动物营养学报    2021, Vol. 33 Issue (7): 4088-4097    PDF    
高寒草原天然牧草营养品质近红外光谱预测模型的建立
姚喜喜 , 孙海群 , 李长慧 , 张振西 , 陈善晶 , 谢久祥     
青海大学农牧学院, 西宁 810016
摘要: 本研究旨在探讨近红外光谱(NIRS)技术在定量分析高寒草原天然牧草营养品质的可行性。试验于2015—2018年,每年6—9月份,从青藏高原高寒草原放牧研究样地收集不同放牧强度(0、3.6、5.3、7.6只/hm2)的混合和4个优势种(莎草科矮生嵩草、蓼科珠芽蓼、蔷薇科金露梅和豆科锦鸡儿)牧草样品共计1 280份,随机分为定标样品集(n=854)和预测样品集(n=426),建立天然牧草干物质(DM)、粗脂肪(EE)、粗蛋白质(CP)、酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)含量及体外干物质消化率(IVDMD)和估算代谢能(EME)营养品质近红外光谱(NIRS)预测模型,实现天然牧草营养品质的快速和准确评估。结果显示:牧草DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和ME变异较大;DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的NIRS预测模型的验证决定系数(RCV2)为0.992~0.999,外部验证相对分析误差(RPD)为3.82~5.97,取得了最佳的定标效果,且定标方程均具较好的预测能力,能够成功应用于日常分析。EE含量的NIRS预测模型的RCV2为0.837,外部RPD为2.30,定标效果不理想,定标模型虽不能用于准确的定量分析测定,但仍能应用于牧草EE含量的粗略测定。综上所述,本研究建立的高寒草原天然牧草DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的NIRS预测模型能够成功应用于日常分析。
关键词: 高寒草原    天然牧草    营养品质    近红外光谱模型    
Prediction Model Establishment of Near Infrared Reflectance Spectroscopy for Nutrient Quality of Natural Forage in Alpine Grassland
YAO Xixi , SUN Haiqun , LI Changhui , ZHANG Zhenxi , CHEN Shanjing , XIE Jiuxiang     
College of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China
Abstract: The objective of this study was to explore the feasibility of near infrared reflectance spectroscopy (NIRS) technology in quantitative analysis of the nutrient quality of natural forage in alpine grassland. During 2015 to 2018 years, from June to September of each year, the mixed and four dominant species (Kobresia humilis, Polygonum viviparum, Potentilla fruticosa and Caragana sinica) with different grazing intensities (0, 3.6, 5.3 and 7.6 sheep/hm2) were collected from the alpine grassland of Qinghai Tibet plateau. A total of 1 280 forage samples were randomly divided into calibration sample set (n=854) and prediction sample set (n=426). The NIRS prediction models of forage nutritional quality were established, including the contents of dry matter (DM), ether extract (EE), crude protein (CP), acid detergent fiber (ADF) and neutral detergent fiber (NDF) and in vitro dry matter digestibility (IVDMD) and estimated metabolizable energy (EME), to realize the rapid and accurate evaluation of the nutrient quality of natural forage. The results showed that the contents of DM, CP, EE, ADF, NDF and IVDMD and EME of forage varied greatly; the determination coefficients of cross-validation (RCV2) of contents of DM, CP, ADF, NDF and IVDMD and EME predicted by NIRS prediction model was range from 0.992 to 0.999, the external ratio of performance to deviation for validation (RPD) was range from 3.82 to 5.97, it got the best calibration result, the calibration equations had good prediction ability and can be successfully applied to daily analysis. The RCV2 of EE content predicted by NIRS prediction model was 0.837, and the external RPD was 2.30, the calibration effect were not ideal. Although the calibration model could not be used for accurate quantitative analysis, it could still be applied to rough determination of EE content of forage. In conclusion, the established NIRS prediction models of contents of DM, CP, ADF, NDF and IVDMD and EME in this study can be successfully used in daily analysis.
Key words: alpine grassland    nature forage    nutrient quality    NIRS models    

牧草营养品质是评价草地资源最为重要的指标之一,牧草营养品质包括牧草常规营养成分含量和养分消化率,其直接决定家畜的生长和发育,也间接影响畜产品的产量和质量[1]。干物质(dry matter,DM)、粗脂肪(ether extract,EE)、粗蛋白质(crude protein,CP)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber,ADF)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)、体外干物质消化率(in vitro dry matter digestibility,IVDMD)和估算代谢能(estimated metabolizable energy,EME)是评价天然牧草营养品质的重要指标。牧草的营养品质与牧草种类、生育期、成熟期、施肥、气候条件等有着密切关系[2-3]。研究表明,不同种类牧草营养品质差异较大[4],同类牧草营养品质也会随其生育期的推移而显著下降[3, 5]。牧草营养价值广泛,但变异较大。因此,如何高效、快速、准确地对天然牧草营养品质进行无损检测,对如营养成分含量和养分消化率这些参数的简单和准确预测,是评估天然牧草营养供给和家畜能氮均衡需要的基础,也是合理开发利用和有效保护草地资源的重要依据[6]

动物营养学家长期以来一直认识到测定牧草中营养成分含量的重要性。已经建立了用于量化诸如蛋白质、能量或矿物质含量之类的饲料质量参数的各种传统的分析化学技术,并预测其营养价值[7-9]。然而,传统的天然牧草营养品质检测方法耗时、费力、成本昂贵,而且在某些情况下涉及到危险化学药品,检测方式难以与实际生产同步。因此,快速、及时、准确、廉价测定天然牧草营养品质,是解决当前草原生态保护和草地畜牧业生产的关键问题。

本试验从研究样地广泛收集不同天然牧草样品共计1 280份,测定其DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和ME这7项营养指标,并评价各个指标的变异程度;建立天然牧草中营养品质的近红外光谱(NIRS)预测模型,并通过比较其定标集和验证集样品对营养品质的预测效果评价,初步建立祁连山高寒牧区高寒草甸天然牧草DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和ME定量分析模型,以期为祁连山高寒牧区天然牧草营养价值数据库的建立提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 样品收集与制备

本试验于2015—2018年,每年6—9月份,从研究样地收集不同放牧强度(0、3.6、5.3、7.6只/hm2)的混合和4个优势种(莎草科矮生嵩草、蓼科珠芽蓼、蔷薇科金露梅和豆科锦鸡儿)牧草样品共计1 280份。对所收集的1 280份牧草样品分别采用四分法进行取样,将取样后大约250 g样品使用立体式粉碎机(CS200A,河北辰盛农业科技有限公司)粉碎后过40目网筛。制备好的样品分成3份,1份用于实验室湿化学分析,1份用于NIRS收集和扫描,1份作为预留样品。

1.2 营养指标测定及方法

牧草DM含量测定以风干牧草样品为基础[10],EE含量采用烘干法和传统索氏抽提法测定[10],CP含量采用全自动凯氏定氮仪(Foss Kheltec 8400)测定[11];ADF和NDF含量使用全自动纤维分析仪(ANKOM 2000 Fiber Analyzer),采用Van Soest纤维分析法测定[12];IVDMD的测定采用体外发酵装置(DaisyPIIP Incubator),应用Tilley等[13]的体外两步消化法测定;EME采用模型计算[14],公式为:

1.3 仪器参数及光谱采集

使用可见近红外快速成分光谱分析仪(XDS-RCA,美国FOSS公司)进行NIRS采集,该仪器采用硅检测器(400~1 100 nm)和硫化铅检测器(1 100~2 500 nm)双检测器系统;光谱分辨率为2 nm;仪器同时配备固定式和移动式样品扫描杯;样品装载于移动式样品杯中,扫描光谱范围为400~2 500 nm,波长间隔为2 nm;波长准确度小于0.05 nm;数据采集频率为2次/s,取平均值,并转化为log1/R数据形式记录数据。所有牧草营养品质测定指标均以DM基础表示。每份样品平行测定3次,取其均值作为建模的参比值,采用Kovalenko等[15]提出的牧草样品实验室检测误差(stardard error of laboratory,SEL)进行样品误差检测,计算公式为:

式中:yijyiNR分别代表第i个样品的j个重复的分析值、第i个样品所有重复测量值的平均值、样品数量、参比值分析的重复数。

相对实验室检测误差(relative standard error of laboratory,RESL)根据以下公式计算:

1.4 模型的建立与验证

NIRS技术流程主要分为校正模型的建立和未知样品的预测,如图 1所示[16]。样品按照3∶1的比例,随机从1 280份牧草样品中选择854份作为定标样品集(n=854),用来建立定标模型;剩余的426份作为预测样品集(n=426),对定标模型的预测结果进行外部验证。在所建立的定标模型中,CP、DM、IVDMD、EME、ADF和NDF在400~2 499 nm波长定标效果最佳,最佳定标方式分别为改进偏最小二乘法+矢量归一化+去散射处理+二阶导数处理、改进偏最小二乘法+矢量归一化+去散射处理+一阶导数处理、改进偏最小二乘法+矢量归一化+去散射处理+二阶导数处理、改进偏最小二乘法+矢量归一化+去散射处理+二阶导数处理、改进偏最小二乘法+矢量归一化处理+一阶导数处理和改进偏最小二乘法+矢量归一化+去散射处理+二阶导数处理,光谱间隔点均为4,一次平滑处理光谱间隔点均为4,二次平滑处理光谱间隔点均为1。利用WinISI Ⅲ定标分析软件,对定标集样品进行聚类分析和运算,选择具有代表性样品,剔除异常样品,输入牧草营养成分和消化率等数据后利用WinISI Ⅲ软件建立定标模型。

图 1 NIRS技术分析流程 Fig. 1 Analysis process of NIRS technology

采用独立的验证集对所建立的定标模型进行外部验证。以决定系数(coefficient of determination,R2)、定标决定系数(coefficient of determination for calibration,Rcal2)、验证决定系数(determination coefficients of cross-validation,RCV2)、验证标准差(standard error of cross-validation,SECV)、验证相对分析误差(ratio of performance to deviation for validation,RPD)作为衡量模型预测准确性的有效参数。本模型依据美国谷物化学家协会(AACC)39-00规定[17],选择RPD作为模型预测建立成功与否以及模型预测准确性的评价指标(表 1),当RPD≥2.25时,认为模型相当成功,可用于日常分析。除了这些标准之外,R2 < 0.70的一些校准被认为扫描的数据有用[18]

表 1 校准性能标准 Table 1 Calibration performance criteria[18]
2 结果 2.1 牧草样品光谱扫描结果

1 280份牧草样品原始NIRS扫描光谱曲线图如图 2-a所示。牧草样品原始光谱在可见光和NIRS区域均有吸收,表现出了明显的吸收峰,不同样品由于散射所表现出的扫描吸收曲线表现出各样品之间的平行移动特点,各吸收曲线变化一致且能互相区分,吸收峰较宽、基线垂直漂移,表明可以用于进一步分析和建模。原始样品NIRS通过二阶导数处理后(以2, 4, 4, 1为例),样品的光谱差异更加明显,吸收峰也得到明显的增强,同时,基线垂直漂移状况得到了有效的校正(图 2-b)。二阶导数+去散射法处理后(以标准正态变量校正结合去除趋势校正为例),消除了原始样品NIRS受去散射现象的影响,各牧草样品NIRS平移现象得以改善(图 2-c)。

a:全集样品图谱spectra of all samples;b:二阶导数(2, 4, 4, 1) second derivative (2, 4, 4, 1);c:二阶导数+标准正态变量校正结合去除趋势校正(SNVD) second derivative+stamdard normal variate plus derend correction (SNVD)。 图 2 1 280份牧草样品不同光谱预处理下的NIRS扫描光谱曲线图 Fig. 2 NIRS scanning spectrum of 1 280 samples of forages in different spectral pretreatment
2.2 全集、定标集和验证集样品营养品质测定

牧草中全集、定标集和验证集的常规营养成分含量、IVDMD和EME见表 2,所有营养品质指标均以DM为基础。全集牧草样品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分别为80.38%~98.91%、3.13%~25.10%、0.91%~7.70%、19.98%~58.71%、36.95%~79.38%、38.77%~75.21%和4.88~11.07 MJ/kg,平均值分别为94.33%、11.38%、2.88%、38.15%、62.52%、56.96%和7.97 MJ/kg。定标集牧草样品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分别为91.20%~96.78%、3.13%~21.54%、1.18%~7.47%、27.61%~55.64%、38.47%~75.47%、40.90%~68.84%和5.24~9.99 MJ/kg,平均值分别为94.12%、10.81%、2.71%、38.33%、62.88%、56.57%和7.91 MJ/kg。验证集牧草样品的DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME分别为80.38%~98.91%、4.31%~25.10%、0.91%~7.70%、19.98%~58.71%、36.95%~79.38%、38.77%~75.21%和4.88~911.07 MJ/kg,平均值分别为94.43%、11.64%、2.95%、38.07%、62.35%、57.14%和8.00 MJ/kg。所测全集、定标集和验证集牧草营养品质标准差和变异系数分别为0.97%~9.35%、10.11%~27.03%、0.91%~7.76%和10.12%~30.81%、0.03%~0.94%和10.02%~33.38%。

表 2 牧草中常规营养成分含量、IVDMD和估算代谢能(干物质基础) Table 2 Routine nutrient content, IVDMD and estimated metabolizable energy of forages (DM basis)  
2.3 定标集样品的最佳定标方式及模型参数

通过对854个定标集牧草样品NIRS进行预处理,确定了牧草中常规营养成分含量、IVDMD和EME的最佳定标方式,定标结果如表 3所示。在所建立的定标模型中,CP、DM、IVDMD、EME、ADF和NDF的定标标准偏差(SEC)分为0.001 1、0.902 2、0.378 9、4.454 8、0.171 7和0.344 5,内部交互验证标准偏差(SECV)分别为0.008 7、0.007 1、0.020 4、0.336 2、0.024 2和0.035 8,而内部交互验证相关系数(1-VR)分别为0.967 2、0.947 1、0.929 5、0.925 1、0.915 9和0.909 5。

表 3 牧草营养品质的最佳定标方式及定标结果 Table 3 The best calibration method of forage nutrient quality and calibration results
2.4 验证集样品定标模型的外部验证结果

天然牧草中常规营养成分含量、IVDMD和EME定标模型的外部验证结果如表 4所示。各营养指标定标模型的RCV2在0.837~0.999。其中,DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的RCV2均较高,且均大于0.992,而EE含量的RCV2最低,为0.837。模型对于DM、CP含量及IVDMD、EME的外部验证结果非常成功,外部验证的RPD均在4以上;对于ADF、NDF含量的外部验证结果成功,RPD均在3~4;对于EE含量的外部验证预测效果不太成功,但适度可用,RPD为2.3。牧草营养品质定标模型能够成功应用于对DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的分析,定标方程对DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的预测效果非常好,而对EE含量的预测效果不理想。

表 4 牧草营养品质定标模型的外部验证结果 Table 4 External prediction result of calibration model of forage nutrient quality
3 讨论

自1976年最早开展了对牧草8种营养成分进行NIRS预测饲料营养成分潜力的研究以来,NIRS技术在预测牧草营养成分的研究和应用已走过了40余年的时间[19-26]。迄今为止,NIRS技术用于检测牧草营养成分的相关研究资料已有很多,主要检测成分包括DM、CP、EE、粗灰分(Ash)、ADF、NDF、钙(Ca)、磷(P)含量及IVDMD等,相应地在建立了一些适用于部分地区特定牧草的NIRS预测模型[8, 20, 27-30]。但由于牧草营养品质受牧草种类组成、生长年际降雨量、生长季节、土壤肥力等多种因素的综合影响,现已有的模型并没有完全考虑上述因子的影响,开发的模型实用性和完整性非常欠缺,不能较好的适应特定区域草地牧草生产和家畜放牧营养均衡管理[31-32]。为保证NIRS技术对特定牧区牧草营养品质的准确预测,实现放牧家畜的精准管理和补饲,对于评价草畜营养均衡需要、更好地利用和保护天然草地资源、实现草原永续发展来说,建立针对牧草种类、年际降雨、生长季节不同和不同载畜量的NIRS快速检测模型非常必要。

本研究对祁连山高寒牧区高寒草甸2015—2018年,每个放牧年份6—9份,从研究样地收集的不同放牧强度(0、3.6、5.3、7.6只/hm2)的混合和4个优势种(莎草科矮生嵩草、蓼科珠芽蓼、蔷薇科金露梅和豆科锦鸡儿)牧草样品共计1 280份,进行了DM、CP、EE、ADF、NDF含量及IVDMD和EME营养品质测定,并试图建立NIRS预测模型,通过对初步建立的天然牧草营养品质NIRS预测模型进行定标和校验,结果表明了所建立的定标模型对DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD、EME营养品质指标的验证结果最佳,其中,模型对于DM、CP含量及IVDMD、EME的RPD均在4以上;对于ADF、NDF含量的RPD在3~4;对于EE的外部验证预测效果较不理想,RPD为2.3,说明所建立的定标模型对EE指标的粗略定量分析是可行的,但精度有待提高。本研究建立的模型预测与李洁等[33]利用新疆伊犁昭苏草原5—10月份的5种单一品种牧草及混合牧草建立的牧草营养成分相关预测模型进行对比发现,本研究所建立的NIRS预测模型在预测DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME营养品质指标时预测准确性评价指标RPD均高于李洁等[33]的建模结果,而对EE含量预测效果与李洁等[33]建模效果一样仅能用于粗略测定;与薛祝林等[34]利用紫花苜蓿草捆样品建立的营养品质和消化率预测模型CP、NDF、ADF含量和IVDMD预测的RPD介于2.5~3.0相比,本研究的RPD介于3.8~5.9,模型预测准确性显著提高;与聂志东等[9]建立的对紫花苜蓿青干草DM、CP、ADF、NDF含量预测模型,陈鹏飞等[35]建立的用于青贮苜蓿鲜样DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD预测模型相比,预测准确性均有所提高;与De Boever等[7]和Shenk等[25]建立的青贮玉米DM、EE、CP、ADF、NDF含量测定预测模型和红三叶中DM、CP、NDF、Ca、P含量预测模型相比,本研究在DM、CP和ADF含量预测的准确性上有所提高。本研究对EE含量的预测效果较差,这一结论与李洁等[33]、薛祝林等[34]和De Boever等[7]的研究结果一致,可能的原因除实验室测定误差较大和样品间差异较小之外,也与EE在牧草样品中的含量少和灵敏度低有关。因此,在今后的研究工作中,需要进一步降低实验室测定误差、进一步扩充样本量等多种方法对定标方程进行逐步校正,从而实现NIRS预测模型对高寒草地天然牧草EE含量的准确预测。

目前,国内外有关NIRS技术在农业方面的研究应用主要体现在新疆昭苏草原、人工牧草和青贮饲料营养成分预测几个方面,由于高寒草地天然牧草营养成分和品质易受气候、海拔、牧草种类、生长季节、放牧及土壤养分等因素的影响[36-40],目前NIRS技术在祁连山高寒草原天然牧草营养成分和品质评价方面的应用未有报道,尚未建立不同年份、不同季节、不同放牧强度和不同物种营养品质定量分析模型,在祁连山高寒草地天然草原牧草营养成分、消化率、代谢能预测方面的研究更是鲜见报道,因此,建立祁连山高寒草原天然牧草营养品质NIRS预测模型非常必要。

4 结论

本试验利用NIRS技术建立了祁连山高寒牧区高寒草甸天然牧草DM、CP、ADF、NDF、EE含量及IVDMD和EME的近红外预测模型。其中,模型对于DM、CP、ADF、NDF含量及IVDMD和EME的外部RPD均大于3.82,可用于实际测定;而对于EE含量的外部RPD为2.30,模型预测效果不太成功,但适度可用。

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