动物的生长发育受神经-内分泌系统的调节，而饲粮中添加外源性激素可通过调控神经-内分泌而提高动物生长性能，但畜产品药物残留等问题直接危害人类健康和畜牧业可持续发展[1]。研究表明，异黄酮有弱雌激素作用，具有调节机体免疫功能、抗氧化、提高动物繁殖机能和生长性能等一系列重要的生物学功能[2-3]，且对调节新陈代谢、预防骨质疏松[4-5]和癌症[6]方面具有特殊功效。因此，开发具有动物激素样活性的天然植物添加剂安全有效，且符合饲料绿色添加剂的开发趋势。红三叶草(Trifolium pretense L.)是豆科、三叶草属多年生草本植物，为优良豆科牧草，因具有较高的饲用价值而被广泛栽培。红三叶草富含多种异黄酮类化合物，且含量较高，具有大多数异黄酮6倍以上的雌激素样活性，开发其在动物饲粮中的应用具有价格和资源优势。因此，本试验以去卵巢雌性SD大鼠为模型动物，研究红三叶异黄酮对大鼠生长性能、血清激素指标和子宫形态结构的影响，以期为红三叶异黄酮作为新型饲料添加剂应用于畜禽养殖及红三叶牧草资源的充分开发利用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物与材料试验动物：体重(200±5) g、3月龄的健康SD雌性大鼠30只(辽宁本溪长生生物有限公司提供)，整个饲养过程在沈阳农业大学无特定病原体(SPF)级动物试验中心进行。
试验材料：红三叶异黄酮，纯度80%，西安小草有限公司提供；其中，芒柄花素含量54%，鹰嘴豆芽素A(鸡豆黄素)含量12%，大豆素含量8%，染料木素含量7%。
1.2 试验设计与饲养管理选用30只体重(200±5) g、3月龄的SPF级雌性SD大鼠，预饲1周后随机分为5组(每组6只)，分别为假手术组(手术但未切除卵巢)、对照组(切除卵巢)以及低、中和高剂量红三叶异黄酮组[分别按体重灌胃10、30和100 mg/(kg·d)红三叶异黄酮]。用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液将红三叶异黄酮配制成所需浓度，每只灌胃4 mL/d；对照组和假手术组灌胃等量的0.5% CMC-Na溶液。对照组及低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠采用腹腔注射1.5 mL“速眠新”进行麻醉，实施脊柱双侧卵巢切除手术，摘除卵巢后缝合创口。假手术组大鼠麻醉后暴露卵巢，用镊子碰触卵巢表面后缝合创口。手术后清洁手术区域，使用青链霉素进行消炎，随后将所有大鼠放回饲养笼中小心护理，恢复14 d。
SPF级大鼠饲粮由沈阳前民动物饲料厂提供，可满足大鼠的营养需要。所有大鼠自由采食，自由饮水，室温保持在(23±2) ℃，每天12 h光照、12 h黑暗，相对湿度保持在45%左右，其他日常饲养管理按常规进行。
1.3 样品采集与处理手术后恢复14 d，连续灌胃21 d，第22天早晨采用颈部断头法处死大鼠，迅速剖开腹腔采集子宫，经磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后，放入10%甲醛溶液中固定，待做石蜡切片。同时收集血液，室温静置3 h后，1 500 r/min离心15 min分离血清，血清分装于离心管中于4 ℃冰箱中保存，待分析。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生长性能指标测定试验开始和试验结束当日对各组大鼠进行空腹称重，记录各组大鼠的饲粮采食量，并以重复为单位进行计算；统计各组大鼠的平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)、平均日增重(average daily gain，ADG)和料重比(feed to gain ratio，F/G)。
1.4.2 血清激素及钙、磷含量测定血清甲状腺素(T4)、雌二醇(E2)、促卵泡激素(FSH)和促黄体生成素(LH)含量均采用放射免疫分析方法进行测定；血清生长激素(GH)含量采用酶联免疫分析法进行测定；血清钙(Ca)和磷(P)含量采用比色法进行测定。试验中所使用的试剂盒均购自北京华英生物技术研究所。
1.4.3 子宫形态结构取约1 cm3的组织小块，经10%甲醛溶液固定48 h，固定后样本经冲洗→梯度酒精脱水→透明→浸蜡与包埋→修蜡块与切片→脱蜡到水化→苏木精-伊红(HE)染色→中性树胶封固等处理后，制成石蜡切片。进行连续切片时，切片厚度为5 μm。在光学显微镜40倍下进行形态学观察并拍摄照片，比较各组大鼠子宫形态结构。
1.5 数据处理与统计分析试验数据经Excel 2003初步整理后采用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法进行多重比较，试验数据以“平均值±标准误”表示，显著水平为P < 0.05。
2 结果与分析 2.1 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠生长性能的影响如表 1所示，低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的平均日采食量均显著高于对照组(P < 0.05)；其中，高剂量红三叶异黄酮组大鼠的平均日采食量最高(18.27 g)，并显著高于假手术组(P < 0.05)；而中剂量红三叶异黄酮组与低剂量红三叶异黄酮组之间大鼠的平均日采食量差异不显著(P>0.05)，且与假手术组接近但差异不显著(P>0.05)。
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表 1 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠生长性能的影响 Table 1 Effects of red clover isoflavones on growth performance of ovariectomized rats |
对照组及低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的平均日增重均显著高于假手术组(P < 0.05)；且低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的平均日增重显著高于对照组(P < 0.05)，高剂量红三叶异黄酮组大鼠的平均日增重显著高于低和中剂量红三叶异黄酮组(P < 0.05)。
对照组及低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的料重比均显著低于假手术组(P < 0.05)；且低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的料重比均显著低于对照组(P < 0.05)；高剂量红三叶异黄酮组大鼠的料重比低于低和中剂量红三叶异黄酮组，但差异不显著(P>0.05)。
2.2 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清生殖相关激素指标的影响如表 2所示，假手术组和低剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清E2含量显著高于对照组(P < 0.05)，而中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清E2含量与对照组和假手术组无显著差异(P>0.05)。
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表 2 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清生殖相关激素指标的影响 Table 2 Effects of red clover isoflavones on serum reproductive related hormone parameters of ovariectomized rats |
与假手术组相比，对照组及低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清FSH含量均有不同程度提高，其中，高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清FSH含量显著高于假手术组(P < 0.05)，而其余各组间均差异不显著(P>0.05)。
假手术组及低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清LH含量均显著高于对照组(P < 0.05)，其中，中剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清LH含量显著高于其余各组(P < 0.05)。
2.3 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清生长相关激素指标的影响如图 1所示，高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清GH含量显著高于对照组、假手术组和低剂量红三叶异黄酮组(P < 0.05)。低剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清T4含量显著高于其余各组(P < 0.05)，而其余各组间均无显著差异(P>0.05)。
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数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下图同。 Value columns with the same small letter mean no significant difference (P > 0.05), while with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 1 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清生长相关激素指标的影响 Fig. 1 Effects of red clover isoflavones on serum growth related hormone parameters of ovariectomized rats |
如图 2所示，与假手术组相比，对照组及低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清中钙和磷含量均显著降低(P < 0.05)。与对照组相比，低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清钙含量均有所提高，其中，低剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清钙含量显著高于对照组(P < 0.05)。与对照组相比，大鼠血清磷含量随红三叶异黄酮剂量的升高而逐渐降低，其中，低剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清磷含量显著高于对照组(P < 0.05)。
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图 2 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清钙和磷含量的影响 Fig. 2 Effects of red clover isoflavones on serum calcium and phosphorus contents of ovariectomized rats |
如图 3所示，对照组大鼠的子宫出现萎缩、内膜结构疏松，缺乏结缔组织，肌层变薄，平滑肌和结缔组织走形紊乱，子宫腺体不清晰，内膜脱落不完整。假手术组大鼠的子宫平滑肌和结缔组织发育正常，各级腺体未见管腔扩张，子宫内膜上皮细胞呈长形，单层排列，且大部分细胞染色质浓缩，处于分裂期，子宫内膜固有层细胞排列整齐，呈纺锤形。而与对照组相比，红三叶异黄酮处理使大鼠子宫形态结构有不同程度地修复。其中高剂量红三叶异黄酮组外膜结缔组织结构较正常，肌层腺体无明显增大，管壁较厚，管腔较小，内膜柱状上皮有所改变，修复较好。中剂量红三叶异黄酮组外膜结缔组织结构恢复较好，肌层平滑恢复较好，内膜仍有增厚部位，修复不完整。低剂量红三叶异黄酮组外膜结缔组织结构有所恢复，肌层平滑排列不整，形态结构与内膜仍有增厚，间质细胞排列整齐，染色质浓缩呈纺锤结构。
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图 3 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠子宫形态结构的影响 Fig. 3 Effects of red clover isoflavones on uterus morphological structure of ovariectomized rats (40×) |
异黄酮类化合物作为一种潜在的绿色饲料添加剂资源在改善动物的生长性能方面具有很大的研究前景。作为外源性激素样活性物质，异黄酮可与动物下丘脑、垂体E2受体结合，影响动物神经内分泌系统的性腺轴和生长轴，进而提高动物生长性能。研究发现，灌胃大豆异黄酮可显著提高大鼠心肌和腓肠肌肌纤维的直径[7]。饲粮中添加大豆异黄酮能改善肉鸡的生长性能，降低料重比[8]。本试验结果表明，大鼠平均日增重与红三叶异黄酮的灌胃剂量呈现一定的剂量依赖效应，这与之前的研究结果[7, 9]一致。其中，灌胃10、30和100 mg/(kg·d)红三叶异黄酮的大鼠平均日增重分别比对照组提高了15.45%、17.44%和28.02%，分别比假手术组提高了24.97%、27.13%和38.58%，并且料重比显著降低。
3.2 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清生殖相关激素指标的影响FSH和LH是垂体分泌的调节卵泡发生的2种主要蛋白质激素，是参与卵巢功能调节的重要因子[10]。动物生长发育到一定阶段时，下丘脑对性腺类固醇激素的敏感性降低，使促性腺激素释放激素的合成和分泌增加，同时脑垂体和性腺对促性腺激素释放激素的敏感性增加，促进FSH和LH分泌，后两者作用于性腺促进E2的分泌[11]。E2是调节卵泡生长发育的重要激素之一，可通过促进蛋白质合成进而调控细胞生长、分化以及多种细胞的功能[12]；雌性个体E2分泌不足是导致更年期综合征出现的主要诱因，因此采用雌激素替代疗法常成为预防更年期综合征的主要治疗手段，但雌激素本身可诱导子宫内膜增生，诱发子宫癌[13]。研究表明，红三叶异黄酮作为植物雌激素可替代E2，预防和缓解更年期综合征的发生[14]。本试验结果表明，高剂量红三叶异黄酮组大鼠的血清FSH含量显著高于假手术组，而其各余组大鼠的血清FSH含量与假手术组间无显著差异；与对照组相比，灌胃红三叶异黄酮可显著提高大鼠血清LH含量。这说明灌胃红三叶异黄酮可缓解去卵巢大鼠内源激素分泌不平衡的状况，部分弥补由于卵巢摘除所造成的雌性激素分泌不足的状况，进而改善动物的生理机能。
3.3 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清生长相关激素指标的影响动物的生长发育过程受多种激素的调节，其中GH和T4处于动物生长轴的核心地位[9, 15]。GH与靶细胞膜表面的GH受体结合，通过细胞内相关信号途径的转导，进而促进胰岛素样生长因子表达，再通过血液循环到达生物体局部组织，促进多种组织生长，增强机体合成代谢，并与其他激素和生长因子共同作用，促进动物新陈代谢和生长发育[1]。甲状腺激素包括三碘甲状腺原氨酸(T3)和T4 2种主要形式，对动物生长、分化、发育和保持代谢平衡具有极其重要的作用，血液中甲状腺激素主要以T4形式存在，由甲状腺合成并释放到血液中[16]。动物饲喂异黄酮后，血清GH和T4含量变化可直接反映动物的生长情况和代谢强度。本试验结果表明，与对照组和假手术组相比，灌胃100 mg/(kg·d)的红三叶异黄酮显著提高了去卵巢大鼠的血清GH含量；而刘兆斌[7]研究发现，给大鼠灌胃100 mg/(kg·d)大豆黄酮时，血清GH含量却呈下降趋势。此外，本试验中随着红三叶异黄酮剂量的提高，大鼠血清T4含量呈现下降趋势，而灌胃10 mg/(kg·d)红三叶异黄酮的大鼠血清T4含量显著高于对照组和假手术组。研究表明，甲状腺功能亢进伴有胰高血糖素升高，GH分泌增加等表型[13]。但在本试验中，灌胃异黄酮各组大鼠血清GH和T4含量变化趋势呈负相关，进而排除了甲状腺激素分泌亢进的可能性。综上所述，本试验结果表明，灌胃红三叶异黄酮可通过影响大鼠神经内分泌系统的生长轴，调控GH和T4的分泌，进而协同促进大鼠的生长发育。
3.4 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠血清钙和磷含量的影响钙和磷是动物体内含量最多的矿物质元素，占体重的1%~2%。作为机体钙和磷的储藏库，98%~99%的钙、80%的磷存在于骨骼和牙齿中。随着年龄的增长，雌性动物卵巢功能逐渐下降，雌激素分泌不足，诱发骨质疏松和骨质软化等症状[17]。在临床上测定血清钙和磷含量已作为诊断骨质疏松症的指标[18]。此外，血清钙和磷含量与动物机体的许多重要代谢功能密切关，血清钙和磷含量的测定对骨骼代谢的研究具有重要价值。本试验以去卵巢大鼠为研究对象，去卵巢大鼠是研究雌激素缺乏和模拟更年期女性综合征的最佳动物模型[14]。本试验结果表明，与假手术组相比，对照组及低、中和高剂量红三叶异黄酮组大鼠血清中钙和磷含量均显著下降；与对照组相比，灌胃红三叶异黄酮可提高大鼠血清钙和磷含量。Atkinson等[4]研究发现，向49~65岁女性补充异黄酮能增强骨骼密度，降低骨质疏松疾病的发生率。研究表明，植物雌激素可结合骨组织中的雌激素受体β，抑制破骨细胞和骨吸收过程，进而阻止骨质丢失，起到保护骨密度的作用[19]。因此，本试验结果表明，红三叶异黄酮可改善大鼠机体的钙磷代谢，在一定程度上可预防骨质疏松的发生。
3.5 红三叶异黄酮对去卵巢大鼠子宫形态结构的影响研究发现，大鼠补充红三叶异黄酮后，其子宫内膜肌层显著增厚，腺泡数量显著增加[20]。李潮等[21]研究表明，大豆黄酮能增加去卵巢大鼠的子宫重量，改善其子宫萎缩情况。另有研究发现，大豆异黄酮可通过激活围绝经期雌鼠子宫内膜雌激素受体β的表达来发挥弱雌激素样作用，促进子宫内膜腺体发育和内膜上皮无纤毛细胞上的微绒毛生长[22]。与上述结果相一致，本试验结果发现子宫内膜肌层随着红三叶异黄酮灌胃剂量的升高得到不同程度地改善，表明红三叶异黄酮可发挥其弱雌激素样作用，促进子宫内膜细胞增殖，改善子宫萎缩情况。此外，E2作为缓解更年期女性综合征的雌激素替代药物已广泛的用于激素替代疗法中。但E2在刺激子宫内膜增生的同时增加了癌症的发生率[13]，因此，选择植物雌激素作为新型的雌激素替代物已成为当前相关领域的研究重点[23]。本试验中，去卵巢大鼠子宫切片结果也证明了红三叶异黄酮具有改善子宫形态结构和生理机能的效果，为植物雌激素进一步应用于改善动物生殖健康提供了一定的依据。
4 结论① 红三叶异黄酮可提高去卵巢大鼠的平均日采食量和平均日增重，并提高其饲料利用效率，其中以灌胃100 mg/(kg·d)红三叶异黄酮为宜。
② 红三叶异黄酮可改善去卵巢大鼠内源激素不平衡的状况，改善血清钙和磷含量，并通过影响血清GH和T4含量促进大鼠生长。
③ 红三叶异黄酮可改善去卵巢大鼠子宫内膜平滑肌厚度，增加子宫内膜腺泡数量，改善子宫形态结构和生理机能。
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