β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin，7S)是大豆中贮藏的一种主要蛋白质，分子质量为140~180 ku，为大豆总蛋白质含量的10.0%~12.7%，由α′亚基、α亚基和β亚基组成三聚体结构，分子质量分别为68、72和52 ku，易引起幼龄动物免疫球蛋白E(IgE)型过敏反应[1]。动物吸收大豆球蛋白的主要部位在小肠，小部分见于胃和大肠中[2-3]。幼龄动物采食β-伴大豆球蛋白后，肠道出现明显炎症浸润，使小肠通透性升高，损坏肠黏膜屏障，引起小肠炎症性疾病，严重损伤机体健康，降低动物生产性能[4-5]。肠上皮细胞(IEC)层暴露于肠腔内容物中，参与营养物质的选择性吸收，并通过相邻IEC之间的紧密连接(TJ)的表达，对肠腔内容物的被动细胞旁通透性起到屏障作用。本课题组前期研究证实，β-伴大豆球蛋白降低猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)TJ的表达，提高细胞通透性，降低细胞线粒体膜电位，抑制细胞增殖，引起IPEC-J2损伤和凋亡[6-8]；在前期用透射电镜观察β-伴大豆球蛋白引起IPEC-J2损伤和凋亡的过程中，常发现高浓度(10 mg/mL)的β-伴大豆球蛋白组中细胞形态异常肿胀、细胞膜破裂、细胞质流出、线粒体结构异常，细胞形态高度疑似细胞焦亡的外部形态。
细胞焦亡又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。NOD样受体蛋白-3(NLRP-3)是细胞内的一种蛋白质复合体，主要功能是活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)进而间接调控白细胞介素-1β(IL-1β)的成熟及分泌，诱导细胞焦亡，引起炎症反应。因此，本试验拟通过构建慢病毒靶向siRNA-NLRP-3干扰载体转染IPEC-J2后再添加10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白，分析β-伴大豆球蛋白是否通过NLRP-3/Caspase-1/消皮素D(GSDMD)信号通路引起仔猪小肠上皮细胞焦亡，介导过敏性炎症的发生，有助于认识其在仔猪肠道过敏反应发生发展和转归中的作用，为临床防治β-伴大豆球蛋白诱导的仔猪过敏性肠道疾病提供新思路。
1 材料与方法 1.1 试验材料β-伴大豆球蛋白购自中国农业大学食品工程学院，并进一步提纯至95%；IPEC-J2由武汉市农业科学院细胞库提供；RPMI 1640培养基购自美国Thermo公司；二辛可宁酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自Biosharp；β-肌动蛋白(β-actin)由爱必信(上海)生物科技有限公司提供；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗和山羊抗鼠二抗购自Biosharp；NLRP-3-shRNA慢病毒干扰载体及其阴性对照NC-shRNA慢病毒载体由广州易锦生物技术公司构建合成。
1.2 试验方法 1.2.1 细胞培养与转染将对数生长期的IPEC-J2以5×105个/孔的密度接种在6孔细胞板，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，当细胞融合度达到30%~40%时，随机分为A、B、C组，每组3个重复。A组(对照组，无添加)每24 h更换新鲜培养液。依据预试验参数[感染复数(MOI)=100]进行病毒悬液的感染，B组(阴性对照组)添加慢病毒空载体，C组(干扰组)添加携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体，并加入5 μg/mL的聚凝胺辅助转染，于培养箱内培养12 h后更换新鲜培养液继续培养。72 h后收集各组IPEC-J2，并通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)验证携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体是否沉默NLRP-3基因。
1.2.2 RT-qPCR、Western blot验证目的基因NLRP-3沉默效果收集A、B、C组细胞，并加入Trizol试剂提取总RNA，将RNA反转录合成cDNA作为模板，利用PCR仪扩增，以2-ΔΔCt法计算各组细胞中NLRP-3 mRNA相对表达量。NLRP-3 PCR引物序列为F: 5′-GACCTCAGCCAAGATGCAA-3′, R: 5′-GACCTCAGCCAAGATGCAA-3′; 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)PCR引物序列为F: 5′-TGACCCCTTCATTGACCTCC-3′, R: 5′-CCATTTGATGTTGGCGGGAT-3′。
收集A、B、C组细胞，进行Western blot检测。每个聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(12%)泳道加入20 μg的总蛋白电泳并转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上。PVDF膜4 ℃下与一抗孵育过夜后用Tris-HCl缓冲盐溶液+吐温(TBST)溶液清洗3次，进行二抗孵育。洗膜3次，放入凝胶成像系统显影拍摄，以β-actin作为内参蛋白校正试验误差。
1.2.3 试验分组与设计依据RT-qPCR和Western blot结果得知转染携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体成功沉默目的基因NLRP-3后，将对数生长期的IPEC-J2以5×105个/孔的密度接种在6孔细胞板，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。当细胞融合度达到30%~40%时，随机将细胞分为4组：A组为对照组(未转染)，B组为阴性对照组(转染慢病毒空载体)，C组为干扰组(转染携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体)，D组为β-伴大豆球蛋白调节组(转染携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体后添加10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白，继续培养24 h)，每组设置3个重复，转染方法参照1.2.1。
1.2.4 细胞活性测定按照6 000个/孔的密度将对数生长期中的IPEC-J2悬液(100 μL/孔)接种在96孔板中，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。当细胞融合度达到30%~40%时，随机分为A、B、C、D组，按照试验分组与设计将B、C和D组分别进行慢病毒转染(MOI=100)处理后，在D组添加10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白。继续培养24 h后，每孔加入10 μL的细胞增殖毒性检测试剂盒溶液，在细胞培养箱内继续孵育至出现明显的颜色反应。用酶标仪测定450 nm处的光密度(OD)值，检测细胞活性。
1.2.5 末端标记法(TUNEL)染色法观测细胞阳性表达收集A、B、C和D组细胞用10%中性甲醛固定，按照脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口TUNEL检测试剂盒说明书检测细胞死亡方式。采用红色荧光标记TUNEL阳性细胞，4, 6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI)染色细胞核，荧光显微镜下观察并采集图像。
1.2.6 Caspase-1和IL-1β含量测定收集A、B、C和D组细胞至离心管, 1 000 r/min离心5 min, 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次。随后在每组样品中加入500 μL含0.1% TritonX-100的0.1 mol/L Tris-HCl(pH=7.4), 冰水中超声裂解各组样品。收集细胞裂解液，1 000 r/min离心10 min后，吸取上清液，依据ELISA试剂盒说明进行试验，检测Caspase-1和IL-1β含量。
1.2.7 透射电子显微镜观察细胞形态收集A、B、C和D组细胞至离心管, 1 000 r/min离心5 min, 弃上清液，每管加入1 mL的4%多聚甲醛4 ℃下固定12 h后，PBS洗涤3次(4 ℃，5 000×g，15 min)，之后用2%锇酸渗透酸固定4 h。PBS冲洗后，用30%~100%酒精梯度脱水，渗透包埋，切割超薄切片染色，JEM-1230透射电子显微镜观察并拍摄图片。
1.2.8 RT-qPCR检测NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相对表达量收集A、B、C和D组细胞至离心管, 使用TRIzol试剂(invitrogen TRIzol® plus RNA purification kit)进行RNA分离，利用紫外分光光度计和电泳测定其含量、纯度及质量后贮存在-80 ℃备用。每个PCR反应混合物包含200 nmo/L的引物，10 μL的2×SYBR-green PCR master混合物(Roche货号：4913914001)，5 μL的cDNA和不含RNase的水, 总体积为20 μL。基因引物序列参数如表 1所示。
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表 1 基因引物序列参数 Table 1 Primer sequence parameters of genes |
收集A、B、C和D组细胞, 进行Western blot检验，以β-actin作为内参蛋白校正试验误差。
1.3 数据处理试验数据用平均值±标准差表示，采用SPSS 17.0软件的ANOVA进行方差分析，最小显著差异(LSD)法进行显著性比较，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。使用Graph Pad Prism 7.0软件绘制柱状图，使用Image J软件分析Western blot蛋白条带灰度值。
2 结果与分析 2.1 慢病毒转染IPEC-J2后成功沉默NLRP-3的表达如图 1、图 2所示，与A组相比，B组细胞中NLRP-3 mRNA相对表达量和蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)，C组细胞中的NLRP-3 mRNA相对表达量和蛋白表达水平均极显著降低(P＜0.01)；与B组相比，干扰组细胞中的NLRP-3 mRNA相对表达量和蛋白表达水平均极显著降低(P＜0.01)。结果表明，慢病毒转染IPEC-J2后成功沉默目的基因NLRP-3。
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*表示与A组相比差异显著(P＜0.05), * *表示与A组相比差异极显著(P＜0.01)。下图同。 * indicates significant difference compared with the group A (P < 0.05), and * * indicates extremely significant difference compared with the group A (P < 0.01). The same as below. 图 1 RT-qPCR检测NLRP-3 mRNA的相对表达量 Fig. 1 Relative expression level of NLRP-3 mRNA detected by RT-qPCR |
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图 2 Western blot检测NLRP-3蛋白表达水平 Fig. 2 Expression level of NLRP-3 protein detected by Western blot |
如图 3所示，与A组相比，B、C组细胞活性无显著差异(P>0.05)；与B组相比，C组细胞活性无显著差异(P>0.05)；与C组相比，D组细胞活性极显著下降(P＜0.01)。
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#表示与C组相比差异显著(P＜0.05), ##表示与C组相比差异极显著(P＜0.01)。下图同。 # indicates significant difference compared with the group C (P < 0.05), and ## indicates extremely significant difference compared with the group C (P < 0.01). The same as below. 图 3 β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞活性的影响 Fig. 3 Effects of β-conglycinin on cell viability of IPEC-J2 |
如图 4所示，与A组细胞相比，B、C组细胞无明显变化。与B组细胞相比，C组细胞无明显变化。与C组细胞对比，D组细胞密度降低，数量明显减少，细胞阳性表达明显增强。
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图 4 TUNEL染色法观察各组IPEC-J2阳性表达 Fig. 4 Positive expression of IPEC-J2 in each group observed by TUNEL staining method |
如图 5所示，与A组相比，B组细胞Caspase-1和IL-1β含量无显著差异(P>0.05)，C组细胞Caspase-1含量显著降低(P＜0.05)，IL-1β含量极显著降低(P＜0.01)；与B组相比，C组细胞Caspase-1和IL-1β含量显著降低(P＜0.05)；与C组相比，D组细胞Caspase-1和IL-1β含量极显著升高(P＜0.01)。
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图 5 β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞Caspase-1和IL-1β含量的影响 Fig. 5 Effects of β-conglycinin on Contents of caspase-1 and IL-1β in IPEC-J2 |
如图 6所示，与A组相比，B、C组细胞内部结构无明显变化；与B组相比，C组细胞内部结构无明显变化；与C组相比，D组细胞形态肿胀，细胞膜破裂出现孔洞、胞质疏松、胞质流出细胞膜，线粒体变性肿胀。
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红色箭头所示：线粒体变性肿胀，细胞膜破裂出现孔洞、胞质流出。 As shown by the red arrow: the mitochondria was degenerated and swelled, the cell membrane was ruptured with holes and cytoplasmic outflow. 图 6 β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2细胞超微结构的影响 Fig. 6 Effects of β-conglycinin on cell ultrastructure of IPEC-J2 (10 000×) |
如图 7所示，与A组相比，B组细胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)；C组细胞NLRP-3、Caspase-1和GSDMD mRNA相对表达量极显著降低(P＜0.01)，ASC和IL-1β mRNA相对表达量显著降低(P＜0.05)。与B组相比，C组细胞IL-1β mRNA相对表达量显著降低(P＜0.05)，NLRP-3、ASC、Caspase-1和GSDMD mRNA相对表达量极显著降低(P＜0.01)；与C组相比，D组细胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相对表达量极显著升高(P＜0.01)。
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图 7 β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2中NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD mRNA相对表达量的影响 Fig. 7 Effects of β-conglycinin on relative expression levels of NLRP-3, ASC, Caspase-1, IL-1β and GSDMD mRNA in IPEC-J2 |
如图 8所示，与A组相比，B组细胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD蛋白表达水平无显著差异(P>0.05)；C组细胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)。与B组相比，C组细胞Caspase-1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)，NLRP-3、ASC、GSDMD和IL-1β蛋白表达水平极显著降低(P＜0.01)。与C组相比，D组细胞NLRP-3、ASC、Caspase-1、GSDMD和IL-1β蛋白表达水平极显著升高(P＜0.01)。
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NLRP-3：NOD样受体蛋白-3 nod-like receptor pyrin domain-3；ASC：凋亡相关斑点样蛋白apoptosis-associated speck-like protein; Caspase-1:半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1 cysteine-containing aspartate-specific proteases-1;IL-1β: 白细胞介素-1β interleukin-1β; GSDMD: 消皮素D gsdermin D。 图 8 β-伴大豆球蛋白对IPEC-J2中NLRP-3、ASC、Caspase-1、IL-1β和GSDMD蛋白表达水平的影响 Fig. 8 Effects of β-conglycinin on expression levels of NLRP-3, ASC, Caspase-1, IL-1β and GSDMD protein in IPEC-J2 |
消化免疫系统尚未发育完善的仔猪采食β-伴大豆球蛋白后，小部分未分解的β-伴大豆球蛋白通过肠上皮细胞进入机体，引发由特异性抗体IgE介导的急性过敏反应，提高肠道通透性，损伤肠黏膜[1]。IPEC-J2位于仔猪小肠第1层，在构成完整的肠道管腔环境过程中发挥重要作用。研究发现，β-伴大豆球蛋白破坏IPEC-J2细胞骨架和紧密连接蛋白，降低IPEC-J2活性，抑制细胞生长增殖，诱导细胞凋亡[8-9]。IECs焦亡是区别于细胞凋亡、铁死亡、坏死和自噬的炎症性细胞死亡形式，并在急、慢性肠道损伤的发病过程中发挥关键作用[10]。NLRP-3是广泛存在于上皮细胞的炎性复合体，是引发细胞焦亡的关键因子[11-12]，被激活后通过其N端的热蛋白结构域(PYD)与凋亡相关斑点样蛋白(ASC)的PYD域相连，诱导ASC的胱天蛋白酶募集结构域(CARD)招募并激活Caspase-1[13-15]。激活的Caspase-1切割GSDMD蛋白引发细胞焦亡[16]。
NLRP-3/Caspase-1在过敏性疾病的发生发展过程中发挥重要作用[17-18]。本试验利用慢病毒转染IPEC-J2后，与A组相比，B组细胞的NLRP-3 mRNA相对表达量和蛋白表达水平无显著差异，而C组细胞的NLRP-3 mRNA相对表达量和蛋白表达水平极显著降低，结果表明转染慢病毒空载体对IPEC-J2的NLRP-3 mRNA相对表达量无显著影响，而携带NLRP-3干扰片段的慢病毒载体转染IPEC-J2可以显著提高基因的转染效率并能够成功沉默目的基因NLRP-3。利用RT-PCR和Western blot验证慢病毒转染成功沉默目的基因NLRP-3后将样本分为4组(A、B、C、D组)的试验中，B组细胞的Caspase-1含量以及NLRP-3、ASC、Caspase-1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平与A组相比无显著差异；C组细胞的Caspase-1含量以及NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著低于A组及B组细胞；这说明沉默IPEC-J2的NLRP-3基因后，可以显著下调NLRP-3通路下游的ASC和Caspase-1基因的表达量。与C组相比，D组细胞(在沉默NLRP-3基因的IPEC-J2培养液中加入10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白)的Caspase-1含量显著升高，NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著升高。本试验结果说明，10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白上调IPEC-J2 NLRP-3的表达，上调的NLRP-3通过炎性复合体衔接蛋白ASC招募并激活Caspase-1。Zhang等[19]用卵蛋白诱导小鼠建立过敏性呼吸道炎症模型发现，致敏组小鼠NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著上升；加入NLRP-3特异性抑制剂后NLRP-3、ASC和Caspase-1 mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著升高下降，这与本试验结果相符合。
GSDMD是细胞焦亡的执行蛋白，被活化的Caspase-1切割后，释放其具有结合膜磷脂上膜打孔活性的N端结构域，在细胞膜上形成活性的孔隙，使得水分子等物质进入细胞内而引起细胞肿胀、细胞膜破裂，导致细胞焦亡[20-21]。Gan等[22]研究发现，NLRP-3特异性抑制剂可以抑制GSDMD的活化，并抑制IL-1β的过度释放，缓解细胞焦亡。本试验中，C组细胞IL-1β含量，GSDMD和IL-1β mRNA相对表达量和蛋白表达水平均显著低于A、B组细胞，说明沉默IPEC-J2的NLRP-3基因能够显著抑制GSDMD和IL-1β的表达，这与Liu等[23]通过敲除NLRP3基因显著减少IL-1β分泌和抑制呼吸道上皮细胞焦亡的结果一致。Song等[24]研究表明，Caspase-1切割GSDMD蛋白后释放炎性介质IL-1β，进一步级联扩大炎症反应，导致细胞焦亡和肠组织损伤。本试验中，与C组相比，D组细胞IL-1β含量，GSDMD和IL-1β mRNA相对表达量和蛋白表达水平显著升高，细胞活性显著降低，TUNEL染色IPEC-J2呈阳性表达，透射电镜观察可见细胞膜出现孔洞、细胞肿胀裂解、细胞质外溢、线粒体肿胀病变、线粒体嵴消失，细胞外部形态及内部结构呈现典型的细胞焦亡状态。Kim等[25]发现NLRP-3炎性小体的激活与过敏性重症/难治性哮喘的发生显著相关，进一步研究发现尘螨等过敏源通过NLRP-3/Caspase-1/GSDMD信号通路诱导人支气管上皮细胞焦亡，本试验结果与此一致。这表明β-伴大豆球蛋白显著上调NLRP-3 mRNA相对表达量，上调的NLRP-3激活其下游的Caspase-1/GSDMD信号通路，进而过度释放炎性介质IL-1β，诱导IPEC-J2焦亡。
4 结论β-伴大豆球蛋白通过上调IPEC-J2的NLRP-3表达，激活NLRP-3/Caspase-1/GSDMD信号通路，诱导IPEC-J2焦亡。
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