2. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 长沙 410125
2. The Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
桑叶是桑科植物桑(Morus alba L.)的干燥叶，具有良好的食用价值和药用价值。桑叶中含有丰富的维生素、矿物质以及生物碱、黄酮、多糖和多酚等活性成分[1]，具有降血糖、降血脂、抗衰老、抗肿瘤、抗病毒[2]和抑菌[3]等功效。其中，多酚类物质作为构成桑叶抗氧化能力的重要物质基础之一，近年来研究主要集中在其最优提取工艺和体内抗氧化作用等方面，而对桑叶体外抗氧化作用与其所含多酚类物质之间的量效关系的研究甚少。因此，本试验测定了在不同浓度(60%、70%、80%)的乙醇提取条件下桑叶多酚的绝对量和含量，分析了各组之间的差异情况；并选定其中桑叶多酚的绝对量和含量最高的60%乙醇提取组，经过不同倍数的稀释处理后再次测定其多酚的绝对量、含量和1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基清除率，并以水溶性维生素E(6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)为阳性对照，以半抑制浓度(IC50)为参考依据，分析了各乙醇提取组的不同稀释水平之间体外抗氧化能力的差异情况，将多酚绝对量与IC50进行了相关性分析，并构建拟合方程，为揭示桑叶多酚含量与其体外抗氧化能力之间的量效关系提供试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料桑叶采摘于国家中药材(湖南)生产技术中心。新鲜桑叶样品经65 ℃烘干至恒重，粉碎后过60目筛后备用。
主要试剂：DPPH、福林酚(Folin-ciocalteu)试剂、没食子酸(分析纯)、乙醇(分析纯)、冰醋酸(分析纯)、醋酸钠(分析纯)、Trolox、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)。
主要仪器：HC-100T型多功能粉碎机(广东河城工贸有限公司)、FA1004B型分析天平(上海越平科学仪器有限公司)、SHZ-82型气浴恒温振荡器(江苏省常州市华普达教学仪器有限公司)、MH-1500S型超声波清洗器(湖南米函仪器科技有限公司)、帝肯Infinite F50型酶标仪(瑞士Tecan公司)、85-2型恒温磁力搅拌器(江苏省常州市国华仪器制造有限公司)、PH-10/100型笔式酸度计(上海邦西仪器科技有限公司)。
1.2 桑叶多酚提取液的制备[9]准确称取1.0 g桑叶粉碎样品18份，分为3组，每组6份，分别溶解于25 mL 60%、70%、80%的乙醇溶液中，在70 ℃恒温水浴锅加热30 min后，经功率为240 W的超声波提取10 min，迅速趁热过滤，合并滤液，最终共计得到18份桑叶多酚提取液，储藏于4 ℃冰箱中备用。
1.3 桑叶多酚绝对量及含量的测定试验参考Folin-ciocalteu法[4]测定并加以改进。以没食子酸为标样，在可见光区595 nm处测定吸光度，不同浓度(60%、70%、80%)的乙醇提取组各设3个重复样品孔。以没食子酸浓度为横坐标，所测吸光度为纵坐标，测定桑叶多酚标准曲线为Y=1.219 7X+0.008 6 (R2=0.993 8)(图 1)。桑叶多酚绝对量和含量计算公式为：
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图 1 桑叶多酚标准曲线 Fig. 1 Standard curve of polyphenols from mulberry leaves |
桑叶多酚含量(mg/g)=桑叶多酚绝对量×V/M。
式中：A1为10 μL桑叶多酚提取液+200 μL 2% Na2CO3+10 μL 50% Folin-ciocalteu试剂混合液的吸光度；A2为220 μL纯水的吸光度；M为所称取的桑叶样品质量(g)；V为每份桑叶多酚提取液的总体积(mL)。
1.4 桑叶多酚提取液的稀释选取桑叶多酚含量最高组的桑叶多酚提取液，将其进行逐级稀释，分别稀释至原来的25%、50%、75%后，参照1.3所述方法测定各稀释组的桑叶多酚绝对量和含量。
1.5 DPPH自由基清除率的测定试验参考符晨星等[5]的方法测定，并加以改进。预先配制25 mL 0.1 mol/L醋酸和200 mL 0.1 mol/L醋酸钠，将两者混匀后，调节pH至5.5，制成0.1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液；将0.1 mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲液与70%的乙醇溶液按10 ∶ 9的体积比混合均匀，制成试验Buffer液；配制0.2 mg/mL DPPH乙醇溶液。
称取5 mg Trolox粉末，溶解于1 mL DMSO中，随后稀释成试验所需的5个浓度，分别为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL。以不同浓度的Trolox溶液及其相应的清除率绘制标准曲线。经酶标仪测定，Trolox标准曲线为Y=-0.755 6X+0.584 2 (R2=0.994 0)(图 2)。以Trolox清除DPPH自由基的能力为阳性对照，对桑叶多酚提取液的体外抗氧化能力进行评价。DPPH自由基清除率计算公式为：
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图 2 Trolox标准曲线 Fig. 2 Standard curve of Trolox |
式中：A1为5 μL桑叶多酚提取液+5 μL纯水+190 μL试验Buffer+50 μL DPPH混合液的吸光度；A2为10 μL桑叶多酚提取液+240 μL纯水混合液的吸光度；A3为250 μL纯水的吸光度；A4为200 μL Buffer+50 μL DPPH混合液的吸光度。
将不同混合液溶解于96孔板中，混合均匀。室温避光孵育30 min后，于517 nm的波长下检测吸光度，不同浓度的乙醇提取组各设3个重复样品孔。
1.6 桑叶多酚提取液的稀释对各组桑叶多酚提取液进行稀释处理，分别将桑叶多酚提取液稀释2、4、8、16倍，参照1.5所述方法测定各稀释组的DPPH自由基清除率。
1.7 数据统计分析所有试验数据采用SPSS 20.0软件中的ANOVA过程进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，差异显著时用Duncan氏法进行多重比较。结果采用平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 乙醇浓度对桑叶多酚绝对量和含量的影响如表 1所示，60%乙醇提取组的桑叶多酚绝对量和含量最高，但各提取组之间无显著差异(P>0.05)。
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表 1 乙醇浓度对桑叶多酚绝对量和含量的影响 Table 1 Effects of ethanol concentration on absolute amount and content of polyphenols from mulberry leaves |
选取多酚绝对量和含量最高的60%乙醇提取组，将该组的桑叶多酚提取液分别稀释至原液的25%、50%、75%，再次测定各稀释组的桑叶多酚绝对量和含量。如表 2所示，随着稀释程度的增加，桑叶多酚绝对量和含量逐渐降低，各稀释组之间差异极显著(P < 0.01)。
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表 2 稀释处理对桑叶多酚绝对量和含量的影响 Table 2 Effects of dilution treatment on absolute amount and content of polyphenols from mulberry leaves |
如表 3所示，将桑叶多酚提取液稀释2、4、8、16倍后，各提取组的DPPH自由基清除率均随稀释水平的增加而降低；在60%乙醇提取组中，2倍稀释组的DPPH自由基清除率极显著高于其他各组(P < 0.01)；4倍稀释组的DPPH自由基清除率显著高于8倍稀释组(P < 0.05)，极显著高于16倍稀释组(P < 0.01)。
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表 3 各乙醇提取组在不同稀释处理下的DPPH自由基清除率 Table 3 DPPH free radical scavenging rate of ethanol extraction groups under different dilution treatments |
在70%乙醇提取组中，2倍稀释组的DPPH自由基清除率显著高于16倍稀释组(P < 0.05)，4倍稀释组的DPPH自由基清除率显著高于16倍稀释组(P < 0.05)。
在80%乙醇提取组中，各稀释组之间的DPPH自由基清除率差异均极显著(P < 0.01)。
2.4 桑叶多酚提取液的抗氧化能力评价以Trolox溶液的各个质量浓度为横坐标，与之对应的DPPH自由基清除率为纵坐标，绘制Trolox质量浓度-DPPH自由基清除率标准曲线(图 3)，经酶标仪检测，标准曲线为Y=265.52X+11.639 (R2=0.994)。计算得到Trolox标准品的IC50=0.144 mg/mL。
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图 3 Trolox质量浓度-DPPH自由基清除率标准曲线 Fig. 3 Standard curve of Trolox mass concentration-DPPH free radical scavenging rate |
如表 4所示，60%乙醇提取组的IC50极显著低于70%乙醇提取组(P < 0.01)，显著低于80%乙醇提取组(P < 0.05)。与Trolox标准品相比，各乙醇提取组的IC50均相对较高，这说明虽然桑叶多酚提取液的抗氧化活性较Trolox标准品弱，但仍然具有一定的抗氧化能力。
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表 4 各乙醇提取组的IC50 Table 4 IC50 of each ethanol extraction group |
通过对桑叶多酚绝对量与IC50之间的相关性分析，计算出桑叶多酚绝对量与IC50呈负相关，相关系数(r)=-0.474；即多酚绝对量越高，IC50越小，提取液的体外抗氧化能力越强；但相关关系不显著(P>0.05)。通过曲线拟合的方式，构建起桑叶多酚绝对量(X)与IC50(Y)的拟合方程为：Y=-43.757X2+44.503X+11.263 (R2=0.314)。
3 讨论 3.1 桑叶多酚的提取工艺本试验采取超声波辅助提取法，探究了乙醇浓度对桑叶多酚提取的影响。其中，超声波辅助提取法[6]是利用超声波辐射压强，使提取溶剂内所有的分子产生较为剧烈的物理效应[7]，进而加速目标成分进入溶剂，提高目标成分的提取率。与传统的醇提法相比，超声波辅助提取法充分利用了超声波的机械破碎作用和空化效应，加快了桑叶多酚向溶剂中扩散的速率，大大缩短了桑叶多酚的提取时间，超声波辅助提取法的优势在于提取效率较高，所使用的溶剂较少，提取温度较低，成本较低，适宜于在生产中大批量的使用。而近年来兴起的微波提取法则是让植物细胞在微波的作用下，产生巨大的热量，促进提取物从细胞中扩散出来，微波提取法的优势在于效率较高且操作简单，并能够有效地保护多酚不受氧化，但缺点是设备比较昂贵且维修保养较为繁琐[8-10]。杨上莺等[11]采用超声波辅助提取乙醇的方法提取桑叶多酚，确定浓度为60%的乙醇是最佳的溶剂，这与本试验所得结论一致。初步推测浓度为60%的乙醇与桑叶中的多酚类物质极性可能是最为接近的，有利于这些活性物质的溶出，故而在此提取条件下多酚含量最高。祁伟亮等[12]亦采取了超声波辅助提取法提取桑叶多酚，发现在乙醇浓度为30%、固液比为1 ∶ 35、提取时间为70 min、超声波温度为70 ℃的条件下桑叶多酚含量最高，并推测更低浓度的乙醇可能与桑叶多酚结构更加相似。这与本试验的研究结果不同，其原因可能是：1)本试验所采摘的桑叶品种与之不同，且采摘时间也存在差异，上述2个因素对桑叶多酚含量影响较大。2)桑叶多酚含量受到提取温度、料液比、超声提取时间、超声波功率等多个因素共同作用，而本试验只研究了乙醇浓度这一个因素的影响，没有采取响应面法[13]对多个因素进行严格地控制并探究出桑叶多酚的最佳提取工艺，因此有必要在后续试验中完善其他因素对桑叶多酚提取的影响。
3.2 桑叶多酚含量与DPPH自由基清除率之间的量效关系本试验取用桑叶多酚含量最高的60%乙醇提取组的桑叶多酚提取液进行稀释处理，研究结果表明：桑叶多酚提取液中的多酚含量因稀释处理而降低，且各稀释组之间差异极显著。在提取溶剂的浓度一致的条件下，随着桑叶多酚含量的降低，各稀释组中DPPH自由基清除率也逐渐降低，这说明桑叶多酚的含量与体外抗氧化能力之间存在一定的量效关系，这与沈维治等[14]有关桑叶总多酚与体外抗氧化能力相关性研究的报道一致。与本试验不同的是，沈维治等[14]的研究是通过分析桑叶的总多酚含量与体外总抗氧化能力、清除羟自由基能力、清除超氧阴离子自由基能力之间的相关性来判断桑叶多酚的含量与体外抗氧化能力之间的量效关系，进而确定是否能够通过测定桑叶多酚含量来评价桑叶的体外抗氧化作用，而本试验是通过稀释60%、70%、80%乙醇提取组中桑叶多酚提取液的方式，测定不同稀释处理条件下的桑叶多酚稀释液对DPPH自由基清除率的影响，进而评价其体外抗氧化作用的。总而言之，本试验通过稀释处理降低了提取液中的桑叶多酚含量，揭示了提取液中桑叶多酚含量的变化与DPPH自由基清除率的变化之间的关联。但本试验用于评价体外抗氧化能力的指标较少，且提取液中桑叶多酚纯度不高，仍然存在着黄酮、生物碱、多糖等天然活性物质，这些成分可能也具有一定的体外抗氧化作用[15-17]。因此，仅通过测定桑叶多酚提取液对DPPH自由基的清除率这一项指标不能全面地说明桑叶多酚的体外抗氧化能力，因此有必要通过测定桑叶多酚提取液对羟基自由基(·OH)、超氧自由基(O2-·)的清除活力[11]与2, 2 -联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐自由基(ABTS+)的清除率[18]，梳理总结多项抗氧化指标，对桑叶多酚的体外抗氧化能力进行更加全面、综合的评价。
3.3 桑叶多酚的体外抗氧化能力评价植物多酚因能使未成对电子离域而激发其化学活性，能够通过清除自由基、与金属离子螯合、抑制体内多种氧化酶的活性而起到抗氧化作用[19]。且这种抗氧化作用在动物体内主要表现为提高其生产性能和提升机体抗氧化损伤的能力；在体外则表现为清除特定自由基的能力。曹蓉等[20]研究发现，厚朴总酚显著提升了29~56日龄黄羽肉鸡的平均日增重，并对改善其肉品质有一定的促进作用；此外，厚朴总酚还可显著提高黄羽肉鸡血清中过氧化氢酶(catalase，CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低肝脏中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，因而增强了黄羽肉鸡的抗氧化功能。王彦阳等[21]研究发现，腰果叶多酚提取物具有天然抗氧化活性，当其浓度为5 mg/L时，对DPPH自由基的清除率达62%，且较同浓度条件下的维生素C高；巫永华等[22]研究发现，山楂叶多酚在纯化前后对清除DPPH自由基的IC50分别为1.28和0.78 μg/mL，体外抗氧化活性非常优越；谢佳函等[23]对红豆皮多酚的抗氧化试验结果表明，随着浓度的增大，红豆皮多酚粗提物、多酚纯化物和维生素C对DPPH自由基的清除率呈先增加后平缓的趋势，当浓度为150 μg/mL时，多酚纯化物与维生素C对DPPH自由基的清除率大致相等，达96.53%，说明纯化后的红豆皮多酚对DPPH自由基的清除效果较维生素C弱。桑叶多酚作为众多植物多酚中的一种，亦具有良好的体外抗氧化活性。本试验发现，60%乙醇提取组中的桑叶多酚提取液对DPPH自由基的IC50最低，对DPPH自由基的清除效果最好，且该组对应的桑叶多酚含量最高；而70%乙醇提取组的桑叶多酚含量最低，对DPPH自由基的IC50最高，其对DPPH自由基的清除效果最弱；且根据桑叶多酚绝对量与IC50的相关性分析可知，两者呈负相关，这一结论验证了上述试验结果的正确性，进一步反映出桑叶多酚含量与体外抗氧化能力之间的量效关系，初步推测桑叶多酚含量可以作为评价桑叶体外抗氧化能力的一项重要指标，这与沈维治等[14]的研究报道一致。
4 结论综上所述，桑叶多酚作为桑叶中的一类重要的天然活性物质，具有良好的体外抗氧化作用。桑叶多酚含量与体外抗氧化能力之间存在一定的量效关系，虽然桑叶多酚提取液的体外抗氧化能力弱于Trolox标准品，但桑叶多酚仍然具有良好的体外抗氧化性能，可作为一种潜在的抗氧化添加剂被应用于饲料生产与加工领域。
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