2. 青海大学畜牧兽医科学院, 西宁 810016
2. Academy of Animal Science and Veterinary Medicine, Qinghai University, Xining 810016, China
抗生素作为生长促进剂曾被广泛应用于畜禽养殖。但是，随着抗生素滥用导致的食品安全问题、生态环境问题日益凸显，其对人类健康存在潜在威胁。《中华人民共和国农业农村部公告第194号》公告的发布，意味着抗生素类饲料添加剂在2020年7月1日后将成为历史[1]。因此，在无抗养殖后时代探寻抗生素替代品意义重大[2]。有研究指出，益生菌制剂可以作为抗生素的有效替代物，发挥优化动物消化道菌群、改善饲料营养代谢、增强动物免疫力的作用[3]。目前应用较广泛的益生菌主要包括乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等[4]。
目前，乳酸菌类微生态制剂应用最为广泛，它是指一类在厌氧或兼性厌氧条件下能发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性、无芽孢细菌的总称[5]。有报道称乳酸菌在动物消化道内能够抑制致病菌的生长繁殖，阻止其代谢活动，还能够减少血清胆固醇和内毒素含量，维持消化道内微生态平衡，提高机体免疫功能[6]。而目前市场上乳酸菌制剂混乱，质量参差不齐，通常由于活菌数不够、活性弱、抗逆性不强、同源性差等原因，导致产品性能不稳定、应用效果不明显等诸多问题[7]。而且从菌制剂对宿主发挥作用的效果而言，同源性益生菌最佳[8]，但其相关机理还有待进一步研究。因此，根据实际动物生产需要，筛选同源性并在益生功能及抗逆性方面表现良好的菌株是益生菌研究的关键问题，决定了乳酸菌制剂的使用效果[9]。
鉴于此，本研究拟从健康羊瘤胃内容物中分离筛选出生长速率、产酸能力、耐酸和耐胆盐性能、抑菌能力及自凝集率等方面表现良好的菌株，同时还应考虑菌株安全特性，通过对菌株的抗生素敏感性检测，避免抗性基因传播，为开发适应养羊生产的乳酸菌制剂提供理论和试验基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 样品采集分别从青海省贵南县以及西藏拉萨地区自然放牧羊群中各随机挑选3只1岁、体重在30~35 kg、健康的黑藏羊和白绒山羊，放血致死后取出瘤胃，快速无菌采集新鲜瘤胃内容物于50 mL灭菌离心管中，冷藏并迅速送回实验室进行菌株分离。
1.1.2 培养基本试验涉及的培养基配制主要参照凌代文[10]试验方法。MRS肉汤培养基：乙酸钠5 g、柠檬酸三胺2 g、磷酸氢二钾2 g、四水合硫酸锰0.25 g、硫酸镁0.58 g、吐温-80 1 mL、蛋白胨10 g、酵母抽提物5 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g，加蒸馏水至1 L；含有碳酸钙的MRS琼脂培养基：在MRS肉汤中加入琼脂20 g、碳酸钙10 g，加蒸馏水至1 L；PY基础培养基：蛋白胨0.5 g、酵母提取物1.0 g、胰酶解酪胨0.5 g、盐溶液4.0 mL、蒸馏水1 L。
1.1.3 试剂盒细菌DNA提取试剂盒购自OMEGA公司，PCR反应试剂购自TaKaRa公司。
1.2 试验方法 1.2.1 乳酸菌的分离纯化参照王利红[11]试验方法，将瘤胃内容物用生理盐水按10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀释，取各梯度稀释液均匀涂布MRS-CaCO3琼脂培养基平板，37 ℃恒温培养箱培养24~48 h，待平板上出现单菌落，挑取具有明显溶钙圈且形状、大小、颜色各异的单菌落扩大培养，纯化3~4次，编号标记，并于30%甘油中-80 ℃保存，作为初步筛选试验的菌株。
1.2.2 菌株初筛参照王利红[11]试验方法，取干净玻片，用接种环取1环菌液于玻片上，涂匀，待干燥后，固定，进行革兰氏染色。油镜(10×100)镜检，观察记录菌株形态，经革兰氏染色后呈紫色，为阳性菌，呈红色为革兰氏阴性菌。同时菌株进行过氧化氢酶试验，观察是否有气泡产生，如有气泡，则为过氧化氢酶阳性菌，没有气泡，则为过氧化氢酶阴性菌，若革兰氏染色阳性，过氧化氢酶接触阴性则可初步确定为乳酸菌。
1.2.3 菌株种属鉴定将初筛纯化的菌种保存液充分活化后，离心收集菌体，根据细菌DNA提取试剂盒方法提取菌体DNA，以提取DNA为模板，PCR扩增16S rRNA基因片段，扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增子送往生物公司进行测序，以鉴定乳酸菌的种属。PCR引物采用16S通用引物序列[12]：16S-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGC-3′，16S-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′。PCR扩增程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 S；55 ℃退火1 min；72 ℃延伸1.5 min；30个循环；72 ℃终延伸10 min。
1.3 优良乳酸菌的筛选 1.3.1 乳酸菌发酵葡萄糖产酸产气试验参照程丽娟等[13]试验方法，PY基础培养基内加入30 g/L葡萄糖和0.5 mL/L吐温-80，以16 g/L的溴甲酚紫作指示剂，分装至试管，在试管内倒置杜氏试管，121 ℃灭菌20~30 min，接种乳酸菌后置于37 ℃恒温培养24 h。培养基的颜色由紫色变为黄色表示产酸，培养基中杜氏试管顶端出现气泡，表明其产气，为异型发酵乳酸菌，未出现气泡，为同型发酵乳酸菌。
1.3.2 乳酸菌生长特性及产酸能力测定参照崔棹茗等[14]试验方法进行乳酸菌生长及产酸能力测定，对筛选出的同型发酵乳酸菌，经活化后按照1%接种量接种于5 mL MRS培养基中，37 ℃恒温培养，分别在0、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h，随机抽取3管，以空白培养基为对照，测定600 nm波长下的吸光度(OD)，同时测定菌液的pH，以菌液培养时间为横坐标，OD和pH为纵坐标分别绘制生长曲线和产酸曲线。
1.3.3 耐酸和耐胆盐性能测定参照李利等[15]试验方法进行耐酸和耐胆盐性能测定。
耐酸性能：将供试菌株接种于MRS培养基中，厌氧条件下37 ℃培养24 h。用6 mol/L的盐酸分别调节MRS液体培养基pH至4.0、3.0、2.5。将活化的乳酸菌分别接种未调pH培养基及调pH至4.0、3.0、2.5的MRS培养基中，并调整其初始OD在0.025±0.005，37 ℃培养24 h，以相应pH未接种的培养基为空白对照，于600 nm波长下测定各组菌液的OD。
耐胆盐性能：与耐酸性能测定相似，将活化的乳酸菌分别转接至含0、1、2和3 g/L的牛胆盐MRS培养基，并调整其初始OD在0.025±0.005，37 ℃厌氧条件下培养24 h，以未接种的相应胆盐浓度培养基为空白对照，于600 nm波长下测定各组菌液的OD。
1.3.4 菌株上清液抑菌性能测定参照崔素素[12]抑菌性试验方法，以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为指示菌，牛津杯法进行抑菌试验。将候选菌株于MRS培养基培养活化2代，将活化好的菌液离心(8 000×g)2 min，上清液经滤膜过滤，收集后分为等量的2份，1份不调pH，1份将pH调至6.8，吸取150 μL加入牛津杯中，37 ℃培养24 h后检测有机酸是否对指示菌产生抑制作用，抑菌能力根据抑菌圈大小判定，判定方法参考高擎燏[16]的试验研究。
1.3.5 自凝集试验参照李龙等[17]试验方法，将候选菌株活化24 h后离心(8 000×g)5 min，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，PBS重悬，调整菌悬液的OD为0.25±0.05，记录起始OD(A0)，吸取4 mL已调整OD的菌悬液加入试管中，静置于室温下20 h后测定该菌悬液上清在600 nm波长下的OD(At)，计算自凝集率(A，%)=[(A0-At)/A0]×100。
1.3.6 药敏性试验参照封晔等[18]的药敏性试验方法，将候选菌株制成菌悬液，均匀涂布于MRS平板培养基上，将青霉素、四环素、链霉素、氧氟沙星、多黏菌素B、红霉素、环丙沙星、妥布霉素8类抗菌药物药敏片均匀置于平板上，37 ℃培养24 h，观察并记录抑菌圈大小，根据抑菌圈大小判定药敏性，判定标准参考美国NCCLS文件及文献[19]进行制定(表 1)。
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表 1 不同抗生素药敏性判定标准 Table 1 Different antibiotic drug susceptibility criteria |
利用Excel 2010对试验数据进行初步整理，采用SPSS 20和GraphPad Prism 8软件对试验数据进行统计分析和图表绘制。
2 结果与分析 2.1 菌株分离纯化共分离纯化得到疑似乳酸菌101株，所有菌株革兰氏染色均呈阳性，过氧化氢酶触反应均呈阴性，部分菌株在MRS平板培养的菌落特征和革兰氏染色见图 1所示。
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A1、A2、A3分别为不同菌株菌落形态；B1、B2、B3分别为对应菌株革兰氏染色。 A1, A2 and A3 are colonies of different strains, and B1, B2 and B3 are Gram stains of corresponding strains. 图 1 部分菌株菌落形态及革兰氏染色 Fig. 1 Colony morphology and Gram stains of some strains |
分别提取101株经革兰氏染色呈阳性，过氧化氢酶触反应呈阴性菌株的DNA，经16S rRNA引物进行PCR扩增，扩增得到的片段大小均在1 500 bp处出现单一荧光条带，没有明显拖尾现象，符合测序要求，部分菌株的PCR扩增电泳图如图 2所示。随后将PCR产物进行测序后，测序结果登陆NCBI网站进行BLAST序列比对，根据其相似度确定得到25株乳酸菌，如表 2所示，分离得到的25株乳酸菌中8株戊糖片球菌和2株短乳杆菌均分离自黑藏羊瘤胃内容物，明串株菌分离自白绒山羊瘤胃内容物，在黑藏羊和白绒山羊瘤胃内容物中均分离出了戊糖乳杆菌、粪肠球菌、海氏肠球菌、蒙氏肠球菌。
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M：DL2000 DNA标记物；1~12号依次是菌株H1、H2、H7、H9、H12、H15、H17、H18、H20、H23、H24、H25的基因组DNA。 M: DL2000 DNA marker; 1 to 12 are the genomic DNA of strains H1, H2, H7, H9, H12, H15, H17, H18, H20, H23, H24 and H25 in sequence. 图 2 部分菌株的基因组DNA电泳图 Fig. 2 Genomic DNA electrophoresis of some strains |
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表 2 25株乳酸菌16S rRNA序列相似性比对 Table 2 16S rRNA sequence similarity comparison of 25 strains of lactic acid bacteria |
如图 3所示，以25株乳酸菌为供试菌株，进行葡萄糖发酵产酸产气分析，结果显示25株乳酸菌培养基颜色24 h后均由紫色变为黄色表示均能产酸，其中菌株H23、H24、H25培养基中杜氏试管顶端出现气泡表示产气，为异型发酵乳酸菌，其余22株菌产酸的同时未产生气体，为同型发酵乳酸菌。
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图 3 部分菌株产酸产气结果 Fig. 3 Results of acid production and gas production of some strains |
如图 4-A所示，8株戊糖片球菌中菌株H1、H2、H3、H5、H6、H7、H8均在接种4 h后进入对数生长期，菌株H4在接种6 h后进入对数生长期，均在16 h后进入稳定期，48 h时的OD600在2.2~2.3；由图 4-B可知，8株肠球菌均在接种2 h后进入对数生长期，12 h后进入稳定生长期所有菌株均在接种12 h后进入稳定生长期，8株肠球菌在48 h时OD600均在1.5左右，其中菌株H12、H13最高，菌株H9、H10、H11最低；由图 4-C可知，6株戊糖乳杆菌均在接种2 h后进入对数生长期，16 h后进入稳定生长期，48 h时的OD600均接近2.5，其中菌株H22在4和48 h时的OD600均低于其余5株菌。
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图A、B、C分别代表 8株戊糖片球菌、8株肠球菌、6株戊糖乳杆菌生长曲线。图 5同。 Figures A, B and C represent the growth curves of 8 strains of Pediococcus pentosus, 8 strains of Enterococcus and 6 strains of Lactobacillus pentosus, respectively. The same as Fig. 5. 图 4 22株乳酸菌生长曲线 Fig. 4 Growth curve of 22 lactic acid bacteria |
由图 5可知，所有菌株在培养过程中pH的变化规律基本一致，都呈现先稳定后下降再稳定的阶段，综合图 3生长曲线的结果，乳酸菌处于适应期时，培养基pH变化基本保持稳定，当菌株生长进入对数期，培养基pH开始下降，菌株生长进入稳定期后，pH又开始趋于稳定。由图 5-A可知，8株戊糖片球菌在48 h时的pH均能达到4.0以下，菌株H2、H3、H5、H6、H7、H8在进入对数生长期后pH快速下降，其中菌株H7的pH下降最快，菌株H8的pH下降最慢，菌株H1、H4进入对数生长期后，菌株H1的pH迅速下降，但菌株H4的pH在8 h后开始快速下降；由图 5-B可知，8株肠球菌在48 h时的pH接近，均在4.2~4.5，其中菌株H12、H13的pH下降最快，且48 h时的pH也最低，菌株H9、H10、H11的pH下降最慢，在48 h时的pH高于其余5株菌；由图 5-C可知，6株戊糖乳杆菌均在进入对数生长期后pH快速下降，其中菌株H22的pH下降速率低于其他菌株，但在48 h时的pH接近且均低于4.0。
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图 5 22株乳酸菌产酸曲线 Fig. 5 Acid production curve of 22 lactic acid bacteria |
综合22株同型发酵乳酸菌的生长曲线和产酸速率的结果得出：戊糖片球菌中菌株H2、H3、H5、H6、H7生长性能和产酸性能较好；肠球菌中菌株H12、H13生长性能和产酸性能最好，H14、H15、H16次之，H9、H10、H11最差，戊糖乳杆菌中菌株H22较差。
2.3.4 耐酸和耐胆盐性能由表 3可知，所有菌株均能在培养基中正常生长，整体生长速度戊糖乳杆菌优于戊糖片球菌，肠球菌的生长速度较慢。所有菌株在pH 4.0的条件下均能生长，其中戊糖片球菌的生长几乎不受影响，说明此8株戊糖片球菌均能完全耐受pH 4.0条件；8株肠球菌生长受到抑制作用，其中菌株H9、H10、H11生长微弱，基本不耐受此酸度环境，菌株H12、H13、H14、H15、H16生长较好，说明能耐受此环境条件，其中菌株H13耐受性最好；6株戊糖乳杆菌能完全耐受pH 4.0的环境，生长良好。在pH 3.0条件下，8株戊糖片球菌长势较好，但也受到一定程度的抑制，其中菌株H6耐受性最差；8株肠球菌的生长被完全抑制不能生长；6株戊糖乳杆菌耐酸性强，长势较好。pH 2.5条件下，8株戊糖片球菌和6株戊糖乳杆菌生长微弱，基本不能耐受此酸性环境，但戊糖乳杆菌整体耐受能力优于戊糖片球菌。
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表 3 22株乳酸菌在不同pH及胆盐条件下24 h时OD600的变化 Table 3 Changes of OD600 of 22 strains of lactic acid bacteria at 24 h under different pH and bile salt conditions |
由表 3可知，所有菌株均能很好地耐受0.1%的胆盐环境。在0.2%的胆盐条件下，8株戊糖片球菌长势良好，说明能耐受此胆盐环境，其中菌株H7的耐受性能最好；8株肠球菌长势较好，但均受到一定抑制作用；6株戊糖乳杆菌长势较好，说明其能耐受此胆盐环境，其中菌株H20最好，H22最差。在0.3%的胆盐条件下，8株戊糖片球菌能在一定程度上耐受此胆盐环境，其中菌株H1、H4耐受性能最差；8株肠球菌长势微弱，其中菌株H12耐受能力最强，H14、H15、H16次之，其余最差；6株戊糖乳杆菌，菌株H17、H18、H19、H20长势较好，说明这4株菌能耐受此胆盐环境，菌株H21、H22长势微弱，说明不能耐受此环境。
综合这22株菌对酸和胆盐的耐受性能结果得出：8株戊糖片球菌中菌株H2、H3、H5、H7、H8对酸和胆盐耐受性较好；8株肠球菌中菌株中H12、H14、H15、H16对酸和胆盐耐受性较好；6株戊糖乳杆菌中H17、H18、H19、H20对酸和胆盐耐受性较好。
2.3.5 候选菌株抑菌能力由表 4可知，22株乳酸菌上清原液对指示菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均产生了抑制作用，除了菌株H5、H6、H11，其余菌株上清液对指示菌沙门氏菌也均产生了抑制作用，但是存在菌株特异性。8株戊糖片球菌中，菌株H2、H3、H7、H8对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用最强；8株肠球菌中H10、H15沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用最强；6株戊糖乳杆菌中H17、H18、H20对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑制作用最强。而pH调至6.8的乳酸菌上清液及MRS培养基，均未检测出对指示菌的抑制作用。部分菌株抑菌效果如图 6所示。
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表 4 22株乳酸菌对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力 Table 4 Antibacterial activity of 22 strains of lactic acid bacteria against Salmonella, Staphylococcus aureus and Escherichia coli |
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图A的指示菌为沙门氏菌，菌株分别为H17、H2、H4、H5；图B的指示菌为金黄色葡萄球菌，菌株分别为H18、H17、H7、H15；图C的指示菌为大肠杆菌，菌株分别为H2、H15、H17、H18；a、b、c分别为MRS培养基，上清液调pH至6.8，上清液原液。 The indicator bacteria in figure A is Salmonella, and the strains are H17, H2, H4, H5; the indicator bacteria in figure B is Staphylococcus aureus, and the strains are H18, H17, H7, H15; the indicator bacteria in figure C is Escherichia coli, and the strains are H2, H15, H17, H18; a, b and c are the MRS medium, the supernatant is adjusted to pH 6.8, and the supernatant stock solution. 图 6 部分菌株发酵液对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果 Fig. 6 Antibacterial effect of fermentation broth of some strains on Salmonella, Staphylococcus aureus and Escherichia coli |
22株乳酸菌在静置20 h后凝集率如图 7所示，菌株特异性明显，其中菌株H1自凝集率最高，菌株H12自凝集率最低。
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图 7 22株乳酸菌自凝集率 Fig. 7 Self-aggregation rate of 22 lactic acid bacteria |
药敏试验结果(表 5)发现，所有菌株对链霉素都具有耐药性。8株戊糖片球菌对青霉素、四环素、红霉素3种药物敏感，除了菌株H4对多黏菌素B敏感，8株菌对其余5种药物均具有耐药性；8株肠球菌对链霉素、多黏菌素B、妥布霉素3种药物均具有耐药性，其中菌株H9、H11、H15、H16对4~5种药物敏感，H12、H13只对四环素敏感；6株戊糖乳杆菌均对链霉素、多黏菌素B、环丙沙星具有耐药性，菌株H18对4种药物敏感，H20对2种药物敏感，其余菌株均对3种药物敏感，部分菌株的抗生素敏感性效果如图 8所示。
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表 5 22株乳酸菌对不同抗生素的敏感性判定 Table 5 Sensitivity of 22 strains of lactic acid bacteria to different antibiotics |
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药敏纸片a、b、c、d、e、f、g、h分别代表抗生素青霉素、四环素、链霉素、氧氟沙星、多黏菌素B、红霉素、环丙沙星、妥布霉素。 Drug sensitive discs a, b, c, d, e, f, g and h represent antibiotics penicillin, tetracycline, streptomycin, ofloxacin, polymyxin B, erythromycin, ciprofloxacin and tobramycin. 图 8 部分菌株对不同抗生素敏感性 Fig. 8 Some strains are sensitive to different antibiotics |
乳酸菌是近年来应用最广泛的一种安全性较高的新型绿色功能性饲料添加剂，具有提高饲料利用率、改善动物消化道功能、提高免疫力等益生功能[20-21]。针对不同动物而言，其消化道环境以及微生物组成均有所不同[22]。因此，筛选具有高效、稳定等益生特点的同源性益生菌的研究就显得尤为重要。菌株是否能作为益生菌，需要根据现有益生菌选择标准和评价规程对其进行安全性评估[23]。而作为直接投喂的菌制剂，首要问题是要考虑其进入动物胃肠道后的存活和定植，所以筛选菌株时应选择来自同种动物宿主分离的益生菌，使其具有更强的适应能力[24]。在本试验中对分离自不同品种羊瘤胃中的菌株先通过形态学特征和生理生化特性进行初步鉴定，然后进行了16S rRNA分子生物学鉴定，提高了鉴定的准确率。结果发现筛选获得的25株乳酸菌，包括4个不同的属，7个不同的种，其中同型发酵乳酸菌22株，异型发酵乳酸菌3株。戊糖片球菌和短乳杆菌均来自黑藏羊，而明串株菌来自白绒山羊，戊糖乳杆菌、粪肠球菌、蒙氏肠球菌、海氏肠球菌则存在于2种羊瘤胃中，说明不同品种、不同来源的羊瘤胃中乳酸菌分布不同、多样性也存在差异，分析原因可能是动物胃肠道乳酸菌群的形成主要来源于自然环境中乳酸菌的定植，而不同地域环境、不同气候条件又孕育了不同乳酸菌资源，同时不同品种的羊消化道环境也可能适应不同乳酸菌的生长，不同乳酸菌之间存在的协同或拮抗作用可能影响乳酸菌的分布，因此导致不同品种、不同来源的羊瘤胃中分离得到的乳酸菌种类不同，宿利亚[25]的研究也说明了不同地域、不同动物肠道或畜产品能分离出一些地域特色的益生菌。随后对22株同型发酵乳酸菌进行了体外生物学特性评价。乳酸菌的生长速度及产酸能力是筛选益生菌的重要指标，无论是直接投喂还是应用于发酵饲料，生长速度快，能迅速繁殖成为优势菌群，从而竞争性抑制其他病原微生物的生长；产酸能力强，能快速产生大量乳酸等有机酸，形成低pH环境，抑制有害菌的生长[26-27]。鉴于此，本研究根据养羊生产需要，对分离得到的22株同型发酵乳酸菌进行生长特性和产酸能力研究，结果表明，8株戊糖片球菌中菌株H2、H3、H5、H6、H7生长性能和产酸性能较好；8株肠球菌中菌株H12、H13生长性能和产酸性能最好，H14、H15、H16次之，H9、H10、H11较差，戊糖乳杆菌中菌株H22较差；另外生长速度及产酸能力存在菌株特异性，本试验中戊糖片球菌和戊糖乳杆菌整体优于肠球菌，所有菌株均在接种2~6 h后进入对数生长期，16 h后进入稳定生长期。王蔚淼等[28]研究结果显示，乳酸菌的对数生长期一般在接种后12~24 h，这与本研究结果不一致可能原因是菌株不同所致。靳胜男等[29]的研究显示，乳酸菌在接种4 h后进入对数生长期，14 h后进入稳定期，与本研究结果基本一致。在本研究中分离到的乳酸菌其生长速度不同，部分菌株生长较快，具有作为优良发酵接种菌的潜力。此外在产酸速度方面，不同种属乳酸菌产酸能力不同，但基本都在发酵4 h后产生大量有机酸，pH快速下降，发酵24 h后pH趋于稳定，戊糖片球菌和戊糖乳杆菌终末pH能达到3.8左右，而肠球菌均在4.0以上。
作为优良益生菌制剂，除了应具有较好的生长和产酸性能外，也应当能适应胃肠道中的苛刻环境。因此对22株乳酸菌进行了耐酸、耐胆盐试验，试验结果表明8株戊糖片球菌在pH 2.5条件下微弱生长，对pH 3.0及胆盐浓度0.3%的环境均具有较好的耐受性，其中菌株H2、H3、H5、H7、H8表现较好；8株肠球菌均完全不能耐受pH 3.0以下环境，其中菌株H12、H13、H14、H15、H16对pH 4.0耐受性能较好，所有菌株均能在一定程度上耐受0.3%的胆盐浓度；6株戊糖乳杆菌在pH 2.5条件下微弱生长，均能耐受pH 3.0的酸性条件及0.3%的胆盐浓度其中H17、H18、H19、H20对酸和胆盐耐受性较好，结果表明乳酸菌不同种属及同一种属不同菌株耐酸和耐胆盐性能可能不同。Missotten等[30]对10株乳酸菌耐酸性能研究也显示不同菌株耐酸性能存在差异，这和本研究结果基本一致。在沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力方面，所有菌株上清液对指示菌金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有不同程度的抑制作用，其中菌株H1、H2、H18抑制作用最强，除了菌株H5、H6、H11其余菌株上清液对沙门氏菌也均有不同程度抑制作用，其中菌株H17、H20抑菌作用最强。在排除酸效应后，所有菌株上清液均未检测到抑制作用，李雪莉等[31]研究也表明乳酸菌主要通过有机酸来发挥抑制作用，这与本研究结果一致。本试验结果也说明乳酸菌主要通过代谢产生的有机酸来发挥抑菌作用的，但也有研究表明乳酸菌可通过细菌素、过氧化氢等发挥抑菌效果[32]，在本研究中可能原因是除有机酸外没有其他抑菌物质的产生或者产生的浓度过低所致。
菌株的自凝集是指相同菌株间相互凝集形成多细胞簇的过程，乳酸菌可通过自凝集形成阻碍致病菌在肠道定植和感染的屏障[33]。菌株自凝集应该作为筛选菌株的重要指标，能间接反应菌株的黏附特性，自凝集率高的菌株有高的疏水性和黏附率[34]。在本试验中大多数菌株的自凝集率都在40%~50%，但是存在菌株特异性，最高可达63.2%，最低为36.7%，本试验结果表明，大多数菌株具有较强的自凝集能力，这与前人试验研究结果[17, 35]一致。
乳酸菌的使用历史悠久，通常被认为是一种安全的菌种，但是不合理菌株的使用可能对宿主健康产生危害。而作为益生菌的一个重要安全要求就是不可携带可转移抗性基因[36]。抗性基因可通过横向转移，从而使菌株对使用的抗生素产生耐药性。因此益生菌的候选菌株必须鉴定其抗生素敏感性。本试验评价了22株乳酸菌对8种常用抗生素的耐药性。本试验研究结果表明，戊糖片球菌和戊糖乳杆菌中除了菌株H4对多黏菌素B敏感，菌株H18对妥布霉素中度敏感，都表现出对链霉素、氧氟沙星、多黏菌素B、环丙沙星、妥布霉素的耐药性，肠球菌中菌株H11、H15对链霉素、多黏菌素B、妥布霉素出现耐药性，对其余抗生素敏感，本试验结果与前人的试验结果[19, 37]基本一致，但因菌株来源及抗生素不同也存在不同之处。分析产生这种结果的原因可能是不同菌株携带的天然耐药基因不同，也可能是由于在畜禽养殖过程中长期低水平抗生素使用刺激相关抗性基因转移，形成获得性耐药，更有可能与菌株来源密切相关。由于目前对于益生菌药敏性评价还缺乏相应的标准，后期也需要更多的深入研究。
4 结论本试验研究成功筛选出H2、H7、H15、H17、H18 5株优良同型发酵乳酸菌，其中戊糖片球菌2株、海氏肠球菌1株、戊糖乳杆菌2株，均具有良好的生长及产酸能力和抗逆性，后期将对其安全性进行进一步研究，为其作为抗生素替代品在畜禽养殖中应用提供理论依据。
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