2. 扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225009
2. College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
随着家禽集约化养殖的快速推进,我国肉鹅生产水平得到了巨大提高,但获得较快生长速度的同时,营养过剩和体脂、腹脂比例偏高的问题也日益突出。家禽的肝脏是机体脂肪代谢的主要场所,大约90%的脂肪代谢发生在肝脏,肝细胞增殖及肝细胞内脂肪合成的强弱直接影响家禽体内脂肪的沉积。因此,以鹅胚原代肝细胞做模型,研究甜菜碱对其脂质代谢的作用具有很好的指导作用。国内外大量研究均表明,甜菜碱(三甲基甘氨酸)属季胺型生物碱,能参与脂肪代谢,改善胴体组成,显著降低动物肝脏中脂肪含量和体内脂肪[1]。目前,甜菜碱作为饲料添加剂在畜禽生产中得到了大量的推广和应用,甜菜碱也是机体中非常重要的甲基供体,其通过控制甲基化反应的程度参与表观遗传调控,说明外源摄入甲基供体甜菜碱能改变机体的表观遗传学特征[2]。
泛酰巯基乙胺酶-1(VNN-1)能催化辅酶A和酰基载体蛋白的异化途径中D-泛酰巯基乙胺的水解,产生泛酸(维生素B5)和巯基乙胺[3],其在脂类代谢中发挥重要作用,Rommelaere等[4]对VNN-1缺陷小鼠进行基因芯片分析,发现了一系列差异表达基因富集在脂肪酸代谢、甘油酯类代谢和类固醇生物合成等途径,说明VNN-1基因甲基化水平及其通路在介导甜菜碱调控鹅脂肪酸合成方面起关键作用[5]。DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基添加到胞嘧啶的第5位碳原子(5mC)的过程[6]。甜菜碱作为甲基供体在鹅中调控脂肪代谢与DNA甲基化的关系及其机制仍不明确。VNN-1基因的表达调控是否受其DNA甲基化的水平的调控,需进一步验证研究。
本研究以鹅胚原代肝细胞为试验对象,研究不同浓度甜菜碱培养液对鹅胚原代肝细胞DNA甲基化相关酶活性和VNN-1启动子区域DNA甲基化的影响,通过DNA甲基化酶抑制剂(AZA)探索VNN-1启动子区域DNA甲基化调控基因表达的分子机制。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试验动物试验所用江南白鹅种蛋购自常州市四季禽业有限公司。种蛋孵化温度为37.5 ℃,相对湿度为75%~80%,转蛋周期为2 h/次。
1.1.2 试剂RNA提取试剂盒、反转录PCR试剂盒和实时定量PCR(Real-time qPCR)试剂盒购自北京天根科技生化有限公司;试验用甜菜碱、甲基化酶抑制剂购自美国Sigma公司,外观为白色至浅黄色粉末或微颗粒,流散性好,纯度≥98%;EZ DNA Methylation-GoldTM、BigDye Terminator v1.1、POP-7TM Polymer和HiDiFormamide购自ThermoFisher公司;胎牛血清(FBS)、胶原酶消化液、DMEM培养基购自Gibco公司;引物、Taq Plus DNA聚合酶购自上海生工生物有限公司;其余一般化学试剂均为国产分析级。
1.2 试验方法 1.2.1 鹅胚肝细胞分离与培养采用23胚龄受精种鹅蛋分离原代肝细胞,原代细胞的分离采用胶原酶消化法进行,分离和培养参照本实验室前期建立的方法[7]。获取鹅原代肝细胞后于5% CO2、40 ℃培养,收集处于指数生长期的细胞,以1×108个/L接种于培养板,隔天换液。使用倒置生物显微镜观察细胞,分别选取培养12、24和36 h的原代肝细胞进行拍照并记录细胞形态及生长状况。
1.2.2 试验设计 1.2.2.1 试验1:甜菜碱对鹅胚原代肝细胞DNA甲基化相关酶活性和VNN-1启动子区域DNA甲基化的影响以鹅原代肝细胞为研究对象,获取鹅原代肝细胞后于5% CO2、40 ℃培养,分别以0(对照)、2.5、5.0和10.0 mmol/L甜菜碱的培养液继续培养48 h。每组6个重复,每个孔为1个重复,培养液中甜菜碱的浓度参照杨雨等[8]。采用全自动生化分析测定肝细胞中高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)含量(由扬州诺明哲天医学检测实验室测定)。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法检测肝细胞中DNA甲基转移酶活性(ELISA试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司,货号:YB-DNMT-Gu)。采用ELISA方法检测肝细胞中SAM和S-腺苷同型半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine,SAH)含量(ELISA试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司,货号:YB-SAM-Gu和YB-SAH-Gu),计算SAM/SAH比值。采用Real-time qPCR方法检测肝细胞中VNN-1的基因表达量。采用亚硫酸氢盐处理(bisulfite sequencing PCR,BSP)后,测序检测VNN-1启动子区域DNA甲基化水平。
1.2.2.2 试验2:AZA对鹅胚原代肝细胞VNN-1和脂肪酸合成酶(FAS)基因表达的影响以鹅原代肝细胞为研究对象,获取鹅原代肝细胞后于5% CO2、40 ℃培养,分为4个组,每组6个重复,每个孔为1个重复,分别以正常培养液(对照组)、含5 μmol/L的AZA培养液(AZA组)、含5.0 mmol/L甜菜碱培养液(甜菜碱组)、含5 μmol/L的AZA和5.0 mmol/L甜菜碱培养液(AZA+甜菜碱组)继续培养96 h。AZA 5-氮杂-2-脱氧胞苷(A3656,Sigma公司)配制成5 μmol/L的培养基,AZA浓度参考Wu等[9],分别在处理后的0、24、48、96 h,采用Real-time qPCR方法检测肝细胞中VNN-1和FAS的基因表达量。
1.3 测定方法 1.3.1 细胞总RNA的提取与反转录根据微量总RNA提取试剂盒操作说明提取试验处理后的鹅胚原代肝细胞总RNA。加入1 mL Trizol充分匀浆,室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿,振荡15 s,静置2 min。4 ℃ 12 000×g离心15 min,弃上清。加入0.5 mL异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10 min。4 ℃ 12 000×g离心10 min,弃上清。加入1 mL 75%乙醇,轻轻洗涤沉淀。4 ℃ 7 500×g离心5 min,弃上清。晾干,加入适量ddH2O溶解。将部分总RNA溶液稀释成300 ng/μL工作液,于-20 ℃保存,剩余总RNA原液于-70 ℃保存备用。RNA反转录为cDNA于-20 ℃保存备用。
1.3.2 Real-time qPCR检测以β-肌动蛋白(β-actin)基因为内参,釆用SYBR-Green法对肝脏基因表达量进行相对定量分析。反应体系为20 μL:SYBR Premix Ex Taq (2×) 10 μL,上、下游引物和ROX Reference Dye Ⅱ(50×)各0.4 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 6.8 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性30 s后,95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,共40个循环。熔解曲线绘制:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s。基因引物信息见表 1。
首先采用亚硫酸氢钠处理样品,PCR纯化产物连接到pUC18-T载体10个克隆,连接反应体系:18 ℃连接过夜。连接产物转化后制备感受态细胞,将细菌涂布在预先用20 μL 100 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和100 μL 20 mg/mL X-gal涂布的氨苄青霉素平板上,倒置培养过夜。蓝白斑筛选:选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落,用牙签挑至含氨苄青霉素的液体培养基,37 ℃培养过夜。目的片段TA克隆,3%糖凝胶电泳检测菌落PCR鉴定。质粒提取和质粒测序M13+/-引物测序。采用软件DNAStar分析基因序列,采用SeqMan软件进行序列比对,采用QUMA做甲基化圆点图。检测的VNN-1基因片段中含有13个CpG位点。在序列中的位置如下:34、78、141、160、203、244、258、271、279、304、316、328、362。编号为1~13位。基因引物信息见表 1。
1.4 数据统计分析采用Excel 2017建立数据库,SPSS 17.0统计对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。方差分析采用一般线性模型,显著性检验采用LSD法,以P<0.05作为差异显著性判断标准,数据以平均值和均值标准误(SEM)表示。
2 结果与分析 2.1 不同浓度甜菜碱对鹅胚原代肝细胞HDL和LDL含量的影响由表 2可知,2.5、5.0和10.0 mmol/L甜菜碱组肝细胞LDL含量显著低于对照组(P<0.05)。培养液中甜菜碱浓度对HDL含量无显著影响(P>0.05)。
由表 3可知,鹅肝细胞中SAM/SAH比值随着甜菜碱浓度的增加呈上升趋势,呈显著一次线性关系(P<0.05)。甜菜碱浓度对鹅肝细胞中DNA甲基转移酶活性无显著影响(P>0.05)。
由图 1可知,5.0和10.0 mmol/L甜菜碱组肝细胞VNN-1基因表达量显著低于对照组和2.5 mmol/L甜菜碱组(P<0.05)。
由图 2可知,5.0和10.0 mmol/L甜菜碱组肝细胞VNN-1基因启动子区域DNA甲基化水平显著高于对照组(P<0.05)。
由图 3-a可知,与对照组相比,AZA处理0 h时,不同处理对鹅胚原代肝细胞VNN-1基因表达量无显著影响(P>0.05)。处理24和48 h时,VNN-1基因表达量趋势相同,AZA组VNN-1基因表达量与对照组差异不显著(P>0.05),甜菜碱组和AZA+甜菜碱组VNN-1基因表达量相比对照组显著下降(P<0.05);AZA处理96 h时,各组VNN-1基因表达量差异显著,AZA组和AZA+甜菜碱组肝细胞中VNN-1基因表达量显著高于对照组(P<0.05),甜菜碱组VNN-1基因表达量相比对照组显著降低(P<0.05)。
由图 3-b可知,与对照组相比,AZA处理后0和24 h,不同处理对鹅胚原代肝细胞FAS基因表达量无显著影响(P>0.05);处理48 h时,肝细胞中AZA组FAS基因表达量相比对照组显著升高(P<0.05);处理96 h时,AZA组和AZA+甜菜碱组FAS基因表达量相比对照组显著升高(P<0.05)。
3 讨论 3.1 甜菜碱对鹅胚原代肝细胞DNA甲基化相关酶活性和VNN-1启动子区域DNA甲基化的影响大量研究均表明,甜菜碱作为营养调节剂在降低动物肝脏中脂肪含量和体内脂肪有重要作用[10-11]。本试验研究发现,甜菜碱处理鹅胚原代肝细胞后,其LDL含量显著降低,LDL是富含胆固醇的脂蛋白,是运载胆固醇进入外周组织细胞的脂蛋白颗粒,说明甜菜碱能抑制肝细胞的脂质积累。Zhan等[12]发现肉仔鸡饲粮中添加甜菜碱可显著降低血清甘油三脂和尿酸含量,甜菜碱能通过自身代谢循环,加速动物体内磷脂合成,完善细胞膜的形成,促进肝脏中载脂蛋白的合成,使甘油三酯的迁移速度加快,降低血清甘油三酯含量[13]。由此可见,甜菜碱在促进肝脏脂肪代谢方面有重要作用。
甲基供体SAM提供一碳单位后产生SAH,SAH经转变后产生高半胱氨酸(Hcy)。SAM/SAH比值会影响DNA甲基化,DNMT的活性依赖于SAM的生成量和SAH的消耗量。当SAM/SAH比值升高会伴随着全身DNA高甲基化[14]。所以,SAM/SAH比值被认为是判断DNA甲基化程度的关键指标[15]。本试验研究发现,鹅胚原代肝细胞中添加甜菜碱能提高SAM/SAH比值,提高细胞整体的DNA甲基化水平,表明甜菜碱作为甲基供体能够促进鹅胚原代肝细胞甲基化水平,Abobaker等[16]也发现了相似的结果,母猪饲粮中添加甜菜碱显著提高子代胆固醇和皮质类固醇基因表达,且伴随着启动子区域的低甲基化,甜菜碱可以通过表遗传机制调节新生仔猪肝脏中的胆固醇代谢基因的表达。
VNN-1是泛酰巯基乙胺的水解酶,大鼠和小鼠基因芯片分析均发现VNN-1与肝脏脂肪变性密切相关,其在脂质代谢过程中有重要的调控作用[17-18]。李洁等[19]扩增鹅Vanin基因亚型(VNN-1)基因的cDNA序列时发现,鹅VNN-1基因(GenBank登录号: KY399733)cDNA全长为1 924 bp,该基因在肝脏中高表达,共编码491个氨基酸。VNN的表达调控与肝脏脂肪代谢相关基因过氧化物酶体增殖体激活受体α(PPARα)密切相关[20-21]。禁食和饲喂降脂药的野生型小鼠VNN-1的表达量明显升高,而在PPARα缺陷小鼠中没有提高,PPARα可以通过与VNN-1启动子上的特异性结合为点结合促进VNN-1基因表达,揭示其潜在的脂质代谢调控作用[22]。本试验研究发现,甜菜碱能提高肝细胞中VNN-1基因启动子区域DNA甲基化水平,但其基因表达量显著降低,表明基因的高甲基化会干扰基因的转录水平,DNA甲基化是由DNA甲基酶催化的表观遗传因素,基因启动子区域的DNA甲基化与基因表达水平一般呈负反馈调节,甜菜碱作为公认的甲基供体,能提高VNN-1基因启动子区域的甲基化,且负反馈调节其基因表达。
3.2 AZA对鹅胚原代肝细胞VNN-1和FAS基因表达的影响为进一步研究DNA甲基化对VNN-1基因表达的调控机制,本试验还研究了AZA和甜菜碱处理对VNN-1和FAS基因表达的影响。AZA是一种脱氧胞苷,其在DNA复制过程中加入到DNA链中,另一端能与DNMT结合,影响DNMT发生作用,影响DNA甲基化水平,是一种AZA[23-24]。本试验中,AZA处理96 h时,VNN-1和FAS基因表达量均发生显著变化,AZA组和AZA+甜菜碱组VNN-1基因表达显著提高,进一步验证了VNN-1的高表达与DNA去甲基化相关。FAS是脂肪酸合成的主要调节酶,能够催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A生成长链脂肪酸,对脂肪酸合成有重要作用[25]。处理48 h时,AZA组的FAS基因表达量比对照组显著上升,也说明了FAS基因的高表达与DNA去甲基化相关。本研究结果与Shen等[26]研究结果相一致。Li等[27]也发现,母猪饲粮中添加甜菜碱可以通过改变胰岛素生长因子2(insulin-like growth factors 2,IGF2)的DMR甲基化状态来影响海马神经元的增殖。Ling等[28]发现基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)启动子区含有多种去甲基化的CpG位点,高糖能通过去甲基化介导MMP9表达。Nishizawa等[29]发现,AZA处理通过去甲基化增强5-氟脲嘧啶的表达,以上结果说明DNA去甲基化通常都伴随着基因表达的提高,均与本试验结果趋势一致。
4 结论鹅胚原代肝细胞培养液中添加甜菜碱能抑制肝细胞的脂质积累,提高细胞总体的DNA甲基化水平,且VNN-1启动子区域的甲基化负反馈调节其基因表达。AZA抑制DNA甲基化后发现VNN-1和FAS的高表达与DNA去甲基化相关。
[1] |
ALIREZAEI M, GHEISARI R H, RANJBAR R V., et al. Betaine: a promising antioxidant agent for enhancement of broiler meat quality[J]. British Poultry Science, 2012, 53(5): 699-707. DOI:10.1080/00071668.2012.728283 |
[2] |
YANG S, ZHAO N N, SUN B, et al. Grandmaternal betaine supplementation enhances hepatic IGF2 expression in F2 rat offspring through modification of promoter DNA methylation[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2020, 100(4): 1486-1494. DOI:10.1002/jsfa.10156 |
[3] |
PITARI G, MAURIZI G, FLATI V, et al. Enzymatic synthesis of S-aminoethyl-L-cysteine from pantetheine[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA): General Subjects, 1992, 1116(1): 27-33. DOI:10.1016/0304-4165(92)90124-D |
[4] |
ROMMELAERE S, MILLET V, MANH T P V, et al. Sox17 regulates liver lipid metabolism and adaptation to fasting[J]. PLOS One, 2014, 9(8): e104925. DOI:10.1371/journal.pone.0104925 |
[5] |
NAQUET P, PITARI G, DUPRÈ S, et al. Role of the Vnn1 pantetheinase in tissue tolerance to stress[J]. Biochemical Society Transactions, 2014, 42(4): 1094-1100. DOI:10.1042/BST20140092 |
[6] |
JELTSCH A. Beyond Watson and Crick: DNA methylation and molecular enzymology of DNA methyltransferases[J]. ChemBioChem, 2002, 3(4): 275-293. |
[7] |
洪胜辉, 张军, 张蕊, 等. 鹅原代肝细胞的简易、高纯分离及培养[J]. 江苏农业科学, 2012, 40(4): 56-58. HONG S H, ZHANG J, ZHANG R, et al. Simple and high purity isolation and culture of goose primary hepatocytes[J]. Jiangsu Agricultural Science, 2012, 40(4): 56-58 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1002-1302.2012.04.017 |
[8] |
杨雨, 阳金金, 万雨, 等. 饲粮中添加甜菜碱对仔鹅生长性能及其调控因子的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(9): 4140-4147. YANG Y, YANG J J, WAN Y, et al. Effects of dietary betaine on growth performance, and its regulating factors of geese[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(9): 4140-4147 (in Chinese). |
[9] |
WU X, OUYANG Y, WANG B, et al. Hypermethylation of the IRAK3-activated MAPK signaling pathway to promote the development of glioma[J]. Cancer Management and Research, 2020, 7(12): 7043-7059. |
[10] |
YANG Z, WANG Z Y, YANG H M, et al. Effects of dietary methionine and betaine on slaughter performance, biochemical and enzymatic parameters in goose liver and hepatic composition[J]. Animal Feed Science and Technology, 2017, 228: 48-58. DOI:10.1016/j.anifeedsci.2017.04.003 |
[11] |
ZHANG L F, QI Y L, ALUO Z, et al. Betaine increases mitochondrial content and improves hepatic lipid metabolism[J]. Food & Function, 2018, 10(1): 216-223. |
[12] |
ZHAN X A, LI J X, XU Z R, et al. Effects of methionine and betaine supplementation on growth performance, carcase composition and metabolism of lipids in male broilers[J]. British Poultry Science, 2006, 47(5): 576-580. DOI:10.1080/00071660600963438 |
[13] |
SAUNDERSON C L, MACKINLAY J. Changes in body-weight, composition and hepatic enzyme activities in response to dietary methionine, betaine and choline levels in growing chicks[J]. British Journal of Nutrition, 1990, 63(2): 339-349. DOI:10.1079/BJN19900120 |
[14] |
SINGHAL N K, STERNBACH S, FLEMING S, et al. Betaine restores epigenetic control and supports neuronal mitochondria in the cuprizone mouse model of multiple sclerosis[J]. Epigenetics, 2020, 15(8): 871-886. DOI:10.1080/15592294.2020.1735075 |
[15] |
WEICKHMANN A K, KELLER H, WURM J P, et al. The structure of the SAM/SAH-binding riboswitch[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 47(5): 2654-2665. DOI:10.1093/nar/gky1283 |
[16] |
ABOBAKER H, HU Y, OMER N A, et al. Maternal betaine suppresses adrenal expression of cholesterol trafficking genes and decreases plasma corticosterone concentration in offspring pullets[J]. Journal of Animal Science and Biotechnology, 2019, 10(1): 87-97. DOI:10.1186/s40104-019-0396-8 |
[17] |
JONES P A, LIANG G N. Rethinking how DNA methylation patterns are maintained[J]. Nature Reviews Genetics, 2009, 10(11): 805-811. DOI:10.1038/nrg2651 |
[18] |
CHEN S Y, ZHANG W X, SUN C, et al. Systemic nanoparticle-mediated delivery of pantetheinase Vanin-1 regulates lipolysis and adiposity in abdominal white adipose tissue[J]. Advanced Science, 2020, 7(14): 2000542. DOI:10.1002/advs.202000542 |
[19] |
李洁, 周浩, 郁建锋, 等. 鹅VNN1基因的克隆及组织表达分析[J]. 南京农业大学学报, 2018, 41(1): 140-146. LI J, ZHOU H, YU J F, et al. Cloning and tissue expression analysis of VNN1 gene in geese[J]. Journal of Nanjing Agricultural University, 2018, 41(1): 140-146 (in Chinese). |
[20] |
VAN DIEPEN J A, JANSEN P A, BALLAK D B, et al. PPAR-alpha dependent regulation of vanin-1 mediates hepatic lipid metabolism[J]. Journal of Hepatology, 2014, 61(2): 366-372. DOI:10.1016/j.jhep.2014.04.013 |
[21] |
CHEN S Y, ZHANG W X, TANG C Q, et al. Vanin-1 is a key activator for hepatic gluconeogenesis[J]. Diabetes, 2014, 63(6): 2073-2085. DOI:10.2337/db13-0788 |
[22] |
ROMMELAERE S, MILLET V, GENSOLLEN T, et al. PPARalpha regulates the production of serum Vanin-1 by liver[J]. FEBS Letters, 2013, 587(22): 3742-3748. DOI:10.1016/j.febslet.2013.09.046 |
[23] |
CHEN X, XING M. Effects of 5-Aza-2'-deoxycytidine on hormone secretion and epigenetic regulation in sika deer ovarian granulosa cells[J]. Reproduction In Domestic Animals, 2021, 56(2): 360-369. DOI:10.1111/rda.13873 |
[24] |
CARVALHO C D S, FERNANDES M N. Effect of copper on liver key enzymes of anaerobic glucose metabolism from freshwater tropical fish Prochilodus lineatus[J]. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology, 2008, 151(3): 437-442. |
[25] |
王昕源, 张雨, 杨楠, 等. DNMT3a通过提升基因内部甲基化介导紫杉醇诱导的LINE-1异常表达[J]. 遗传, 2020, 42(1): 100-111. WANG X Y, ZHANG Y, YANG N, et al. DNMT3a mediates paclitaxel-induced aberrant LINE-1 expression through elevated internal gene methylation[J]. Genetics, 2020, 42(1): 100-111 (in Chinese). |
[26] |
SHEN J, LIU Y L, REN X C, et al. Changes in DNA methylation and chromatin structure of pro-inflammatory cytokines stimulated by LPS in broiler peripheral blood mononuclear cells[J]. Poultry Science, 2016, 95(7): 1636-1645. DOI:10.3382/ps/pew086 |
[27] |
LI X, SUN Q W, LI X, et al. Dietary betaine supplementation to gestational sows enhances hippocampal IGF2 expression in newborn piglets with modified DNA methylation of the differentially methylated regions[J]. European Journal of Nutrition, 2015, 54(7): 1201-1210. DOI:10.1007/s00394-014-0799-4 |
[28] |
LING L, CHEN L B, ZHANG C N, et al. High glucose induces podocyte epithelial-to-mesenchymal transition by demethylation-mediated enhancement of MMP9 expression[J]. Molecular Medicine Reports, 2018, 17(4): 5642-5651. |
[29] |
NISHIZAWA Y, IKEDA R, YAMAMOTO M, et al. 5-aza-2-deoxycytidine enhances the sensitivity of 5-fluorouracil by demethylation of the thymidine phosphorylase promoter[J]. Anticancer Research, 2019, 39(8): 4129-4136. DOI:10.21873/anticanres.13571 |