动物营养学报    2021, Vol. 33 Issue (7): 4038-4048    PDF    
2, 2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐诱导的氧化应激对猪肠上皮细胞活力及线粒体功能的影响
鲁慧杰1 , 张莹1 , 田志梅1 , 容庭1 , 刘志昌1 , 邓盾1 , 马现永1,2     
1. 广东省农业科学院动物科学研究所, 畜禽育种国家重点实验室, 农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室, 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室, 广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心, 广州 510640;
2. 岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心, 茂名 525000
摘要: 本试验旨在评估2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)诱导的氧化应激对猪肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)活力及线粒体功能的影响,以期建立一种稳定的体外研究肠道氧化应激的模型。以不同浓度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH处理IPEC-J2细胞24 h后,检测细胞活力、细胞增殖、细胞内总活性氧(ROS)含量、线粒体膜电位、线粒体DNA(mtDNA)拷贝数以及线粒体功能相关基因[线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)、解耦连蛋白1(UCP1)、解耦连蛋白2(UCP2)、解耦连蛋白3(UCP3)]表达的变化。结果表明:AAPH对IPEC-J2细胞活力的影响呈剂量及作用时间依赖关系。与0 mmol/L AAPH处理相比,不同浓度(30、32、34 mmol/L)AAPH处理均显著抑制了IPEC-J2细胞增殖(P < 0.05),细胞活力显著下降(P < 0.05),细胞内总ROS含量显著升高(P < 0.05),细胞线粒体功能相关基因(TFAMTFB1MTFB2MUCP1、UCP3)表达显著下调(P < 0.05),mtDNA拷贝数显著降低(P < 0.05)。综上所述,AAPH诱导的氧化应激通过增加IPEC-J2细胞内总ROS含量引起细胞线粒体功能损伤,进而导致细胞活力下降,抑制细胞增殖。
关键词: AAPH    氧化应激    肠上皮细胞    线粒体    
Effects of 2, 2'-Azobis (2-Amidinopropane) Dihydrochloride-Induced Oxidative Stress on Cell Viability and Mitochondrial Function of Porcine Intestinal Epithelial Cells
LU Huijie1 , ZHANG Ying1 , TIAN Zhimei1 , RONG Ting1 , LIU Zhichang1 , DENG Dun1 , MA Xianyong1,2     
1. State Key Laboratory of Livestock and Poultry Breeding, Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science in South China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Guangdong Key Laboratory of Animal Breeding and Nutrition, Guangdong Engineering Technology Research Center of Animal Meat Quality and Safety Control and Evaluation, Institute of Animal Science, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640, China;
2. Maoming Branch, Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agriculture, Maoming 525000, China
Abstract: The aim of this study was to evaluate the effects of 2, 2'-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)-induced oxidative stress on cell viability and mitochondrial function of porcine intestinal epithelial cells (IPEC-J2 cells), and to establish a stable in vitro oxidative damage model. IPEC-J2 cells were treated with different concentrations (0, 30, 32 and 34 mmol/L) of AAPH for 24 h, the cell viability, cell proliferation, intracellular total reactive oxygen species (ROS) content, mitochondria membrane potential, mitochondrial DNA (mtDNA) copy number and the expression of mitochondrial function-related genes[mitochondrial transcription factor A (TFAM), mitochondrial transcription factor B1 (TFB1M), mitochondrial transcription factor B2 (TFB2M), uncoupling protein 1 (UCP1), uncoupling protein 2 (UCP2) and uncoupling protein 3 (UCP3)] were measured. The results showed that AAPH had a dosage and time dependent relationship on the viability of IPEC-J2 cells. Compared with the 0 mmol/L AAPH treatment, different concentrations (30, 32 and 34 mmol/L) of AAPH treatment significantly inhibited the proliferation of IPEC-J2 cells (P < 0.05), the cell viability significantly decreased (P < 0.05), the intracellular total ROS content significantly increased (P < 0.05), the mRNA expression of mitochondrial function-related genes (TFAM, TFB1M, TFB2M, UCP1 and UCP3) significantly down-regulated (P < 0.05), and the copy number of mtDNA significantly decreased (P < 0.05). In summary, AAPH-induced oxidative damage leads to cell mitochondria dysfunction, resulting in decrease of cell viability and inhibited cell proliferation of IPEC-J2 cells.
Key words: AAPH    oxidative stress    intestinal epithelial cells    mitochondria    

肠道系统具有机体最大的黏膜表面,由能够持续自我更新的单层肠上皮细胞构成,是肠道微环境和黏膜免疫系统之间的屏障,一定程度上保护机体免受肠道内有毒物质和外界环境的伤害[1]。肠黏膜屏障通过肠上皮细胞感受和响应外界刺激,是机体抵御潜在有害微生物和抗原的第一道防线,也是机体应激状态下最早和最易受到氧化损伤的位点[1-3]。动物生长中面临的饮食、药物、病原体、环境变化等应激因素会引起肠道氧化应激,刺激肠上皮细胞和免疫细胞产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)和促炎症介质,破坏肠上皮稳定,导致肠黏膜屏障受损,引发吸收障碍、炎症性肠病、消化系统退行性疾病甚至是癌症[4-5]

研究表明,断奶、高温、运输、病原菌、营养缺乏、饲料污染等诸多应激因素导致动物肠道ROS过度积累,引起肠上皮细胞损伤,肠道通透性增加,破坏肠上皮屏障功能,引发吸收障碍、腹泻等炎症性肠病和肠道应激综合征[6-8]。由断奶引起的氧化应激反应会延缓仔猪生长,增加胃肠道系统对疾病的易感性,降低仔猪肠道消化酶活性,破坏紧密连接蛋白,损害肠道免疫系统和黏膜屏障功能,导致“断奶后应激综合征”[9-10]。Smith等[11]认为仔猪早期断奶可能会对胃肠道系统产生长期影响,造成肠道黏膜屏障持续性损伤和永久性缺陷。Yu等[12]研究表明,高温应激导致猪小肠上皮细胞脱落,暴露肠黏膜固有层,改变空肠基因表达模式;超微结构显示空肠微绒毛变短、细胞线粒体肿胀、肠上皮细胞紧密连接破坏等。在这些生理过程中,肠上皮细胞具有独特的代谢特性,这些特性由线粒体活性的变化反映出来。线粒体功能是决定细胞命运以及协调细胞代谢、免疫力、应激反应和细胞凋亡的关键因素,许多细胞特异性应激反应是响应线粒体功能障碍而引起的[13]。因此,建立稳定的肠上皮细胞氧化损伤模型,阐明氧化损伤对线粒体功能的影响,对于研究动物肠上皮细胞氧化损伤的响应机制、寻找调控氧化损伤的关键靶点、测试具有抗氧化活性的药物具有十分重要的意义。

本研究使用广泛报道的自由基引发剂2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(AAPH)作为氧化应激模型的自由基来源。AAPH是一种水溶性偶氮小分子化合物,可以通过诱导细胞氧化损伤引起各种类型的病理变化[14]。AAPH在37 ℃下以已知且恒定的速率持续分解生成1摩尔氮自由基和2摩尔碳自由基,其中碳自由基可以结合生成稳定的产物,也可以与分子氧反应生成过氧自由基(ROO·)[14-15]。其他常用的自由引发剂如过氧化氢(H2O2)的浓度和稳定性具有不可预测性,因其在过渡金属存在的条件下能够自发的或者由超氧化物歧化酶(SOD)介导的歧化作用转化为极端活跃的羟基自由基(HO·),极易被细胞培养液中存在的抗氧化剂淬灭[15]。因此,这些特性使AAPH相比H2O2而言是更为稳定可靠的自由基来源,更适用于抗氧化作用相关的研究[15-16]。目前,AAPH已被广泛用作自由基引发剂,用于研究红细胞、血浆、全血、Hela细胞、各种组织、胚胎甚至动物个体的氧化应激[17]。猪肠上皮细胞(IPEC-J2细胞)来源于初生仔猪空肠的未转化的猪肠上皮细胞系,保留了猪肠上皮的特性,是研究猪肠道宿主与外界因子相互作用的良好模型[18-20]。本试验以IPEC-J2细胞为对象,研究AAPH诱导的氧化应激对IPEC-J2细胞活力及线粒体相关功能的影响,旨在建立一种稳定的IPEC-J2细胞氧化损伤模型,有助于研究肠上皮细胞氧化损伤的响应机制和关键作用靶点,为生产应用中开发安全、高效的饲用抗氧化剂提供可靠的模型和潜在作用靶点。

1 材料与方法 1.1 试验材料

AAPH购于美国Sigma-Aldrich公司;DMEM培养基购于美国Gibco公司;Hank’s平衡盐溶液(HBSS)、磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.2)、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(0.25%)和双抗(青霉素-链霉素)购于美国Thermo Fisher公司;动物基因组DNA快速抽提试剂盒、ROS检测试剂盒、BeyoClickTM EdU-488细胞增殖检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司;iTap Universal SYBR Green Supermix定量预混液购于美国Bio-Rad公司;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)、细胞增殖-毒性检测测试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司。

1.2 细胞培养

IPEC-J2细胞在含有10% FBS和1%双抗(青霉素-链霉素)的DMEM培养基中,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。当细胞生长至85%~90%时进行细胞铺板或传代,铺板前吸取10 μL细胞悬液于细胞计数板中计数。

1.3 指标检测 1.3.1 细胞活力

将细胞悬液接种在96孔板中,密度为2×104个/孔,边缘孔加入等体积的PBS,置于恒温培养箱中培养24 h。观察细胞生长状态,用含有不同浓度AAPH的培养基处理细胞,每个处理8个重复。前期预试验处理时间为0、4、8和24 h,后续正式试验处理时间为24 h。

处理结束后,更换含有CCK-8溶液的DMEM完全培养基(DMEM ∶ CCK-8溶液=9 ∶ 1),CO2恒温培养箱中避光孵育1 h,酶标仪450 nm吸光度(OD)读数。

1.3.2 细胞增殖

细胞计数后,将细胞悬液接种在24孔板中,密度为2.5×105个/孔,放入培养箱中培养24 h。更换新鲜的用含有不同浓度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的细胞培养基处理细胞24 h,每个处理6个重复。处理结束后,采用BeyoClickTM EdU-488细胞增殖检测试剂盒检测IPEC-J2细胞增殖情况,荧光显微镜下观察并拍照。

1.3.3 总ROS含量

采用ROS检测试剂盒测定总ROS含量。细胞计数后,将细胞悬液接种在96孔板(黑色透明底)中,密度为2×104个/孔,边缘孔加入等体积的PBS,放入培养箱中培养24 h。更换新鲜的用含有不同浓度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的细胞培养基处理细胞24 h,每个处理10个重复。处理结束后加入无血清DMEM稀释2′, 7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)(终浓度为10 μmol/L),37 ℃细胞培养箱中孵育20 min。用无血清细胞培养基洗涤细胞3次,充分去除游离的DCFH-DA,多功能酶标仪测定荧光强度,激发波长488 nm,发射波长525 nm。

1.3.4 线粒体膜电位

利用荧光探针JC-1检测AAPH对线粒体膜电位的影响。用含有不同浓度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的细胞培养基处理细胞24 h后,DMEM洗涤细胞1次,加入JC-1探针(终浓度为5 μmol/L),细胞培养箱中37 ℃孵育20~30 min。孵育结束后用DMEM洗涤细胞2次,加入新鲜的细胞培养液,荧光显微镜观察并拍照。

1.3.5 线粒体DNA(mtDNA)拷贝数

细胞计数后,将细胞悬液接种在48孔板中,密度为5×104个/孔,培养箱中培养24 h。更换新鲜的用含有不同浓度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的细胞培养基处理细胞24 h,每个处理8个重复。利用基因组DNA提取试剂盒提取细胞总DNA,荧光定量PCR检测细胞mtDNA拷贝数。本试验分别选取mtDNA编码的基因细胞色素C氧化酶亚基1(COX1)、ATP合酶亚基6(ATPase6)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基2(ND2)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基3(ND3)用于定量分析,以保守的单拷贝核基因胰高血糖素(GCG)作为内参基因,定量细胞中mtDNA拷贝数。相关基因引物序列见表 1

表 1 相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of related genes
1.3.6 线粒体功能相关基因mRNA表达水平

细胞计数后,将细胞悬液接种在12孔板中,密度为5×105个/孔,培养箱中培养24 h。更换新鲜的用含有不同浓度(0、30、32、34 mmol/L)AAPH的细胞培养基处理细胞24 h后收集细胞提取RNA,每个处理6个重复。

根据Trizol试剂(美国Invitrogen公司)说明书抽提细胞总RNA,NanoDrop测定RNA浓度。根据反转录试剂盒M-MLV Reverse Transcriptase Kit(美国Invitrogen公司)说明书合成cDNA模板。利用荧光定量PCR检测相关基因[线粒体转录因子A(TFAM)、线粒体转录因子B1(TFB1M)、线粒体转录因子B2(TFB2M)、解耦连蛋白1(UCP1)、解耦连蛋白2(UCP2)、解耦连蛋白3(UCP3)]mRNA的表达情况,根据geNorm分析方法从β-肌动蛋白(β-actin)、18S rRNA、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、β2微球蛋白(B2M)、次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶1(HPRT1)、核糖体蛋白L4(RPL4)和TATA结合蛋白(TBP)中选择最为适当的3个基因作为本项目中定量结果分析的内参基因。相关基因引物序列见表 1

1.4 数据分析

试验数据采用SPSS 24.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey多重比较,数据用平均值±标准误(mean±SE)表示,P < 0.05为差异显著。

2 结果与分析 2.1 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞活力的影响

图 1-A可以看出,与对照组(0 mmol/L AAPH处理)相比,当处理时间为4和8 h时,较低浓度(30、50、100 mmol/L)的AAPH处理对IPEC-J2细胞活力没有显著影响(P>0.05);200 mmol/L AAPH处理8 h显著降低IPEC-J2细胞活力(P < 0.05);400 mmol/L AAPH处理4和8 h均显著降低IPEC-J2细胞活力(P < 0.05);当处理时间为24 h时,不同浓度(30、50、100、200、400 mmol/L)的AAPH处理均显著降低IPEC-J2细胞活力(P < 0.05)。

***表示与对照组相比差异显著(P < 0.05)。数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下图同。 *** mean significant difference compared with the control group (P < 0.05). Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 1 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞活力的影响 Fig. 1 Effects of different concentrations of AAPH on viability of IPEC-J2 cells

图 1-B可以看出,与对照组相比,26 mmol/L AAPH处理24 h时,IPEC-J2细胞活力显著升高(P < 0.05);28 mmol/L AAPH处理24 h时对IPEC-J2细胞活力没有显著影响(P>0.05;30 mmol/L AAPH处理24 h时,IPEC-J2细胞活力在40%~70%,显著降低(P < 0.05);32、34、36和38 mmol/L AAPH处理24 h时,细胞活力均低于50%,显著降低(P < 0.05)。因此,后续研究中AAPH的处理时间为24 h,处理浓度为0、30、32和34 mmol/L。由以上结果可知,低浓度AAPH和(或)短时间处理,IPEC-J2细胞活力不受影响或一定程度上增加;而当AAPH浓度超过一定浓度阈值后,IPEC-J2细胞活力呈现剂量依赖性下降趋势,且与对照组相比均显著降低。

2.2 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞增殖的影响

图 2-A可以看出,与对照组相比,不同浓度AAPH处理IPEC-J2细胞后,视野内增殖细胞[5-乙炔基-2’-脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色]数量明显减少。由图 2-B可以看出,在6个随机选择的区域中计算细胞增殖的数量,不同浓度的AAPH处理均显著抑制IPEC-J2细胞增殖(P < 0.05)。

图 2 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞增殖的影响 Fig. 2 Effects of different concentrations of AAPH on proliferation of IPEC-J2 cells
2.3 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞线粒体功能的影响

不同浓度AAPH处理IPEC-J2细胞后,JC-1染色检测线粒体膜电位的变化,红色荧光的丧失和胞质中绿色荧光的增加表示线粒体膜电位的破坏。由图 3-A可以看出,未经处理的IPEC-J2细胞显示线粒体极化良好,显示为红色荧光点状染色,而用不同浓度AAPH处理的IPEC-J2细胞染色逐渐被扩散绿色荧光取代,表明线粒体膜电位降低[21]

A:线粒体膜电位;B:活性氧生成。 A: mitochondrial membrane potential; B: ROS formation. 图 3 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞线粒体功能的影响 Fig. 3 Effects of different concentrations of AAPH on mitochondrial function of IPEC-J2 cells

此外,由图 3-B可以看出,与对照组相比,不同浓度AAPH处理IPEC-J2细胞后,总ROS含量显著增加(P < 0.05),且与AAPH浓度成正比。

2.4 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞mtDNA拷贝数的影响

试验选取了4个线粒体基因(COX1、ATPase6、ND2和ND3),检测不同浓度AAPH处理对IPEC-J2细胞mtDNA拷贝数的影响。由图 4可以看出,与对照组相比,不同浓度AAPH处理后IPEC-J2细胞mtDNA拷贝数均显著降低(P < 0.05),且呈现出剂量依赖效应。

图 4 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞mtDNA拷贝数的影响 Fig. 4 Effects of different concentrations of AAPH on mtDNA copynumber of IPEC-J2 cells
2.5 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞线粒体生物合成相关基因mRNA表达的影响

图 5可以看出,不同浓度AAPH处理IPEC-J2细胞后,显著抑制了线粒体转录因子TFAMTFB1MTFB2M的mRNA表达水平(P < 0.05),其中TFB1M的mRNA表达水平下降趋势较小。此外,不同浓度AAPH处理IPEC-J2细胞后,显著抑制了UCP1和UCP3的mRNA表达水平(P < 0.05),而对UCP2的mRNA表达水平没有显著影响(P>0.05)。

图 5 不同浓度AAPH对IPEC-J2细胞线粒体生物合成相关基因mRNA表达的影响 Fig. 5 Effects of different concentrations of AAPH on mRNA expression of mitochondrial biogenesis-related genes of IPEC-J2 cells
3 讨论

肠上皮是一个多细胞界面,是肠道微环境和黏膜免疫系统之间的屏障,同时支持营养素、水和废物的矢量运输[22]。已有的研究表明,肠上皮功能受损与肠道和全身性许多疾病状态相关,受损的上皮可能在特定的胃肠道疾病中具有致病作用[22]。在生理或病理过程中,肠上皮细胞最早感受和响应外界刺激,在应激状态下最易受到氧化损伤[1-3]。肠上皮细胞具有独特的代谢特性,这由线粒体活性的变化反映出来。线粒体功能已成为决定细胞命运以及协调细胞代谢、免疫力、应激反应和细胞凋亡的关键因素,线粒体功能的改变与炎性肠病、结直肠癌等疾病的生理和病理过程密切相关[23]。因此,本研究采用自由基引发剂AAPH刺激IPEC-J2细胞,检测线粒体功能相关指标变化,建立肠上皮细胞氧化损伤模型。

本研究结果显示,不同浓度(30、32、34 mmol/L)AAPH长时间刺激导致IPEC-J2细胞活力显著下降。值得注意的是,低浓度AAPH和(或)短时间刺激在一定程度上提高了细胞活力,这一现象可能与ROS在细胞命运中的双重作用有关。已有的证据表明,短暂、低浓度的ROS爆发在生理上是有益的,而持续的高ROS含量则与病理进程有关[24]。为了进一步验证AAPH诱导的氧化应激对细胞增殖的影响,试验通过荧光标记物EdU检测了细胞增殖的情况,结果表明不同浓度AAPH处理均显著抑制IPEC-J2细胞增殖。

线粒体作为ROS产生的主要场所,极易受到压力和应激引起的氧化损伤,线粒体应激导致线粒体ROS(mROS)产生改变或线粒体膜电位丧失,从而引起不同的应激信号[24]。研究表明,细胞暴露在应激或风险因子(低氧、高糖、高胆固醇、感染、化学致癌物、电离辐射等)中会引起线粒体膜电位崩溃,导致线粒体产生过量的ROS[25-26]。本试验结果显示,不同浓度AAPH处理的IPEC-J2细胞线粒体膜电位降低,细胞中总ROS含量显著增加。类似的,在人角质形成细胞(HaCaT)中,AAPH处理显著增加细胞内ROS含量,降低线粒体膜电位[15, 27]

在许多损害呼吸链的病理条件下,mROS的产生显着增强,mtDNA位于呼吸链附近,对氧化损伤的敏感性高于核DNA(nDNA),因而它比nDNA受到的氧化损伤更大[28]。在持续的氧化应激条件下,可能最终导致mtDNA耗竭,因此mtDNA是线粒体功能障碍的生物标记之一[29-30]。本研究的结果也表明,不同浓度AAPH处理均导致IPEC-J2细胞中mtDNA拷贝数显著降低。有趣的是,癌细胞中mtDNA拷贝数的变化是异常调节的,与氧化应激增加有关,但可能显示增加或减少,具体取决于癌症类型、组织和疾病阶段[29]

线粒体的含量对细胞功能至关重要,取决于线粒体生物发生与线粒体之间的平衡,在细胞中受到严格调节[26]。新的线粒体形成受多种转录因子调控,包括TFAM和线粒体转录因子B(TFBMs)[26]TFAM转录的上调通常与mtDNA拷贝数的增加同时出现,这表明TFAM将核转录反应与mtDNA拷贝数联系起来,从而协调了2个基因组之间的线粒体生物发生[31]。类似地,本试验结果也显示,不同浓度AAPH处理均显著抑制TFAMTFBMs的表达,与此同时mtDNA拷贝数显著降低。

此外,线粒体定位蛋白家族中的解偶联蛋白(UCPs)参与ROS产生的控制,UCPs通常会限制mROS的产生进而保护细胞免受氧化应激[26]。在内皮细胞(EC)中,UCP1过表达抑制mROS的产生,并且人主动脉EC中UCP2的过表达阻断了脂肪酸诱导的mROS的产生[32-33]UCP2上调也可改善高血糖引起的内皮功能障碍[26, 34]。Cadenas等[35]发现,心脏中表达的UCP1同源物UCP2和UCP3通过减少ROS的产生来保护线粒体的氧化损伤。肌细胞中适度的UCP3过表达抑制了ROS的产生并增加了脂肪酸的氧化[36]。本试验结果显示,AAPH处理显著抑制IPEC-J2细胞中UCP1和UCP3的表达,对UCP2的表达没有显著影响。值得注意的是,与UCP1和UCP3不同,UCP2在AAPH诱导下的表达水平略有上升。此前也有报道显示患有慢性高血糖症的病人中UCP2的表达增加以及UCP3的表达减少可能会导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损,表明UCP2和UCP3在调节β细胞功能中可能具有不同的作用[37]。这些结果提示我们UCP2在肠上皮细胞氧化应激响应中可能具有不同的调控机制和作用。

本研究揭示了ROS介导的线粒体应激可能是IPEC-J2细胞响应氧化损伤的潜在机制之一(图 6)。通过一系列试验评估IPEC-J2细胞氧化损伤,建立了AAPH诱导的肠上皮细胞氧化应激模型,为进一步深入研究氧化应激对动物肠道健康影响提供了方便且稳定的体外模型,为开发安全、高效的饲用抗氧化剂提供了潜在的作用靶点。

AAPH:2,2’-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐2, 2-azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride;ROS:活性氧reactive oxygen species;mROS:线粒体活性氧mitochondrion reactive oxygen species;mtDNA:线粒体DNA mitochondrion DNA;ΔΨm:线粒体膜电位mitochondrial membrane potential;TFAM:线粒体转录因子A mitochondrial transcription factor A:TFBMs:线粒体转录因子B mitochondrial transcription factor B;UCP1/3:解偶联蛋白uncoupling protein 1/3。↑:上升increase;↓:下降decrease。 图 6 AAPH诱导的IPEC-J2细胞氧化损伤可能的应激响应机制 Fig. 6 Possible stress response pathways involved in AAPH-induced oxidative damage of IPEC-J2 cells
4 结论

① 在AAPH诱导的氧化应激中,IPEC-J2细胞活力下降,细胞增殖受到抑制,细胞内ROS含量升高,细胞线粒体膜电位降低,mtDNA拷贝数降低,线粒体生物合成相关基因表达受到抑制。

② 综合考虑各项指标,可采用30 mmol/L AAPH刺激IPEC-J2细胞24 h建立猪肠上皮细胞氧化损伤模型。

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