸取20 μL 30%的H2O2(中国医药集团有限公司)与1 880 μL的无菌三蒸水均匀混合，将H2O2稀释100倍。分别吸取1、2、4和6 μL的H2O2溶液到1 mL的培养基中，混合均匀，制成终浓度为100、200、400和600 μmol/L的H2O2造模剂。
1.2.2 肝细胞的分离与培养草鱼原代肝细胞的分离参照秦洁等[5]的试验方法并稍作调整。草鱼用0.01%高锰酸钾溶液浸泡15 min，常规解剖取出肝脏，磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L、pH 7.4)清洗3遍去除多余组织块后，剪成1 mm3大小的颗粒，按照体积1 ∶ 3的比例加入0.25%的胰蛋白酶，27 ℃控温摇床消化15 min，终止消化后1 000 r/min离心1 min，弃掉上清液。按1 ∶ 3的比例加入PBS和红细胞裂解液，1 000 r/min离心4 min弃掉上清液。PBS清洗细胞2次，800 r/min离心1 min弃掉上清液，加入含10%胎牛血清的M199培养基制成细胞悬液，于5% CO2、27 ℃的培养箱中培养，24 h后换完全培养液。
1.2.3 细胞分组及处理取培养24 h后处于对数生长期的细胞(细胞贴壁生长且贴壁细胞约占80%的培养板面积)，分组后分别用终浓度为0(对照组)、100、200、400、600 μmol/L的H2O2处理细胞0.5、1.0、2.0、4.0 h后进行后续试验。
1.2.4 细胞存活率的测定接种2.5×105个细胞到96孔板中，按照1.2.3的分组处理细胞后换上正常培养液，每孔加入10 μL噻唑蓝(MTT)溶液，继续培养4 h后弃去旧培养液，每孔加入100 μL纯度为99.5%的二甲基亚砜(DMSO)，遮光振摇10 min，充分溶解甲瓒(formazan)。用酶标仪检测570 nm波长下各孔的吸光度值(OD570 nm)，计算细胞存活率，数据用百分比表示(平均值±标准差)。细胞存活率的计算公式如下：
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细胞分组处理方法同1.2.3，分别收集不同浓度H2O2、不同处理时间的培养基上清液。按照试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)所述方法，用酶标仪在450 nm波长下检测LDH活性。
1.2.6 细胞形态学观察生长对数期的细胞经不同浓度的H2O2处理1 h后用倒置显微镜观察各组细胞的形态变化并拍照。
1.2.7 细胞中MDA含量、SOD活性的检测细胞分组处理方法同1.2.3，接种2.5×106个细胞到24孔板中，不同浓度的H2O2处理1 h。将细胞收集在1.5 mL离心管中，1 000×g离心4 min，弃掉上清液后用PBS清洗1次。加入200 μL的细胞裂解液，重悬细胞，裂解30 min，13 000×g离心10 min取上清液，按照试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)所述方法检测MDA含量和SOD活性。
1.2.8 细胞凋亡率和细胞中ROS水平的检测细胞收集方法同1.2.7，细胞凋亡率试验按照Annexin V-FITC/PI试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司生产)说明书，ROS水平按照ROS试剂盒(南京建成生物工程研究所生产)所述方法，均使用流式细胞仪进行检测。
1.3 天然植物抗氧化能力的评价 1.3.1 8种天然植物依据前期预试验和有关中药的文献报道[6-10]，选择诃子(Terminalia chebula Retz)、虎杖(Polygoni Cuspidati Rhizoma et Radix)、荷叶(Folium nelumbinis)、车前草(Plantaginis herba)、侧柏叶(Platycladi cacumen)、甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma)、大黄(Rhei Radix et Rhizoma)和肉桂(Cinnamomi cortex)共8种天然植物(中药饮片，且均为植物原粉)，利用所建立的肝细胞氧化损伤模型评价其抗氧化能力。
1.3.2 天然植物水提物的制备将8种天然植物饮片分别用粉碎机粉碎，过60目筛，各称取一定量的粉末，按料液比1 ∶ 10加入双蒸水，搅拌均匀，4 ℃浸泡24 h，用滤膜过滤2遍，将滤液放入冷冻干燥机，制成粉末，-80 ℃冷冻保存待用。
1.3.3 天然植物清除1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基能力的测定清除DPPH自由基能力参照陈旭丹等[11]和王萍等[12]的方法测定并稍作改进。将DPPH溶于无水乙醇中，配成终浓度为8.62×10-5 mol/L的DPPH溶液。分别称取0.128 g待测样品，加入20 mL 75%乙醇，超声提取5 min，8 000 r/min离心8 min，收集上清液，得到初始浓度为6.4 g/L的待测液母液，用无水乙醇稀释成不同浓度。待测液与DPPH溶液各2 mL避光静置30 min，517 nm处测定吸光度值(Ai)；待测液与无水乙醇各2 mL做参比，517 nm处测定吸光度值(Aj)；DPPH溶液与无水乙醇各2 mL做空白，517 nm处测定吸光度值(A0)。每个样品做3个平行。按照下列公式计算DPPH清除率：
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式中：S为DPPH自由基清除率；Aj为待测液在517 nm处的吸光度值；Ai为加入DPPH溶液后待测液在517 nm处的吸光度值；A0为DPPH溶液在517 nm处的吸光度值。
IC50定义为：自由基数目减少50%时所需要的样品浓度，即为自由基清除率为50%时样品的浓度。根据样品浓度和对应的DPPH清除率绘图，得出公式，计算IC50。
1.3.4 天然植物对H2O2损伤细胞活性的测定将细胞培养24 h之后分为对照组、模型组、试验组。对照组换正常培养液，模型组和试验组换含200 μmol/L H2O2的培养液，处理细胞1 h，弃掉培养液，试验组分别加入含不同浓度(0.5、1.0、2.0 mg/mL)天然植物水提物的培养液，培养12 h换正常培养液，采用MTT法检测各组的吸光度值，以对照组为参照，计算各组细胞存活率。
1.4 数据统计与分析采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间差异显著性用Duncan氏法进行多重比较。试验数据以平均值±标准差(mean±SD)表示，P < 0.05表示显著差异，P < 0.01表示极显著差异。
2 结果与分析 2.1 肝细胞氧化损伤模型的构建 2.1.1 细胞存活率如图 1所示，4个处理时间(0.5、1.0、2.0、4.0 h)时细胞存活率均随着H2O2浓度的增加而降低。100 μmol/L H2O2组细胞存活率在4个处理时间时均大于70%，细胞损伤程度不够；而400和600 μmol/L H2O2组细胞存活率在4个处理时间时基本均小于50%，细胞坏死过多；200 μmol/L H2O2处理1.0~4.0 h时细胞存活率均降到50%~70%，可作为诱导氧化损伤模型的H2O2浓度。200 μmol/L H2O2处理1.0 h时细胞存活率为(64.85±0.38)%，且符合细胞损伤程度，可作为肝细胞氧化损伤模型建立的条件。
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图 1 H2O2对细胞存活率的影响 Fig. 1 Effects of H2O2 on cell survival rate (n=9) |
如图 2所示，4个处理时间时LDH活性均随H2O2浓度的增加先上升后趋于稳定。与对照组相比，200、400、600 μmol/L H2O2组LDH活性在4个处理时间时均出现显著或极显著升高(P < 0.05或P < 0.01)，且200、400、600 μmol/L H2O2组之间没有显著差异(P＞0.05)。200 μmol/L H2O2处理细胞1.0 h后培养液中LDH活性为(505.67±10.49) U/L，与对照组相比极显著升高(P < 0.01)。
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*表示与对照组相比差异显著(P＜0.05)，* *表示与对照组相比差异极显著(P＜0.01)。下图同。 * mean significant difference compared with the control group (P < 0.05), and * * mean extremely significant difference compared with the control group (P < 0.01). The same as below. 图 2 H2O2对培养液中LDH活性的影响 Fig. 2 Effects of H2O2 on LDH activity in culture fluid (n=6) |
不同浓度H2O2处理细胞1 h后倒置显微镜观察情况如图 3所示。对照组的细胞生长状况良好，细胞团细胞密度高，呈现圆形或椭圆形，形态饱满，细胞膜边缘清晰(图 3-A)。随着H2O2浓度的增加，细胞体积逐渐变小，细胞膜出现破裂，边缘模糊，细胞贴壁不牢。100 μmol/L H2O2组细胞较对照组无明显变化(图 3-B)。200 μmol/L H2O2组部分细胞出现细胞膜边缘模糊，细胞少量皱缩，大多数细胞呈现完整细胞状态(图 3-C)。400 μmol/L H2O2组部分细胞皱缩，胞内颗粒物增多，出现些许细胞碎片(图 3-D)。600 μmol/L H2O2组细胞碎片很多，细胞凋亡坏死严重(图 3-E)。
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A：对照组；B：100 μmol/L H2O2组；C：200 μmol/L H2O2组；D：400 μmol/L H2O2组；E：600 μmol/L H2O2组。 A: control group; B: 100 μmol/L H2O2 group; C: 200 μmol/L H2O2 group; D: 400 μmol/L H2O2 group; E: 600 μmol/L H2O2 group. 图 3 不同浓度H2O2对细胞形态的影响 Fig. 3 Effects of H2O2 with different concentrations on cell morphology |
不同浓度的H2O2处理细胞1 h后，细胞中MDA含量及SOD活性如表 1所示。与对照组相比，各浓度H2O2组细胞中SOD活性均极显著下降(P < 0.01)，其中200 μmol/L H2O2组SOD活性为(57.55±1.20) U/mg prot，降低了24.50%。随着H2O2浓度的增加，细胞中MDA含量逐渐升高，在H2O2浓度达到200 μmol/L时开始出现显著升高(P < 0.05)，之后保持稳定。
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表 1 不同浓度H2O2对细胞中MDA含量和SOD活性的影响 Table 1 Effects of H2O2 with different concentrations on MDA content and SOD activity in cells (n=6) |
如图 4-A所示，不同浓度H2O2处理细胞1 h后，流式细胞仪分析结果显示，与对照组相比，100 μmol/L H2O2组细胞已经有明显的凋亡，随着H2O2浓度的增加，凋亡细胞数量逐渐增多，400~600 μmol/L H2O2组晚期凋亡和坏死细胞明显增多。如图 4-B所示，100、200、400和600 μmol/L H2O2处理1 h后，细胞凋亡率分别为(21.29±1.62)%、(36.78±1.23)%、(53.82±3.56)%、(61.52±3.71)%，与对照组相比均极显著升高(P < 0.01)。
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A图为流式细胞仪检测Annexin V/PI双染结果；B图为细胞凋亡率。 Figure A showed the results of Annexin V/PI double staining by flow cytometry, and figure B showed the cell apoptosis rate. 图 4 不同浓度H2O2对细胞凋亡率的影响 Fig. 4 Effects of H2O2 with different concentrations on cell apoptosis rate (n=3) |
如图 5所示，H2O2浓度为0~200 μmol/L时细胞中ROS水平随H2O2浓度的升高而升高，在200 μmol/L时达到最高，与对照组相比差异极显著(P < 0.01)；H2O2浓度为400~600 μmol/L时细胞中ROS水平逐渐降低。100~600 μmol/L H2O2处理细胞1 h后，细胞中ROS水平用平均荧光强度来表示分别为62.0±4.0、103.7±2.5、109.3±1.5、87.0±6.3、66.3±3.0。
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图 5 不同浓度H2O2对细胞中ROS水平的影响 Fig. 5 Effects of H2O2 with different concentrations on ROS level in cells (n=6) |
清除自由基能力以IC50进行比较，IC50值越小表明样品清除自由基能力越强，抗氧化能力越高。根据表 2结果得知，诃子、虎杖、大黄、荷叶的清除DPPH自由基能力无显著差异(P＞0.05)，虎杖、大黄、荷叶、肉桂的清除DPPH自由基能力无显著差异(P＞0.05)。8种天然植物的清除DPPH自由基能力大小排序为诃子≥虎杖≥荷叶≥大黄≥肉桂＞侧柏叶＞车前草＞甘草。清除DPPH自由基能力最强的是诃子。
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表 2 8种天然植物的清除DPPH自由基能力 Table 2 DPPH free radical scavenging capacity of 8 kinds of natural plants (n=3) |
由表 3结果可知，0.5、1.0、2.0 mg/mL组细胞存活率与模型组相比均有所提高且随天然植物水提物浓度的升高而增加。浓度为0.5 mg/mL时，8种天然植物组的细胞存活率排序为诃子＞肉桂＞荷叶≥大黄≥虎杖≥侧柏叶≥甘草≥车前草，细胞存活率分别为(140.84±0.07)%、(90.82±0.03)%、(65.68±0.02)%、(64.49±0.03)%、(60.58±0.02)%、(50.56±0.01)%、(53.50±0.06)%、(53.87±0.01)%。浓度为1.0 mg/mL时，8种天然植物组的细胞存活率排序为诃子＞肉桂≥荷叶≥虎杖＞侧柏叶≥大黄≥甘草≥车前草，细胞存活率分别为(180.36±0.07)%、(90.38±0.04)%、(74.51±0.02)%、(73.27±0.04)%、(52.74±0.02)%、(61.27±0.04)%、(56.03±0.01)%、(58.77±0.03)%。浓度为2.0 mg/mL时，8种天然植物组的细胞存活率排序为诃子＞虎杖≥肉桂≥荷叶＞大黄≥侧柏叶≥甘草≥车前草，细胞存活率分别为(211.34±0.05)%、(102.32±0.07)%、(94.58±0.04)%、(88.66±0.02)%、(76.95±0.05)%、(60.30±0.03)%、(59.49±0.02)%、(62.65±0.03)%。3个浓度下8种天然植物处理后的细胞存活率排序基本一致。诃子水提物在浓度为0.5 mg/mL时细胞存活率就能达到对照组水平，且比对照组高出40.84%；3个浓度的肉桂水提物均能使细胞存活率达到90%以上；诃子对损伤细胞的修复能力最强，最弱的为甘草和车前草。
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表 3 8种天然植物对H2O2损伤细胞存活率的影响(相对于对照组) Table 3 Effects of 8 kinds of natural plants on survival rate of H2O2 injured cells (relative to control group) (n=6) |
以H2O2作为造模剂构建体外氧化损伤模型的研究已经有很多报道，如人、大鼠、小鼠、建鲤、斜带石斑鱼等肝细胞或其他细胞的氧化损伤模型[13-16]，而关于建立草鱼肝细胞氧化损伤模型的报道极少。由于细胞种类和性质不同，对外界应激的耐受程度不同，因此以H2O2为造模剂建模的标准和模型检验方法也不完全相同[17]。细胞存活率是表征细胞状态的基础指标，直接反映外界刺激对细胞的损伤程度。很多报道都以细胞存活率作为建模基础标准，细胞存活率不能过低或者过高，过低(< 50%)表明大量细胞可能发生不可逆损伤，不利于氧化机制的研究；过高(>70%)则说明细胞状态良好，没造成明显的氧化损伤，不利于后期试验的进展[18]。细胞存活率在50%~70%时能作为建立模型的基础标准。
检验建模成功与否的指标较多，包括LDH活性、MDA含量、SOD活性、ROS水平和细胞凋亡率等。LDH存在于活细胞胞浆中，当细胞膜受损时，LDH会渗出到细胞外，通过检测培养液中LDH活性就可判断细胞膜的完整性，从而判断细胞损伤程度[19]。MDA是自由基作用于脂质发生过氧化反应后产生的，MDA含量的多少能够反映机体脂质过氧化的程度，间接反映细胞的损伤程度[20]。SOD是体内重要的抗氧化酶，催化过氧阴离子发生歧化反应，清除多余自由基，作为各种器官组织中第1道抗氧化防御系统，防止自由基对细胞结构的损伤，SOD活性的变化能反映机体清除氧自由基的能力[21]。细胞中ROS水平和细胞凋亡率直接体现细胞的氧化应激水平。本试验结果显示，用200 μmol/L H2O2处理细胞1.0 h后，与对照组相比，培养液中LDH活性升高13.88%，细胞中MDA含量增加5.56%、SOD活性降低24.49%，细胞凋亡率增加68.08%，细胞中ROS水平增加43.28%，且与对照组的差异均达到显著水平，该处理可作为建立草鱼原代肝细胞氧化损伤模型的条件。
3.2 应用草鱼原代肝细胞氧化损伤模型评价8种天然植物的抗氧化能力植物多酚广泛存在于天然植物中，多酚类化合物主要包括黄酮类化合物、酚酸类化合物，这也是植物提取物发挥抗氧化活性的主要成分。植物多酚的抗氧化作用体现在它能够清除自由基、抑制氧化酶活性、提高抗氧化酶活性[22]。外源性的抗氧化剂能够调节机体内抗氧化平衡，研究天然植物的抗氧化能力对抗氧化剂的筛选具有重要意义。
诃子的主要活性成分包括诃子多酚、鞣质类、三萜皂苷、诃子多糖等[23]；虎杖中主要含有蒽醌类、芪类、黄酮类和酚类等活性成分[24]；肉桂的主要活性成分是肉桂油，其中肉桂醛的含量是最高的，除此之外还有萜类、苯丙素类、酚苷类、黄酮类等活性成分[25]；大黄的主要活性成分包括大黄素、大黄酸、大黄酚和大黄素甲醚在内的游离蒽醌[26]；荷叶的主要活性成分包括多种生物碱类、黄酮类、挥发油类、多糖类有机酸类等[27]；车前草含有多糖类、黄酮类、萜类和挥发油等活性成分[28]；侧柏叶中的主要活性成分是挥发油、黄酮、鞣质等[29]；甘草中的主要活性成分有三萜类、黄酮类和甘草多糖类[30]。8种天然植物都含有抗氧化多酚类化合物，多酚类化合物可通过氢自由基淬灭体内的ROS，抑制卵磷脂脂质过氧化损伤。多酚类化合物可激活抗氧化信号通路、缓解应激、调节抗氧化酶的表达，从而减少氧化损伤。诃子的多酚含量达到13.27%，这是8种天然植物中诃子的抗氧化能力最强的主要原因[31]。有关研究报道，诃子对小鼠有明显的抗氧化作用，能够保护肝细胞[32]。
通过细胞模型试验评价天然植物的体外抗氧化能力，并结合化学分析法测定天然植物对自由基的清除能力，既能通过细胞模型试验评价天然植物的抗氧化能力，又可以根据天然植物对损伤细胞的影响来检测细胞模型建立的是否成功[33]。有文献报道抗氧化能力即为清除相关自由基的能力[34]。通过进一步比较分析表 2和表 3的数据发现，8种天然植物水提物对氧化应激损伤细胞修复能力的强弱顺序与8种天然植物清除DPPH自由基能力的高低顺序基本一致。诃子的氧化损伤修复能力最强，0.5 mg/mL的诃子水提物修复损伤细胞12 h后，细胞存活率比对照组还高出40.84%；诃子的IC50值最小，清除DPPH自由基能力最高。0.5 mg/mL的车前草和甘草水提物修复损伤细胞12 h后，细胞存活率升高不明显；车前草和甘草的IC50值最大，清除DPPH自由基能力最弱。以上结果表明天然植物对细胞氧化损伤修复作用与每种天然植物的抗氧化能力(清除DPPH自由基能力)的高低有关。
从本试验结果分析，H2O2处理相同时间时，细胞存活率随H2O2浓度的升高而降低。同一浓度H2O2处理细胞，随着处理时间的延长，细胞存活率有先降低后升高的趋势。这可能是由于H2O2对细胞具有双向反应，细胞随时间变化对H2O2的削弱作用加强，从而刺激细胞增长。200 μmol/L H2O2处理1.0 h时细胞存活率为(64.85±0.38)%，符合建模要求的细胞存活率范围(50%~70%)。从细胞形态来看，200 μmol/L H2O2组部分细胞出现细胞膜边缘模糊，细胞少量皱缩，胞内颗粒变多，但大多数细胞呈现完整细胞状态，利于后期抗氧化物质筛选的研究。细胞内ROS水平随H2O2浓度的增加呈现先升高后降低的趋势，可能是因为高浓度的H2O2导致大量细胞坏死，细胞破裂，未检测到细胞内的ROS，具体机制还需进一步研究。在损伤后的细胞培养液中添加天然植物水提物能够提高细胞的存活率，对损伤细胞具有一定的修复能力，且修复效果与天然植物本身抗氧化能力的高低有关，天然植物能够修复氧化应激损伤的细胞，进一步验证了本试验所筛选的H2O2浓度和处理时间能成功构建草鱼原代肝细胞氧化损伤模型。
4 结论① 以草鱼原代肝细胞作为试验对象，以含10%胎牛血清的M199培养基为培养液，在5% CO2、27 ℃培养条件下，以培养液中终浓度为200 μmol/L的H2O2为造模剂、处理肝细胞1 h，可以成功构建草鱼原代肝细胞氧化损伤模型，模型特征为细胞存活率在50%~70%，细胞表现为明显的氧化损伤，且出现细胞凋亡，细胞凋亡率在30%~50%。
② 本试验利用H2O2构建的草鱼原代肝细胞氧化损伤模型可以用于天然植物抗氧化能力的评价和抗氧化损伤修复天然植物的筛选，在所评价的8种天然植物中，以诃子的抗氧化能力最佳且氧化损伤修复能力最强。
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