2. 山东省济南市畜牧技术推广站, 济南 250100;
3. 济南市莱芜黑兔种业科技有限公司, 济南 250100
2. Shandong Province Jinan Animal Husbandry Technology Extension Station, Jinan 250100, China;
3. Jinan Laiwu Black Rabbit Seed Industry Technology Co., Ltd., Jinan 250100, China
生姜在我国种植面积达200万hm2，全国每年生姜秸秆产量约1 000万t。然而在山东莱芜、安丘、昌邑等生姜主产区，生姜秸秆被随意抛弃焚烧，造成资源浪费和环境污染[1]。随着家兔生产的规模化，常规饲料资源日益缺乏，给养兔业的发展带来了巨大的挑战。挖掘非常规饲料、拓宽饲料种类是促进家兔生产持续健康发展的关键。因此，因地制宜地利用生姜秸秆既能减少资源浪费，又能缓解养兔业发展带来的粗饲料资源短缺的问题。花生是我国北方地区的重要经济作物，其收获后的副产物花生秧是家兔生产中最为经常使用的粗饲料原料[2-4]。目前，人们对生姜的研究主要集中在地下块茎，且生姜粉作为绿色饲料添加剂具有改进畜禽生长性能、提高抗氧化性能的作用[5]。然而关于地上部分生姜秸秆作为草食动物粗饲料原料的研究尚未见报道，生姜秸秆作为家兔粗饲料原料替代花生秧在家兔生产上的应用尚少有人进行研究。莱芜黑兔为肉用型兔，主产于鲁中地区，具有抗逆性强、繁殖力高、肉质好等突出特点，2021年，莱芜黑兔被列入国家畜禽遗传资源目录(中华人民共和国农业农村部公告第381号)。目前，莱芜黑兔是我国北方地区唯一1个家兔地方品种资源，开发利用莱芜黑兔对推动我国北方地区的兔肉消费、促进我国养兔业均衡持续发展具有重要意义。本课题组前期饲养试验结果表明，饲粮适宜比例(5%和10%)的生姜秸秆替代花生秧对育肥期莱芜黑兔生长性能无不良影响，但高水平替代组(15%组)的采食量提高，增长速度变慢，饲料转化率降低[6]。因此，本试验以莱芜黑兔为研究对象，进一步探讨饲粮中不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔胃肠道发育、小肠组织形态结构、盲肠发酵和盲肠内容物微生物区系的影响，为生姜秸秆作为粗饲料原料在家兔生产上应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计试验选用45日龄、体重相近、健康状况良好的莱芜黑兔160只，按性别和体重随机分为4组，每组5个重复，每个重复8只(公母各占1/2)，分为4笼饲养，每笼2只(兔舍结构为半封闭式，自然采光和自然通风)。4组试验兔分别饲喂以生姜秸秆替代0(A组，对照组)、5%(B组)、10%(C组)和15%(D组)花生秧的全价配合饲料。试验所用生姜秸秆和花生秧营养组成见表 1。饲粮参考NRC(1977)[7]和De Blas等[8]的育肥兔饲养标准配制而成，其组成及营养水平见表 2。预试期7 d，正试期47 d。试验期间，试验兔每天饲喂2次，自由采食和自由饮水。
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表 1 生姜秸秆和花生秧营养组成(风干基础) Table 1 Nutrient composition of ginger straw and peanut seedling (air-dry basis) |
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表 2 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) |
试验结束当天，每个重复选取与该重复平均体重相近的1只公兔和1只母兔称重并测量体长(即每组屠宰10只，共屠宰40只)后屠宰，结扎消化道相应部位，剥离肠系膜，用软尺测定小肠自然长度即为小肠长度。根据以下公式计算小肠相对长度：
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胃、小肠和大肠(含内容物)结扎称量总重后，用流水将肠道内容物冲洗掉，滤纸蘸去水分后即为胃、小肠和大肠重量(净重)，结扎后的胃、小肠、大肠的总重量减去其相应净重即为内容物的重量。根据以下公式计算其相对重量：
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采集3 cm空肠样品置于4%多聚甲醛固定液体固定，待测样本固定状态良好后，严格按照病理实验检测标准程序(SOP)程序进行修剪、脱水、包埋、切片、染色、封片。使用正置白光拍照显微镜(Nikon，Eclipse Ci-L)拍照，选取小肠组织的目的区域进行40倍成像，成像时尽量让组织充满整个视野，保证每张照片的背景光一致。成像完成后使用Image-Pro Plus 6.0分析软件，统一以μm作为标准单位，分别测量每张切片中5处完整肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度、黏膜层厚度和肌层厚度，求取平均值作为最终值，同时计算绒毛高度/隐窝深度。
1.2.3 盲肠发酵指标的测定采用安捷伦公司(Agilent Technologies Inc.美国)的7890-5977气质联用仪对盲肠内容物挥发性脂肪酸进行靶向代谢物检测。色谱系统采用的是Agilent气相色谱系统(Agilent 7890；Agilent Technologies，美国)，根据化合物的性质，采用HP-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)气相色谱柱，进样量为1 μL，分流比10 ∶ 1，载气为高纯氦气，流速1.0 mL/min；柱温箱的初始温度为70 ℃，保持5.0 min，以6 ℃/min程序升温至100 ℃。质谱采用四极杆质谱检测系统(Agilent 5977；Agilent Technologies，美国)，配有电子轰击离子源和Mass Hunter工作站。采用电子轰击离子源，分析物在单离子检测扫描模式下进行检测。优化的质谱分析条件为进样口温度260 ℃，四级杆温度150 ℃。
1.2.4 盲肠微生物多样性的测定采集盲肠内容物样品液氮保存，送至北京诺禾致源科技股份有限公司提取DNA，基于Illumina Nova测序平台测序，构建PCR-free文库，然后进行双末端(paired-end)测序，检测微生物多样性。
1.3 数据处理所有检测指标均为每个重复的公母试验兔结果求取平均值作为该重复的最终值，用SAS 9.1.3统计软件中的GLM进行数据的方差分析，用Duncan氏法进行数据的多重比较，结果以平均值(mean)±标准误(SE)表示，P＜0.05为差异显著水平。
2 结果与分析 2.1 饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔胃肠道发育的影响由表 3可以看出，饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔胃相对重量、胃内容物相对重量和大肠内容物相对重量有显著影响(P＜0.05)，其中C组和D组胃相对重量显著高于B组和A组(P＜0.05)；D组胃内容物相对重量显著高于其他各组(P＜0.05)；B组、C组、D组大肠内容物相对重量显著高于A组(P＜0.05)。饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔小肠相对重量、小肠相对长度、小肠内容物相对重量和大肠相对重量无显著影响(P>0.05)。
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表 3 饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔胃肠道发育的影响 Table 3 Effects of different ratios of ginger straw substituted for peanut seedling in diets on gastrointestinal tract development of Laiwu black rabbits |
由表 4可以看出，饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔小肠肌层厚度有显著影响(P＜0.05)，其中D组显著高于A组、B组、C组(P＜0.05)。饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔小肠绒毛高度、绒毛宽度、隐窝深度和黏膜层厚度以及绒毛高度/隐窝深度等均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔小肠组织形态结构的影响 Table 4 Effects of different ratios of ginger straw substituted for peanut seedling in diets on morphology and structure of small intestine of Laiwu black rabbits |
由表 5可以看出，饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔盲肠内容物中乙酸、丙酸和丁酸含量以及乙酸/(丙酸+丁酸)有显著影响(P＜0.05)，其中D组乙酸含量以及乙酸/(丙酸+丁酸)显著高于A组、B组、C组(P＜0.05)，丙酸和丁酸含量显著低于A组和B组(P＜0.05)。饲粮不同生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔盲肠内容物pH、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和总挥发性脂肪酸含量无显著影响(P>0.05)。
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表 5 饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔盲肠发酵的影响 Table 5 Effects of different ratios of ginger straw substituted for peanut seedling in diets on cecal fermentation of Laiwu black rabbits |
通过对Reads拼接，平均每样品测得106 055条tags，经过质控平均得到100 906条有效数据，质控有效数据量达65 066，质控有效率达61.39%。以97%的一致性将序列聚类成为操作分类单元(OTUs)，共得到1 586个OTUs，然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释，并对不同分类层级统计，发现能够注释到数据库的OTUs数目为1 578个(99.50%)，注释到界水平的比例为99.50%，门水平的比例为96.22%，纲水平的比例为92.31%，目水平的比例为82.53%，科水平的比例为73.08%，属水平的比例为27.18%，种水平的比例为8.20%。注释结果中，共有431个OTUs注释到属水平(27.18%)；各组OTUs数量见图 1。
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A、B、C、D分别代表饲粮生姜秸秆替代花生秧比例为0、5%、10%和15%组。下图同。 A, B, C and D represented the groups with 0, 5%, 10% and 15% ginger straws replacing peanut seedlings, respectively. The same as below. 图 1 OTUs个数统计图 Fig. 1 Statistical graph of OTUs counts |
在门水平上，莱芜黑兔盲肠内容物微生物占主导地位的主要包括厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、软壁菌门(Tenericutes)；在纲水平上，占主导地位的为梭菌纲(Clostridia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、柔膜菌纲(Mollicutes)；在目水平上，优势物种为梭菌目(Clostridiales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、芽孢杆菌目(Bacillales)；在科水平上，优势物种为瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、鼠杆菌科(Muribaculaceae)；在属水平上，优势物种为未鉴定瘤胃球菌科(unidentified_Ruminococcaceae)、乳头杆属(Papillibacter)、别样杆菌属(Alistipes)；优势种为梭状芽孢杆菌([Clostridium]_papyrosolvens)、瘤胃球菌(Ruminococcus_bromii)、瘤胃细菌_NK4A214(rumen_bacterium_NK4A214)。
2.4.3 α多样性分析稀释曲线是生态学领域的一种常用方法，通过从每个样本中随机抽取一定数量的序列(即在不超过现有样本测序量的某个深度下进行重抽样)，可以预测样本在一系列给定的测序深度下，可能包含的物种总数及其中每个物种的相对丰度。随着测试深度不断增加，OTUs稀释曲线逐渐上升，最后趋于平缓(图 2-A)，说明本研究测序深度较为合理。等级聚类曲线可直观地反映样品中物种的丰富度和均匀度(图 2-B)。以OTUs排序编号为横坐标，OTUs相对丰度为纵坐标的等级聚类曲线，在水平方向上，曲线在横轴上跨度即曲线宽度可以反映物种丰富度；在垂直方向上，曲线的平滑程度反映了样本中物种的均匀程度。
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图 2 OTUs稀释曲线(A)和等级聚类曲线(B) Fig. 2 OTUs dilution curve (A) and hierarchical clustering curve (B) |
蜜蜂群图展示所有样本不同组别间的物种总数的散点分布，即丰富度。通过Wilcoxon秩和检验，测得的物种数在各组间差异不显著(P>0.05；图 3-A)。图 3-B为Shannon指数的比较图，Shannon指数在A组和D组间具有显著差异(P＜0.05)，说明A组和D组间物种整体群落结构存在一定差异；Shannon指数在C组和D组、B组和D组、A组和B组间差异不显著(P>0.05)，说明C组和D组、B组和D组、A组和B组间物种整体群落结构相似。
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*表示组间差异显著(P＜0.05)。 * represented sinificant difference between groups (P < 0.05). 图 3 可见物种指数组间差异蜜蜂群图(A)和Shannon指数组间差异蜜蜂群图(B) Fig. 3 Bees warm graph of difference between observed-species index among groups (A) and differences between Shannon index among groups (B) |
基于OTUs水平的主成分分析(PCA)结果见图 4。应用PCA，能够提取出最大程度反映样本间差异的2个坐标轴，从而将多维数据的差异反映在二维坐标图上，进而揭示复杂数据背景下的简单规律。本研究结果表明，不同组间在PCA图中的距离比较接近，说明各组盲肠内容物群落组成相似。
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图 4 基于OTUs水平的主成分分析 Fig. 4 Principal component analysis based on OTUs level |
基于OTUs水平的Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离进行主坐标分析(PCoA)，结果见图 5，并选取贡献率最大的主坐标组合进行作图展示，群落结构相似度高的样本倾向于聚集在一起，群落差异很大的样本则会远远分开。图中各组间样本距离接近，也表明各组盲肠内容物群落组成相似。
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图 5 基于Weighted Unifrac距离PCoA分析(A)和基于Unweighted Unifrac距离PCoA分析(B) Fig. 5 PCoA analysis based on Weighted Unifrac distance (A) and Unweighted Unifrac distance based on PCoA analysis (B) |
利用Meta Stat方法对组间的物种丰度数据进行假设检验，筛选具有显著性差异的物种，并绘制差异物种在组间的丰度分布箱图，各组间在门水平和属水平上丰度分布箱图分别见图 6-A和图 6-B。
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Firmicutes: 厚壁菌门；Tenericutes: 软壁菌门；Synergistetes: 互养菌门；Euryarchaeota: 广古菌门；Bacteroidetes: 拟杆菌门；Chloroflexi: 绿弯菌门；Protecbacteria: 变形菌门；unidentified_Bacteria: 未经鉴定的细菌门；Verrucomicrobia: 疣微菌门；Melainabacteria: 黑水仙菌门; Oxalobacter: 草酸杆菌属；unidentified_Christensenellaceae: 未经鉴定的克里斯滕森菌属；Rikenella: 理研菌属；Tyzzerella: 毛螺菌属；Oscillibacter: 口腔杆菌属；Mailhella: 梅伊拉菌属；Rurniricicoccus: 乳虹膜球菌瘤胃菌属；Butyricicoccus: 丁酸球菌属；Intestinimonas: 肠杆菌属；Methanobrevibacter: 甲烷杆菌属；unidentified_Enterobacteriaceae: 未经鉴定的肠杆菌科；Bacillus 芽孢杆菌属；Roseburia: 罗氏菌属；Soehngenia: 毛螺菌属；Exiguobacterium: 微小杆菌属；Phascolarctobacterium: 考拉杆菌属；Candidatus_Saccharimonas: 酵母梭菌属；Alistipes: 另枝菌属；Marvinbryantia: 马文布氏菌属；Aminivibrio: 氨基酸降解菌属；unidentified_Ruminococcaceae: 未经鉴定的瘤胃球菌科；Anaeroplasma: 厌氧原体属；Subdoligranulum: 罕见小球菌属；Papillibacter: 乳头杆菌属；Bacteroides: 拟杆菌属；Thauera: 索氏菌属；Syntrophobacter: 互营杆菌属；unidentified_Clostridiales: 未经鉴定的梭菌目；Butyricimonas: 丁酸弧菌属；unidentified_Lachnospiraceae: 未经鉴定的毛螺菌科；Desulfovibrio: 脱硫弧菌属；Campylobacter: 弯曲菌属；Odoribacter: 臭杆菌属；Akkermarisia: 嗜黏蛋白菌属；Parabacteroides: 副拟杆菌属。 图 6 门水平组间群落组成分析(A)和属水平组间群落组成分析(B) Fig. 6 Analysis of community composition among groups at phylum level (A) and genus level (B) |
利用Tax4 Fun软件，基于16S Silva数据库对莱芜黑兔盲肠内容物微生物等进行功能预测，注释结果表明排名靠前的功能信息有新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理等(图 7)。
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Metabolism: 新陈代谢；Genetic_Information_Processing: 遗传信息处理；Enviromental_Information_Processing: 环境信息处理；Cellular_ Processing: 细胞处理；Unclassified: 未经鉴定分类；Human_Diseases: 人类疾病；Organismal_Systems: 生物系统；Others: 其他。 图 7 Tax4 Fun功能注释相对丰度柱形图 Fig. 7 Column chart of relative abundance of Tax4 Fun function notes |
家兔是一种小型草食性动物，作为非反刍单胃草食动物，盲肠和结肠在消化系统中占有重要地位，具有消化多种粗饲料的能力。粗饲料是家兔饲粮的主要成分，粗饲料类型及粗纤维水平不仅对家兔具有营养价值，而且对消化道的形态和功能的发育成熟，调控其肠道健康具有重要作用[9-10]。Tao等[11]研究发现，随着饲粮中中性洗涤纤维水平升高，家兔的胃、盲肠和结肠净重以及结肠的长度都相应增加。胃和盲肠内容物重量反映了采食和软粪产生的昼夜节律。Chao等[12]研究报道，家兔的盲肠内容物的相对重量都随着饲粮酸性洗涤纤维水平升高而增加。García等[13]的研究发现，不同粗饲料类型能够影响家兔采食量和食糜在盲肠的停留时间，且随着饲粮中性洗涤纤维水平的增加提高了盲肠内容物与体重的比值。本研究发现，胃、胃内容物相对重量和大肠内容物相对重量均随着饲粮生姜秸秆替代花生秧比例的提高而增大，这可能与生姜秸秆中中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维水平高于花生秧密切相关，饲粮纤维水平升高导致家兔采食量增加[6]。
3.2 饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔小肠组织形态结构的影响小肠是家兔消化道营养吸收的主要部位，饲粮纤维水平及类型能够影响小肠组织形态结构。Yu等[14]报道，喂饲55~145 g/kg粗纤维的生长兔中，空肠绒毛高度发生轻微变化。Chiou等[15]研究表明，不同纤维类型能够影响家兔空肠和结肠绒毛高度和肌层厚度，并影响十二指肠和回肠的隐窝深度。然而，Xiccato等[16]并没有检测到饲粮纤维/淀粉比率对家兔小肠绒毛高度和隐窝深度产生显著影响。本研究表明，饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔小肠绒毛高度、绒毛宽度和黏膜层厚度等影响均无显著差异，但15%替代组的小肠肌层厚度明显提高，这可能是由该组饲粮中纤维水平高于其他各组所致。
3.3 饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔盲肠发酵的影响家兔盲肠内存在有大量的微生物，盲肠微生物能够发酵纤维素产生挥发性脂肪酸为家兔提供能量。盲肠挥发性脂肪酸含量随着饲粮中糖醛酸和中性洗涤纤维含量的增加而升高，随着木质素含量的增加而下降[12]。Chiou等[15]利用分离出的饲粮纤维组分(纤维素、果胶和木质素)和苜蓿干草饲喂家兔，试验结果也表明，木质素会抑制盲肠挥发性脂肪酸的产生。乙酸是家兔盲肠挥发性脂肪酸的重要组成部分，其次是丁酸，最少的是丙酸，其组成与饲粮纤维含量和类型密切相关[12]。本研究发现，饲粮不同生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔盲肠内容物pH及总挥发性脂肪酸含量无显著影响，但挥发性脂肪酸组成(乙酸、丙酸和丁酸含量)发生变化，这是由生姜秸秆和花生秧2种不同粗饲料原料的纤维组分不同所致。
3.4 饲粮不同比例生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔盲肠内容物微生物区系的影响盲肠微生物群落是在长期进化过程中形成的，与宿主保持相对平衡的稳定状态，在营养物质新陈代谢和肠道黏膜免疫调节等方面发挥着重要作用，是一个复杂的微生态系统[17]。肠道微生物菌群和宿主的生态平衡可维持动物机体肠道健康和生产性能提高。高通量测序技术是研究动物肠道微生物多样性的主要手段。本试验通过稀释曲线、丰度等级曲线分析，得到测序深度充分、测序量合理、足以覆盖群落物种组成，能够真实反映群落各物种间的相对比例关系。本研究发现，家兔盲肠内容物在门水平上相对丰度最大是厚壁菌门，其次是拟杆菌门，厚壁菌门与碳水化合物和蛋白质的吸收有关，拟杆菌门主要是促进碳水化合物发酵、吸收和降解多糖，这两大菌门的稳定对促进肉兔肠道健康十分重要，这与许多研究所得家兔盲肠微生物的结果[18-21]相一致。Abecia等[22]报道，饲粮是影响笼养家兔盲肠微生物组成比例的主要因素，本研究也发现饲粮适宜比例生姜秸秆替代花生秧后莱芜黑兔盲肠内容物微生物区系无明显变化，过量替代后微生物区系会发生变化。
4 结论饲粮适宜比例(5%~10%)的生姜秸秆替代花生秧对莱芜黑兔的胃肠道发育、小肠组织形态结构、盲肠发酵和盲肠内容物微生物区系无明显不良影响，生姜秸秆可用作家兔粗饲料原料在生产上使用。
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