2. 大连成三畜牧业有限公司, 大连 116000
2. Dalian Chengsan Animal Husbandry Co., Ltd., Dalian 116000, China
现代集约化养殖模式下，“饲料禁抗”与非洲猪瘟给生猪健康养殖带来严峻的挑战。具有抗菌抗炎、提高免疫力和增强抗氧化能力的绿色饲料添加剂的开发与应用是提升猪只健康水平和改善肉品质的重要手段，也是饲料营养领域研究的热点之一。壳寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)是甲壳素脱乙酰后的壳聚糖经降解而得的2~10个氨基葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的低聚糖。COS具有黏度低、水溶性好的优点，能够更好地被细胞吸收利用[1]，从而更好地发挥其抗炎、抗菌、抗氧化和免疫调节等生物学功能[2-4]，在提高动物生产性能、增强机体免疫功能以及调节动物肠道菌群平衡等方面发挥着重要作用[5]。
COS在动物营养中的应用多在水产养殖业和家禽业，对猪的研究则主要集中断奶仔猪与母猪，COS对猪生长育肥阶段的影响则报道较少。而生长育肥阶段是商品猪养殖周期中持续时间最长的阶段，也是直接影响肉品质优劣的关键时期。因此，本研究旨在探索COS对生长育肥猪生长性能、肉品质、抗氧化功能以及免疫功能的影响，在此基础上探讨添加COS能否降低生产成本，提高经济效益，为COS在生猪产业中的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验COS以米糠粕为载体，添加COS混合物300 mg/kg，COS的有效含量为10%，由某生物科技有限公司提供。
1.2 试验动物和试验设计试验选取体重[(37.00±1.55) kg]相近“杜×长×大”生长猪225头，随机分成3组，每组3个重复，每个重复25头。对照组饲喂基础饲粮，COS组饲喂添加30 mg/kg COS的基础饲粮，低能低蛋白质+COS组饲喂添加30 mg/kg COS的低能低蛋白质饲粮(粗蛋白质含量降低1个百分点，消化能降低0.21 MJ/kg)。基础饲粮参照NRC(2012)营养需要配制，其组成及营养水平见表 1。饲粮按试验期分3个阶段：生长期(30~65 kg)、育肥前期(66~90 kg)和育肥后期(91 kg至出栏)。试验前对猪舍进行消毒，试验期间每天06:00、11:00和17:00饲喂3次，自由采食，自由饮水。试验期98 d。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrition levels of basal diets (air-dry basis) |
试验开始和结束时，以栏(重复)为单位测定各组试验猪空腹体重，统计每个重复试验猪的总采食量，并计算平均日采食量、平均日增重和料重比。
1.3.2 样品采集与处理试验结束时，禁食12 h后，每组选取6头体重接近平均体重的试验猪颈静脉采血后屠宰，血液样品于促凝管中室温放置30 min，离心(3 000 r/min，15 min)，分装血清于1.5 mL离心管，储存在-20 ℃，用于血清免疫和抗氧化指标的检测。取每头猪的肝脏组织，采用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，迅速切小块并转移至液氮中，存于-80 ℃，用于肝脏抗氧化相关基因表达的测定。试验猪屠宰后，分离并取出背最长肌用于肉品质的检测。
1.3.3 肉品质测定肌肉pH24 h和滴水损失的测定参照《猪肌肉品质测定技术规范》(NY/T 821—2004)进行测定，肌肉肉色采用色差仪检测背最长肌亮度(L*)、红度(a*)和黄度(b*)值，肌肉样品的剪切力参照《肉嫩度的测定剪切力测定法》(NY/T 1180—2006)进行测定，肌苷酸含量采用高效液相色谱仪分析测定。
肌肉样品中水解氨基酸的测定方法：称取0.5 g样品装于安培瓶中，加入10 mL 6 mol/L的盐酸溶液，封口。105 ℃恒温烘箱，水解24 h。冷却后转移至蒸馏瓶中，用0.02 mol/L盐酸溶液冲洗安培瓶中残留的溶液2~3次，调节65 ℃水浴锅至蒸发干。移取20 mL 0.02 mol/L盐酸溶液至蒸馏瓶中，溶解后取2 mL溶液于25 mL容量瓶中，用上述盐酸溶液定容。取合适量过滤后用L-8900型氨基酸自动分析仪测定肌肉样品中水解氨基酸的含量。
1.3.4 血清免疫指标检测血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、补体3(C3)和补体4(C4)含量的测定严格按照深圳迈瑞提供的试剂盒说明书进行。IgA、IgG和IgM试剂盒检测范围分别为0.025~0.800 g/L、2~20 g/L和0.4~2.6 g/L，最低检出限为0.01、0.5和0.05 g/L；C3和C4试剂盒检测范围分别为0.01~3.00 g/L和0.005~2.000 g/L，最低检出限分别为0.005和0.002 g/L。
1.3.5 血清抗氧化指标检测血清总抗氧化能力(T-AOC)的测定采用铁离子还原法，血清丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法。测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，2种试剂盒检测范围分别为0.2~55.2 U/mL和1~113 nmol/mL，最低检出限分别为0.2 U/mL和0.2 nmol/mL。
1.3.6 肝脏抗氧化相关基因表达测定采用实时荧光定量PCR技术检测肝脏抗氧化基因谷胱甘肽过氧化物酶1(GPx1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和p53的mRNA相对表达量。肝脏组织中总RNA的提取和质量检测参照井洋洋等[6]的方法进行。然后根据cDNA合成试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]合成cDNA，-20 ℃保存。利用Applied Biosystems公司StepOne PlusTM仪器进行实时荧光定量PCR检测，引物序列见表 2，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。实时荧光定量PCR反应体系为10 μL：SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa，日本) 5 μL，上游、下游引物各0.5 μL，cDNA 4 μL。PCR扩增条件为：95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，共40个循环。内参基因为β-肌动蛋白(β-actin)，目的基因mRNA相对表达量的计算采用2-△△Ct法。
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表 2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for real-time fluorescent quantitative PCR |
试验结束时，禁食12 h后，每个重复随机选择2头试验猪屠宰，按组织学准确区分各肠段，然后分别取试验猪的十二指肠近端、空肠中段和回肠远端各2 cm，在PBS中将肠断的内容物漂洗干净后，用4%多聚甲醛固定液固定。之后进行脱水、石蜡包埋、切片及苏木精-伊红(HE)染色。使用光学显微镜(Carl Zeiss，德国)观察HE染色后的肠道组织切片，然后用软件Motic Images 2000进行不同肠断切片绒毛高度和隐窝深度的测量，并计算绒毛高度与隐窝深度的比值。
1.4 数据处理试验数据利用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05表示差异显著，数据结果以“平均值±标准误”表示。
2 结果与分析 2.1 COS对生长育肥猪生长性能的影响由表 2可知，与对照组相比，COS组生长育肥猪平均日增重无显著差异(P>0.05)，但料重比显著降低了4.7%(P < 0.05)；而低能低蛋白质+COS组生长育肥猪平均日增重和料重比均无显著差异(P>0.05)。这表明，在适当降低饲粮粗蛋白质和消化能水平的情况下，饲粮添加30 mg/kg COS可在降低饲粮成本的前提下不影响生长育肥猪的生长性能。
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表 2 COS对生长育肥猪生长性能的影响 Table 2 Effects of COS on growth performance of growing-finishing pigs |
由表 3可知，各组生长育肥猪屠宰后背最长肌24 h的pH均在正常值5.6~6.0，且差异不显著(P>0.05)。在肉色方面，与对照组相比，COS组生长育肥猪背最长肌L*值显著降低(P < 0.05)，背最长肌a*值和b*值无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，COS组和低能低蛋白质+COS组生长育肥猪背最长肌滴水损失和剪切力均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，COS组与低能低蛋白质+COS组生长育肥猪背最长肌肌苷酸含量显著提高了24.4%和19.6%(P < 0.05)。
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表 3 COS对生长育肥猪肉品质的影响 Table 3 Effects of COS on meat quality of growing-finishing pigs |
对于水解氨基酸而言，由表 4可知，与对照组相比，COS组生长育肥猪背最长肌谷氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸含量显著提高(P < 0.05)，而低能低蛋白质+COS组与对照组相比则无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，COS组和低能低蛋白质+COS组生长育肥猪背最长肌异亮氨酸含量均显著降低(P < 0.05)。
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表 4 COS对生长育肥猪背最长肌水解氨基酸组成的影响 Table 4 Effects of COS on hydrolytic amino acid composition in longissimus dorsi of growing-finishing pigs |
由图 1可知，与对照组相比，COS组生长育肥猪血清T-AOC显著提高(P < 0.05)，而低能低蛋白质+COS组则无显著差异(P>0.05)。同样，与对照组相比，COS组生长育肥猪血清MDA含量显著降低(P < 0.05)，而低能低蛋白质+COS组则无显著差异(P>0.05)。
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数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。图 2同。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as Fig. 2. 图 1 COS对生长育肥猪血清抗氧化指标的影响 Fig. 1 Effects of COS on antioxidant indices in serum of growing-finishing pigs |
由图 2可知，与对照组相比，COS组生长育肥猪肝脏GPx1 mRNA相对表达量显著提高(P < 0.05)，COS组和低能低蛋白质+COS组生长育肥猪肝脏GPx4 mRNA相对表达量均显著提高(P < 0.05)。此外，COS组生长育肥猪肝脏p53 mRNA相对表达量显著高于对照组(P < 0.05)，而COS组和低能低蛋白质+COS组生长育肥猪肝脏Cu/Zn-SOD mRNA相对表达量与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。
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图 2 COS对生长育肥猪肝脏抗氧化相关基因表达的影响 Fig. 2 Effects of COS on antioxidation-related gene expression in liver of growing-finishing pigs |
由表 5可知，与对照组相比，COS组生长育肥猪血清IgG和IgM含量显著提高(P < 0.05)，低能低蛋白质+COS组生长育肥猪血清IgM含量显著提高(P < 0.05)；其中，COS组血清IgG含量比对照组提高了15.0%(P < 0.05)，血清IgM含量提高了6.0%(P < 0.05)。此外，与对照组相比，COS组和低能低蛋白质+COS组生长育肥猪血清C4含量均显著提高(P < 0.05)，而COS组和低能低蛋白质+COS组生长育肥猪血清C3含量均无显著差异(P>0.05)。
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表 5 COS对生长育肥猪免疫功能的影响 Table 5 Effects of COS on immune function of growing-finishing pigs |
由图 3和表 6可知，COS组和低能低蛋白质+COS组生长育肥猪十二指肠、空肠和回肠绒毛高度和隐窝深度与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，COS组生长育肥猪十二指肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著提高(P < 0.05)，而低能低蛋白质+COS组十二指肠、空肠和回肠绒毛高度与隐窝深度的比值与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。
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图 3 COS对生长育肥猪肠道黏膜形态的影响 Fig. 3 Effects of COS on intestinal mucosa morphology of growing-finishing pigs |
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表 6 COS对生长育肥猪肠道黏膜形态的影响 Table 6 Effects of COS on intestinal mucosa morphology of growing-finishing pigs |
目前，COS对猪生长性能影响的研究多集中在仔猪上，在生长育肥猪中的研究较少，而生长育肥阶段是商品猪养殖周期中持续时间最长、消耗饲粮最多的阶段，因此，研究COS对生长育肥猪饲料转化率以及生长性能的影响具有重要意义。Yang等[7]研究表明，饲粮添加0.04%和0.06%COS均可显著提高断奶仔猪的平均日增重；魏亚浩等[8]研究表明，仔猪饲粮添加COS复合物能够提高仔猪平均日采食量和平均日增重；Liu等[9]也研究表明，饲粮添加100和200 mg/kg COS能够显著提高断奶仔猪平均日采食量和平均日增重，降低料重比，同时能够显著提高断奶仔猪对饲粮总能、干物质和粗蛋白质的消化率；Walsh等[10]在断奶仔猪饲粮中添加不同分子量的COS，发现分子量在5~50 ku的COS能够显著提高断奶仔猪平均日增重和降低料重比，同时能提高粪便中乳酸菌数量和降低大肠杆菌数量。以上研究均提示COS在改善仔猪生长性能方面具有良好的效果。在生长育肥猪上，杨伟丽等[11]研究表明，饲粮添加40 mg/kg低聚壳聚糖能够显著提高生长育肥猪平均日采食量，可在一定程度上提高平均日增重和降低料重比。本研究结果表明，基础饲粮中添加30 mg/kg COS能够显著降低生长育肥猪料重比，提高饲料利用率；同时，在低能低蛋白质饲粮中添加30 mg/kg COS对生长育肥猪的平均日增重和料重比均无显著影响，这表明在降低饲料生产成本的前提下，添加COS具有良好的经济效益。COS对动物生长性能的改善作用可能与其对肠道功能的改善有关。研究表明，COS能够增强肠道消化吸收功能、改善肠道微生物环境和改善肠道形态，以此达到提高饲料利用率的效果[12]。
3.2 COS对生长育肥猪肉品质的影响近年来猪肉品质越来越受到消费者关注，肉品质主要由肌肉的理化特性所决定，其化学组成与肌肉的营养价值密切相关，而物理指标如系水力、嫩度和肉色等则直接影响着消费者对肌肉的感官感受。肌苷酸是肌肉在熟化过程中产鲜味的重要物质，也是肌肉中提供鲜味最重要的物质之一。Koohmaraie等[13]研究发现，饲粮添加COS可提高肉仔鸡肌肉中肌苷酸的含量，进而提高肌肉风味。本试验也发现，生长育肥猪饲粮添加30 mg/kg COS可显著提高背最长肌中肌苷酸的含量。对于氨基酸而言，常将天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸这6种具有鲜味的氨基酸称为鲜味氨基酸。吕成才等[14]报道了在黄河鲤鱼饲粮中添加不同水平COS改变了肌肉氨基酸的组成；董琦等[15]报道了在刺参饵料中添加0.5% COS能够改变刺参体壁氨基酸组成。本试验结果表明，基础饲粮添加COS能够提高生长育肥猪背最长肌中谷氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸这3种鲜味氨基酸的含量。Yin等[16]研究表明，在生长猪饲粮中添加0.01%COS能够促进氨基酸进入门静脉，提高生长猪机体蛋白质合成，其潜在的机制可能与COS调控后肠菌群参与氨基酸的代谢有关。相关报道也提出低聚木糖可能通过调控后肠菌群的氨基酸和蛋白质代谢，进而影响生长育肥猪肌肉氨基酸的组成[17-18]。此外，李阳[19]研究表明，饲粮添加120 mg/kg COS显著提高肉鸡肌肉a*值。本试验结果表明，饲粮添加COS显著降低生长育肥猪背最长肌L*值，改善肉色。脂质氧化是影响肉品质的重要因素，并影响诸如味道、香气、颜色、质地和营养价值等属性[20]，COS抗氧化作用可能是其改善肉质的重要的原因之一。目前关于COS对肉品质改善的作用机理尚不明确，有待进一步研究。
3.3 COS对生长育肥猪抗氧化功能的影响在生长育肥猪养殖过程中，许多因素会导致机体内产生大量自由基，当机体处在正常的代谢状态时，机体会处在不断产生自由基与清除自由基的动态平衡状态。而在养殖过程中此动态平衡被破坏时，如饲料污染、高温、高代谢负担以及长时间运输等均会造成机体产生过多的自由基，而过多的自由基会与组织、血液或细胞等相结合，造成氧化损伤，影响动物机体的免疫功能[21-22]。COS抗氧化性的研究表明，COS清除自由基的能力会随着COS水平的提高而增强，其作用机制可能是COS分子中的铵根离子所提供的单电子是清除自由基的根源。申杰等[23]在对COS保护小鼠肝脏的试验中发现，COS可降低小鼠血清MDA含量，并可显著抑制由高血脂导致的脂质过氧化物大量堆积而对肝脏的氧化损伤。陈伟军等[24]报道了饲粮中添加COS能够提高凡纳滨对虾血清T-AOC和超氧化物歧化酶(SOD)活性，降低肌肉组织中的MDA含量。Xie等[25]研究表明，妊娠母猪饲粮中添加COS可显著提高血浆SOD活性，血浆MDA含量呈下降趋势，胎盘组织中抗氧化基因，如Cu/Zn-SOD和过氧化氢酶(CAT)的mRNA表达量提高，提示妊娠后期母猪饲粮中添加COS可增强母猪的抗氧化功能。在断奶仔猪上，刘媛媛等[26]研究表明，饲粮添加COS能够显著提高断奶仔猪血清SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和T-AOC，改善机体的抗氧化功能。本试验结果表明，基础饲粮添加COS可显著提高生长育肥猪血清T-AOC，并显著降低血清MDA含量；在肝脏抗氧化指标方面，本试验结果也表明，COS组生长育肥猪肝脏抗氧化基因GPx1、GPx4和p53的mRNA相对表达量均显著提高。这些结果提示COS能够提高生长育肥猪机体抗氧化功能，从而缓解生长育肥猪在养殖过程中氧化应激对机体造成的损伤。
3.4 COS对生长育肥猪免疫功能的影响血清中免疫球蛋白和补体的含量可反映机体免疫能力的强弱。免疫球蛋白是体液免疫应答中的重要免疫成分，在抗原刺激的情况下可转为抗体，发挥抗菌、抗病毒的功能[27]。机体补体系统是免疫系统中重要的部分，C3是激活补体途径中重要的中心环节，C4是激活补体途径中的重要组成成分，可协同抗体发挥对病原微生物的清除作用。COS能够作用于机体免疫器官和免疫细胞，并影响相关免疫细胞因子的表达和分泌从而调节机体的免疫。刘莹莹等[28]研究表明，母猪饲粮中添加低聚壳聚糖能够提高母猪初乳中IgG、IgA和IgM含量，同时提高仔猪血清IgG和IgA含量。Ho等[29]也报道了在母猪妊娠后期补充COS会显著提高母猪和仔猪血清IgM、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量及母猪粪便中sIgA含量。陈虹等[30]在鹌鹑饲粮中添加COS可以显著提高鹌鹑血清C3含量。孙梦洁[31]研究发现，在俄罗斯鲟基础饲粮中添加COS也能够显著提高血清C3含量。本试验结果表明，饲粮添加30 mg/kg COS也可显著提高生长育肥猪血清中IgG和IgM的含量，同时也显著提高血清C4含量；此外，在低能低蛋白质饲粮中添加30 mg/kg COS也可显著提高血清IgM和C4含量，这提示饲粮中添加COS具有提高生长育肥猪血清免疫功能的作用。
3.5 COS对生长育肥猪肠道黏膜形态的影响肠道是机体对营养物质进行消化吸收的重要场所，肠绒毛是小肠的重要组成，不仅对营养物质的吸收起到至关重要的作用，而且绒毛规律的摆动也可阻止有害微生物的定植[32]。绒毛高度增长可导致小肠与营养物质的接触面积增加，从而增加小肠对营养的吸收能力，因此小肠绒毛高度与机体的生长性能紧密相关[33]。研究表明，COS能够促进肠道隐窝细胞增殖活性来改善肠道形态，从而提高养分消化利用效率[34]。史宇涛等[35]研究发现，饲粮中添加COS能够提高白羽肉鸡十二指肠绒毛高度，降低空肠隐窝深度。张鑫海等[36]也报道了饲粮中添加COS可显著降低断奶仔猪空肠隐窝深度。Walsh等[37]研究表明，饲粮中添加COS可提高断奶仔猪十二指肠及空肠的绒毛高度和绒毛高度与隐窝深度的比值，从而提高机体对营养物质的吸收能力。本试验结果表明，COS能够提高生长育肥猪十二指肠的绒毛高度与隐窝深度的比值。结合生长性能结果，饲粮添加COS显著降低了生长育肥猪的料重比，提示COS可能是通过提高小肠绒毛高度与隐窝深度的比值，提高肠道的消化吸收能力，进而提高生长育肥猪对饲粮的利用效率。
4 结论本研究结果表明，基础饲粮添加30 mg/kg COS能够显著降低生长育肥猪的料重比，提高饲料转化率。低能低蛋白质饲粮中添加30 mg/kg COS对生长育肥猪的生长性能无显著影响，表明在降低饲粮成本的前提下，添加COS具有良好的经济效益。此外，基础饲粮中添加COS可在一定程度上提高生长育肥猪肌肉中风味物质肌苷酸、谷氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸的含量。同时，基础饲粮中添加COS可以增强生长育肥猪免疫功能和抗氧化功能以及改善肠道黏膜形态。
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