2. 江苏三仪科研质量控制中心, 邳州 221300
2. Jiangsu Sanyi Scientific Research Quality Control Center, Pizhou 221300, China
家禽是全球范围内广泛生产加工的肉用动物。过去,使用抗生素促进家禽生长和控制肠道疾病是一种常态。但是,在禁抗政策大环境下,绿色环保的抗生素替代制剂成为了研究热点,并取得了一些成功,抗生素替代制剂具有作为生长促进剂的功能,并具有调节肠道菌群的有益作用。其中,表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)是重要的生长因子家族成员,具有促进营养物质转运,促进细胞分化、生长、迁移、增殖、免疫,促进伤口和骨骼愈合等生物学功能。EGF对细胞过程的刺激作用是通过与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)结合以及EGF与EGFR相互作用而诱导的细胞内信号转导,包括丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)和细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase,ERK)而产生的[1]。有研究表明,EGF具有耐酸、耐蛋白酶消化和耐热的良好性质,因而可以长时间作用于肠道,提高肠细胞吸收营养物质的能力[2]。EGF可通过钠离子通道蛋白及中性氨基酸转运蛋白等的调节作用促进肠道对营养物质的吸收[3]。研究发现,EGF能诱导多种动物的减数分裂恢复,包括大鼠[4]、人和小鼠[5]、狗[6]、羊[7]、马[8]和猪[9]。EGF的刺激作用是猪卵母细胞成熟的重要因素,EGF对卵母细胞的刺激作用不仅影响细胞内信号转导,而且影响高尔基体与内质网之间的相互作用,而这种作用是由转运蛋白介导的[10]。已有研究表明,断奶仔猪灌服表达EGF的重组酿酒酵母菌发酵液可以显著提高各段小肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度及其蛋白质、DNA与RNA的表达,降低肠上皮细胞的通透性[11]。Ge等[12]认为EGF可能是鸡生殖细胞增殖的重要调节因子,并可能调节胚胎性腺的生殖细胞增殖。综上所述,研究通过EGF缓解和改善畜牧生产过程中的不利影响一直都是畜牧业备受关注的热点问题。然而,目前国内外有关EGF的报道都集中在哺乳动物方面,而有关EGF在肉鸡生产中的应用研究鲜有报道。因此,本试验旨在研究EGF对不同日龄肉鸡十二指肠形态结构、消化酶活性以及EGFR表达的影响,以期为EGF在肉鸡养殖中进一步推广和应用奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试验设计EGF为可溶性粉剂。盐酸金霉素购于美国Sigma公司。
选择72只1日龄健康的爱拔益加(AA)肉鸡,随机分成4组,每组3个重复,每个重复6只。对照组(CK组)饲喂基础饲粮,抗生素组(K组)在基础饲粮中添加250 mg/kg盐酸金霉素,EGF组(E组)在基础饲粮中添加500 mg/kg EGF,EGF+抗生素组(E+K组)在基础饲粮中添加500 mg/kg EGF+250 mg/kg盐酸金霉素。试验期为42 d。
1.2 基础饲粮和饲养管理基础饲粮参照NRC(1994)和《中国饲料成分及营养价值表》(2018年第29版)配制,其组成及营养水平见表 1。肉鸡饲养于铁丝笼中,整个饲养过程中自由采食和饮水。试验第1周室温32 ℃,光照24 h;之后室温每周降低2 ℃,直至24 ℃,同时光照23 h。所有肉鸡在7和13日龄接种新城疫灭活疫苗,20日龄接种传染性法氏囊病活疫苗。
分别在肉鸡21、28、35、42日龄时,各组每个重复随机挑选1只肉鸡进行屠宰(屠宰前不禁食),采取颈动脉放血致死,结扎并采集十二指肠中上部组织样品2 cm2,并用磷酸盐缓冲液冲洗干净,滤纸吸干,放入加有4%多聚甲醛的离心管中,4 ℃保存,用于观察十二指肠的形态结果及原位杂交;另外,取十二指肠内容物(约10 g)并用4层纱布过滤,置于10 mL离心管中,立即放入液氮中,之后于-80 ℃冰箱中冻存,用于消化酶活性测定。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 十二指肠消化酶活性测定采用双抗体夹心法分别测定肉鸡十二指肠内容物样品中碱性蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶活性,检测方法按照试剂盒说明书操作,试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。
1.4.2 十二指肠EGFR原位杂交采用荧光原位杂交技术(详细方法参见文献[13]),将双侧地高辛标记的已知顺序的核酸探针与组织切片中核酸进行杂交,从而对特定核酸顺序进行精确定量定位。EGFR探针信息如下:5′-DIG-GCCGCAGGTAAAGACCGATGCCTAGACCAA-DIG-3′。
1.4.3 十二指肠形态结构将4%甲醛溶液固定的十二指肠的肠段包埋于液体石蜡中,凝固后以5 μm的厚度切片,采用苏木精-伊红(HE)染色法进行染色并封片。在显微镜下随机选取10个视野进行拍照,分别量取十二指肠的绒毛高度和隐窝深度,并计算绒毛高度/隐窝深度。
1.5 数据处理与统计分析使用SPSS 24.0、CaseViewer和Image-pro plus数据分析软件进行分析,作图软件使用Graphpad prism 8.0,并对数据进行单因子方差分析(one-way ANOVA)。数据以平均值±标准差(mean±SD)表示,P < 0.05表示差异显著,P < 0.01表示差异极显著。
2 结果 2.1 EGF对肉鸡十二指肠消化酶活性的影响 2.1.1 EGF对肉鸡十二指肠碱性蛋白酶活性的影响由表 2可见,21日龄时,K组十二指肠碱性蛋白酶活性显著低于其他各组(P < 0.05),E+K组十二指肠碱性蛋白酶活性稍高于E组(P>0.05);28、35、42日龄时,各组十二指肠碱性蛋白酶活性无显著差异(P>0.05),但E组十二指肠碱性蛋白酶活性均为最高。
由表 3可见,21、28、35、42日龄时,各组十二指肠脂肪酶活性无显著差异(P>0.05),但E组十二指肠脂肪酶活性均为最高。
由表 4可见,21日龄时,各组十二指肠α-淀粉酶活性无显著差异(P>0.05);28日龄时,E+K组α-淀粉酶活性显著低于CK组和E组(P < 0.05);35日龄时,E组十二指肠α-淀粉酶活性显著高于CK组和E+K组(P < 0.05);42日龄时,E组十二指肠α-淀粉酶活性极显著高于K组和E+K组(P < 0.01)。
图 1为21日龄肉鸡十二指肠EGFR原位杂交检测结果,红色荧光显示EGFR阳性,说明目的基因在该位置得到表达。由表 5可见,E组十二指肠EGFR基因平均光密度值显著高于CK组(P < 0.05),其他各组平均光密度值与CK组无显著差异(P>0.05)。
图 2为42日龄肉鸡十二指肠EGFR原位杂交检测结果,红色荧光显示EGFR阳性,说明目的基因在该位置得到表达。由表 5可见,E组和K组十二指肠EGFR基因平均光密度值极显著高于CK组和E+K组(P < 0.01),E组与K组之间十二指肠EGFR基因平均光密度值无显著差异(P>0.05)。
由表 6可见,21日龄时,K组和E组十二指肠绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度显著高于CK组(P < 0.05),各组十二指肠隐窝深度无显著差异(P>0.05)。28、35和42日龄时,各组十二指肠绒毛高度、隐窝深度和绒毛高度/隐窝深度无显著差异(P>0.05)。除28日龄E+K组绒毛高度/隐窝深度高于E组外,其余日龄E组绒毛高度/隐窝深度均为最高。
消化酶活性是评价家畜生理消化机能的重要指标之一,具有种类和年龄特异性、敏感性及短潜伏期等特点,动物对营养物质消化吸收的能力主要取决于其消化道内消化酶活性的高低,因此通常被认为是能够反映个体营养状况的可靠指标[14-15]。研究表明,与饲喂基础饲粮相比,添加EGF可显著提高断奶仔猪十二指肠、空肠和回肠的淀粉酶活性,显著提高空肠和回肠的脂肪酶活性;空肠段乳糖酶和蔗糖酶活性显著上升,各酶活性均与自然哺乳组无统计学差异[16]。碱性蛋白酶参与脂肪吸收和管腔致病细菌脂多糖的解毒,被认为是一种肠细胞分化标志酶[17]。碱性蛋白酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶(LDH)和蔗糖酶等刷状缘酶被用作绒毛成熟的细胞标记物,其活性也可作为小肠损伤的标记物[18]。同样的试验结果也表明,断奶仔猪口服EGF可提高空肠乳糖酶、蔗糖和碱性磷酸酶活性,改善生长性能。消化酶活性的提高可能促进了断奶仔猪胃肠道的发育和免疫功能。家禽的胰腺可以分泌羧基肽酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰淀粉酶和胰脂肪酶等,其中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶是家禽肠道内十分重要的消化酶,其活性的高低影响消化、吸收以及利用营养物质的效率[19]。本研究结果表明,EGF能够改善十二指肠碱性蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶活性,这表明EGF能够在动物的肠道中促进酶原转化,产生消化酶,EGF与消化酶一起促进小肠吸收养分,进而提高肉鸡对营养物质消化吸收的能力,从而促进肉鸡生长。这可能是由于EGF抑制了绒毛细胞的凋亡,进而导致绒毛边缘酶活性升高。EGFR信号转导刺激肠上皮细胞增殖,还可能通过影响促凋亡和抗凋亡B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,bcl-2)基因家族成员的表达来降低肠上皮细胞凋亡率的增加[20]。先前的报道也表明,EGF可能调控尾型同源盒转录因子2(Cdx2)在小肠刷状缘的增殖和迁移,在这些仔猪中,碱性蛋白酶、肌酸激酶、乳酸脱氢酶和蔗糖酶等消化酶mRNA表达的增加与其活性增加的趋势是一致的[21]。
3.2 十二指肠EGFR原位杂交检测原位杂交是一种杂交类型,它使用标记的互补DNA或RNA链将特定的DNA或RNA序列定位在固定在载玻片上的组织的染色体或切片上。原位杂交被公认为有较高的可靠性、灵敏度和特异性,要求较低、成本低,目前广泛应用于医院的病理检查。石蜡切片地高辛荧光原位杂交(TSA)可大量快速制备探针,而且获得的探针纯度高、特异性强,与放射性标记相比,还具有安全和方便等优点[22]。本试验创新应用石蜡切片地高辛荧光原位杂交法检测EGFR在肠道内的表达情况。EGF作为一种功能性蛋白质,只有当其与体内的EGFR结合激活相应信号通路时才能够真正发挥作用。因此EGFR的多少对EGF起着限制性作用。虽然在畜禽方面EGF的相关研究较为匮乏,但在人医上的研究相对较多。有研究表明,EGF能够诱导EGFR表达量的升高,进而促进EGF发挥生理功效[23-24]。本试验结果表明,21、42日龄E组二指肠EGFR基因平均光密度值高于CK组,从图 1和图 2可以更加直观地看出E组目的基因在十二指肠段被大量检测到。由此表明,饲粮添加EGF可以提高肉鸡十二指肠EGFR的表达,与前人的研究结果一致。
3.3 EGF对肉鸡十二指肠形态结构的影响肠道最重要的生理功能是充当屏障并促进吸收[25],小肠是营养吸收的重要部位之一[26]。肠吸收细胞起源于隐窝的底部,是未成熟的增殖细胞,随着它们向绒毛顶端迁移而分化,最后从绒毛顶端挤出[25]。肠道绒毛高度和隐窝深度是重要的形态学参数,被认为是反映肠功能的最佳指标。绒毛高度增加诱导隐窝上皮细胞增殖,其高度越高,隐窝深度越浅;绒毛高度/隐窝深度越高表明成熟肠上皮细胞数量越多,成熟度越高,消化酶的合成和分泌加快,并能够更好地吸收有效营养,增强肠道功能[27-28]。本试验结果表明,21日龄时,E组的十二指肠绒毛高度/隐窝深度显著高于CK组,这表明EGF能够显著影响生长前期肉禽小肠的形态结构,使小肠的绒毛高度增加,绒毛高度/隐窝深度变大,从而增强肉鸡小肠吸收的能力,为小肠吸收营养物质奠定了生理基础。研究表明,EGF可在早产条件下参与增强全身和肠道免疫系统的成熟[29]。同样有研究表明,EGF是主要的肠营养因子,可促进肠黏膜的生长并增加肠道的适应性[30]。因此,饲粮中添加EGF可以增强肠道功能,促进营养物质的吸收。近年来,随着对EGF深入的研究,EGF作为饲料添加剂在肉鸡养殖中具有十分广阔的应用场景。
4 结论① 饲粮中添加500 mg/kg EGF能改善肉鸡十二指肠碱性蛋白酶、脂肪酶和α-淀粉酶活性。
② 饲粮中添加500 mg/kg EGF能提高肉鸡十二指肠EGFR的表达。
③ 饲粮中添加500 mg/kg EGF能增加肉鸡十二指肠绒毛高度/隐窝深度,促进肠道发育。
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