产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC)破坏肠道菌群平衡，损伤肠道正常形态，引发炎症反应，是断奶仔猪高腹泻率和较差生长性能的主要原因之一，给养猪业造成了巨大的经济损失[1]。饲粮添加土霉素等抑制ETEC的饲用抗生素，显著降低了断奶仔猪腹泻，一定程度上改善了仔猪生长性能[2]。然而，随着我国农业农村部发布第194号公告，规定于2020年7月1日起全面禁止促生长药物饲料添加剂的使用，研发替代抗生素的功能性安全饲料添加剂迫在眉睫。
饲用益生菌是一类用以维持动物肠道微生态平衡和改善动物机体生理生化的功能性添加剂[3]。已有报道证明，饲用益生菌凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)具有高效抑制ETEC等多种肠道有害菌、维持肠道微生态平衡的作用，且凝结芽孢杆菌具有良好的耐热性，适合颗粒饲料添加[4-5]，因此成为近年来研究与生产推广的热点[6-7]。大量试验报道[7-9]，卫生条件控制较好的科学试验条件下，饲用凝结芽孢杆菌能够显著改善正常断奶仔猪的生长性能。然而，实际上我国生猪养殖卫生条件差异较大，以往的试验数据与结论是否能够支撑饲用凝结芽孢杆菌在断奶仔猪料中的普遍性推广，值得深入探讨。目前，只有Pu等[10]的1篇报道模拟较差的养殖卫生环境，采用ETEC K88感染仔猪模型发现，饲粮添加复合功能性添加剂(0.2×107 CFU/g凝结芽孢杆菌及苯甲酸、牛至油)，能够显著改善ETEC K88感染仔猪的腹泻和生长性能。鉴于此，为了符合养猪生产多样的卫生条件，本研究首次采用体内、体外相结合的2个试验，验证饲粮单一添加凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染断奶仔猪生长性能和肠道的作用效果，为饲用凝结芽孢杆菌在仔猪养殖生产中的推广提供更多的科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用凝结芽孢杆菌制剂(菌株编号YNAU 5517，总菌数0.91×1010 CFU/g)由云南农业大学提供[11]；ETEC K88标准菌株(CGMCC1.2385)购买于北纳生物科技有限公司；土霉素由昆明三正生物科技(集团)有限公司购买。
1.2 抑菌试验试验设计阴性对照组(无菌蒸馏水组)和阳性对照组(土霉素组)，采用经典牛津杯抑菌试验评估法[12]，对比该株凝结芽孢杆菌对ETEC K88的抑制作用及效果，为后续饲用凝结芽孢杆菌改善口服ETEC K88感染仔猪生长性能及肠道健康奠定基础。土霉素配制成400 mg/L溶液，依据《饲料药物添加剂使用规范》中全价配合饲料允许添加量范围的上限。
牛津杯法评估与分析该株凝结芽孢杆菌抑制ETEC K88的方法参考李静舒等[13]最新报道。抑菌圈直径测定与数据统计简述如下：用游标卡尺测定3个处理的抑菌圈直径(含所用牛津杯的外径值7.8 mm)最大值和最小值，并计算平均值，以确定抑菌圈直径数据。为了对3个处理的抑菌直径进行方差分析，将没有抑制作用的抑菌圈直径值，定义为7.8 mm[13]。此外，依据本次试验所用牛津杯的直径值(7.8 mm)，将牛津杯外径的约2倍16.0 mm区分为“敏感”与“高敏感”，因此抑菌作用判定标准如下：“不敏感”，抑菌圈直径=7.8 mm，无抑制作用；“敏感”，7.8 mm < 抑菌圈直径≤16.0 mm，有一定抑制作用；“高敏感”，抑菌圈直径>16.0 mm，有较强抑制作用。
1.3 ETEC K88感染试验 1.3.1 试验设计试验选用32头25日龄断奶的健康“杜×长×大”商品公猪，按照初始体重一致原则分成4个组，每组8个重复，单笼饲养。ETEC K88感染前7 d(试验第1~7天)，2个组饲喂基础饲粮(BD组)，另外2个组饲喂在基础饲粮中添加1.0×107 CFU/g凝结芽孢杆菌的饲粮(PD组)。第8天起，开展2×2双因素试验(因素1，口服ETEC K88感染处理；因素2，饲用凝结芽孢杆菌处理)，4个组设计如下：1)NCH+BD组，口服生理盐水、饲喂基础饲粮；2)NCH+PD组，口服生理盐水、饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮；3)CH+BD组，口服ETEC K88、饲喂基础饲粮；4)CH+PD组，口服ETEC K88、饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮。第8~10天，每天08:00，试验猪口服5 mL ETEC K88(活菌数1.0×109 CFU/mL)或5 mL 0.9%生理盐水，每天1次[10]。
1.3.2 试验饲粮参照NRC(2012)猪营养需要量标准配制基础饲粮，其组成及营养水平见表 1，基础饲粮中不添加任何饲用抑菌药物及其他益生菌。凝结芽孢杆菌制剂依据课题组前期报道[9, 14]，在基础饲粮中添加1.1 kg/t，添加量为1.0×107 CFU/g。所有饲粮经80 ℃制粒。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验在云南省玉溪市正和猪场完成。试验猪代谢笼(长×宽×高=1.1 m×0.4 m×0.9 m)单笼饲养，保育舍温度保持26~28 ℃。试验全程自由采食和饮水，24 h光照。饲养试验周期10 d。
1.3.4 样品采集试验第11天08:00所有试验猪称重后屠宰，取空肠和盲肠食糜样品，放置-80 ℃冰箱中保存待测大肠杆菌和乳酸杆菌数量。空肠和回肠组织取样并固定后(4%多聚甲醛)，用于绒毛高度和隐窝深度测定。刮取空肠黏膜，放置-80 ℃冰箱中保存待测细胞因子表达量。
1.3.5 指标测定 1.3.5.1 生长性能试验第1、8和11天08:00仔猪称重，分别统计ETEC K88感染前和感染3 d期间的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)和腹泻指数。腹泻指数计算方法参考蒲俊宁[15]的报道。
1.3.5.2 肠道细菌数量采用平板计数法[16-17]，检测空肠和盲肠食糜中大肠杆菌和乳酸杆菌数量。空肠和盲肠食糜中凝结芽孢杆菌数量测定参考柳成东等[11]的报道。检测数据用lg(CFU/g)表达。
1.3.5.3 肠道形态肠道形态学检测参考Nosworthy等[18]报道的苏木精-伊红染色法，简述如下：甲醛固定后的肠组织样品修剪成1 cm3大小的样品块，经二甲苯漂洗，并石蜡包埋。每个包埋好的样品切出4个5 μm厚的切片，用苏木精-伊红染色。切片在尼康双筒目镜(Warsaw公司，波兰)下测定肠绒毛高度和隐窝深度，每张切片至少连续观测30根绒毛。
1.3.5.4 细胞因子表达量参考Che等[19]报道的实时荧光定量法，检测空肠黏膜细胞因子白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)mRNA表达量，简述如下：提取空肠黏膜IL-6和IL-10的总RNA，反转录后进行PCR定量。选取磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因作为内参基因，引物序列见表 2。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
体外抑菌试验的抑菌圈直径采用SPSS 17.0进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较；ETEC感染前生长性能数据采用t检验统计分析；口服ETEC感染试验模型数据采用2×2双因素方差分析，分别统计ETEC感染处理效应、饲用凝结芽孢杆菌处理效应及其二者互作效应。结果以平均值和均值标准误表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 凝结芽孢杆菌对ETEC K88的抑制效果由图 1可知，凝结芽孢杆菌对ETEC K88的抑制作用达到“敏感”(抑菌圈直径=15.2 mm)，其抑制效果显著小于土霉素(抑菌圈直径= 17.0 mm，“高敏感”)(P < 0.05)。此外，阴性对照组无菌蒸馏水对ETEC K88没有抑制作用(“不敏感”)。
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Ⅰ组，无菌蒸馏水组；Ⅱ组，土霉素组；Ⅲ组，凝结芽孢杆菌组。数据柱标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，相同小写字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。 Group Ⅰ, sterile distilled water group; group Ⅱ, oxytetracycline group; group Ⅲ, Bacillus coagulans group. Value columns with different small letter superscripts mean significant difference (P < 0.05), while with the same small letter or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below. 图 1 凝结芽孢杆菌对ETEC K88的抑制效果 Fig. 1 Inhibitory effect of Bacillus coagulans on ETEC K88 |
由表 3可知，ETEC K88感染前7 d，与BD组(饲喂基础饲粮)相比，PD组(饲喂添加凝结芽孢杆菌的饲粮)断奶仔猪平均日增重和平均日采食量显著提高(P < 0.05)，料重比和腹泻指数显著降低(P < 0.05)。
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表 3 饲用凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染前断奶仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of dietery Bacillus coagulans on growth performance of weaned piglets before ETEC K88 challenge |
由表 4可知，口服ETEC K88持续感染3 d显著降低断奶仔猪平均日增重和平均日采食量(P < 0.05)，显著提高料重比和腹泻指数(P < 0.05)；饲粮添加凝结芽孢杆菌显著提高断奶仔猪平均日增重和平均日采食量(P < 0.05)，显著降低料重比和腹泻指数(P < 0.05)。除腹泻指数外，ETEC K88感染处理与饲用凝结芽孢杆菌处理之间对其他生长性能指标均无显著互作效应(P>0.05)。
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表 4 饲用凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染3 d断奶仔猪生长性能的影响 Table 4 Effects of dietary Bacillus coagulans on growth performance of weaned piglets challenged with ETEC K88 for 3 days |
由表 5可知，ETEC K88感染处理显著增加断奶仔猪空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量(P < 0.05)，显著减少空肠和盲肠食糜中乳酸杆菌数量(P < 0.05)；饲粮添加凝结芽孢杆菌显著减少空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量(P < 0.05)，显著增加空肠和盲肠食糜中乳酸杆菌数量(P < 0.05)。此外，ETEC K88感染处理与饲用凝结芽孢杆菌处理之间对以上肠道细菌测定指标均无显著互作效应(P>0.05)。
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表 5 饲用凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染断奶仔猪肠道菌群的影响 Table 5 Effects of dietary Bacillus coagulans on intestinal flora of weaned piglets challenged with ETEC K88 |
由图 2可知，NCH+PD组仔猪空肠食糜中凝结芽孢杆菌数量显著高于CH+PD组(P < 0.05)。然而，NCH+PD组与CH+PD组之间盲肠食糜中凝结芽孢杆菌数量无显著差异(P＞0.05)。此外，饲粮未添加凝结芽孢杆菌的NCH+BD组和CH+BD组未检测出凝结芽孢杆菌。
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图 2 断奶仔猪空肠和盲肠食糜中凝结芽孢杆菌的数量 Fig. 2 Bacillus coagulans number in jejunal and cecal digesta of weaned piglets |
由表 6可知，ETEC K88感染处理显著降低断奶仔猪空肠和回肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度值(P < 0.05)，显著提高空肠和回肠的隐窝深度(P < 0.05)；饲粮添加凝结芽孢杆菌显著提高空肠和回肠的绒毛高度和绒毛高度/隐窝深度值(P < 0.05)，显著降低空肠的隐窝深度(P < 0.05)，且对回肠的隐窝深度有降低的趋势(P=0.068)。此外，ETEC K88感染处理与饲用凝结芽孢杆菌处理之间以上肠道形态指标均无显著互作效应(P>0.05)。
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表 6 饲用凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染断奶仔猪肠道形态的影响 Table 6 Effects of dietary Bacillus coagulans on intestinal morphology of weaned piglets challenged with ETEC K88 |
由图 3可知，ETEC K88感染处理显著提高断奶仔猪空肠黏膜IL-6 mRNA表达量(P < 0.05)，显著降低空肠黏膜IL-10 mRNA表达量(P < 0.05)；饲粮添加凝结芽孢杆菌显著降低空肠黏膜IL-6 mRNA表达量(P < 0.05)，显著提高空肠黏膜IL-10 mRNA表达量(P < 0.05)。此外，ETEC K88感染处理与饲用凝结芽孢杆菌处理之间对以上细胞因子指标均无显著互作效应(P>0.05)。
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图 3 饲用凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染断奶仔猪空肠黏膜细胞因子表达量的影响 Fig. 3 Effects of dietary Bacillus coagulans on cytokine expression level in jejunal mucosa of weaned piglets challenged with ETEC K88 |
本试验中，阴性对照组无菌蒸馏水对ETEC K88没有抑制作用，阳性对照组土霉素对ETEC K88的抑制达到“高敏感”。以上结果表明，本次体外抑菌试验可用于比较评估凝结芽孢杆菌对ETEC K88的抑菌效果。本试验结果显示，试验所用凝结芽孢杆菌(菌株编号YNAU 5517)对ETEC K88的抑菌圈直径为15.2 mm，抑制作用判定为“敏感”，抑制效果统计分析略低于土霉素。汪攀等[4]报道，凝结芽孢杆菌(菌株编号NJ102)对ETEC K88有较强的抑制作用。同年，张韵等[5]评估的4株凝结芽孢杆菌(菌株编号BC147、BC235、BC310和BC303)对ETEC K88均有显著抑制作用。ETEC K88感染是断奶仔猪腹泻的主要原因之一，因此这一体外抑菌试验结果为本研究后续构建口服ETEC K88感染仔猪试验模型，验证该株饲用凝结芽孢杆菌能否改善断奶仔猪肠道健康与生长性能奠定了良好的研究基础。
3.2 饲用凝结芽孢杆菌对感染ETEC K88断奶仔猪生长性能的影响大量综述文章提示，包括凝结芽孢杆菌在内的芽孢杆菌属饲用益生菌，一般以芽孢体的形式添入饲粮，在畜禽胃肠内需要一定时间活化为营养体，并增殖、增生，才能更有效地发挥益生促生长作用[6, 20-21]。为了更贴近我国养猪生产不同卫生状况的实际需求，突出饲用凝结芽孢杆菌的预防效果，本研究将仔猪饲养试验分成2个阶段实施：阶段1，不感染ETEC K88条件下，开展预饲凝结芽孢杆菌7 d的对比试验；阶段2，随后实施3 d持续口服ETEC K88感染处理及饲用凝结芽孢杆菌处理的2×2双因素试验。该试验设计与前人[1, 22-23]报道其他饲用益生菌在断奶仔猪上应用的试验设计相似。本试验结果显示，ETEC K88感染仔猪的腹泻指数和料重比显著提高，平均日增重和平均日采食量显著降低。这与前人报道的ETEC K88感染仔猪模型结果[10, 19, 23-25]一致，表明本研究建立的口服ETEC K88感染仔猪模型合理。
本试验结果显示，无论是否ETEC K88感染处理，饲用凝结芽孢杆菌处理均能显著降低断奶仔猪的料重比，显著提高平均日增重和平均日采食量；且ETEC K88感染处理与饲用凝结芽孢杆菌处理之间对上述生长性能指标无显著互作效应。本课题组前期试验结果[9, 14]证明：与基础饲粮组相比，1.0×107 CFU/g饲用凝结芽孢杆菌能显著降低正常断奶仔猪腹泻率和料重比，显著提高平均日增重。Pu等[10]进一步采用ETEC K88感染仔猪模型试验发现，饲粮添加凝结芽孢杆菌(0.2×107 CFU/g)、苯甲酸和牛至油的组合添加剂，能够显著降低ETEC K88感染仔猪的腹泻指数和料重比，显著提高平均日增重和平均日采食量。以上报道与本研究结果基本一致。
然而，Wu等[26]报道，饲粮添加2×106和2×107 CFU/g凝结芽孢杆菌，对21日龄正常断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量无显著影响。分析Wu等的[26]报道，本课题组推测生长性结果造成差异的原因，包括：1)不同凝结芽孢杆菌菌株的益生作用有差异。张韵等[5]筛选的4株凝结芽孢杆菌(菌株编号BC147、BC235、BC310和BC303)虽然对ETEC K88均有抑制作用，但抑菌圈直径值统计有显著差异，这提示不同凝结芽孢杆菌的菌株对ETEC K88的抑菌效果有明显差异。据此推测，抑菌效果不同的凝结芽孢杆菌加入饲粮，其在肠道中发挥的益生作用可能有一定差异，最终导致生产性能的结果不同。2)试验动物的个体差异，包括仔猪断奶的日龄、体重及健康状况等。Wu等[26]课题组使用了21日龄体重6.04 kg较小的断奶仔猪，在10 d的试验期间，对照组仔猪平均日增重和平均日采食量的组内数据变异系数分别达到23.7%和35.4%，且2个添加饲用凝结芽孢杆菌组仔猪的平均日增重和平均日采食量变异系数也较大。据此推测，Wu等[26]试验仔猪生长性能数据的组内变异较高，可能是数据统计未能体现凝结芽孢杆菌改善生长性能效果的主要原因。这也充分凸显本研究结合了体外抑菌试验来评估单株饲用凝结芽孢杆菌益生效果的合理性。
3.3 饲用凝结芽孢杆菌对感染ETEC K88断奶仔猪肠道菌群的影响肠道菌群平衡是肠道健康的重要指标之一，能够保障仔猪断奶的生长性能[27]。大肠杆菌是仔猪肠道的主要致病菌，不利于生长性能[28]；乳酸杆菌是仔猪肠道的优势有益菌，对仔猪生长性能和肠道健康具有重要意义[29]。本试验中，ETEC K88感染处理导致断奶仔猪空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量显著增加，乳酸杆菌数量显著减少，这与前人的报道[10, 23, 30]基本一致。本试验结果显示，饲用凝结芽孢杆菌处理显著降低了ETEC K88感染断奶仔猪空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量，显著提高空肠和盲肠食糜中乳酸杆菌数量。Pu等[10]使用饲用凝结芽孢杆菌及苯甲酸、植物精油的组合添加剂，在ETEC K88感染仔猪试验模型上获得了与本试验相似的结果。
为了进一步证明饲喂该株凝结芽孢杆菌能够在断奶仔猪肠道发挥平衡菌群、改善生长性能的作用，本研究首次检测了所有组仔猪空肠和盲肠食糜中凝结芽孢杆菌的数量，这在以往的文献中没有报道。结果显示：饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮的NCH+PD组和CH+PD组断奶仔猪空肠食糜中凝结芽孢杆菌数量分别为4.7×105和3.6×105 CFU/g，盲肠食糜中凝结芽孢杆菌数量分别为9.3×105和8.3×105 CFU/g；且未饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮的NCH+BD组和CH+BD组断奶仔猪空肠和盲肠食糜中未检测出凝结芽孢杆菌。
3.4 饲用凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染断奶仔猪肠道形态的影响肠黏膜绒毛高度、隐窝深度的测定是表征肠道形态的最直观指标[31]。完整且较长的绒毛高度和适当的隐窝深度有利于营养物质的充分吸收；相反，肠黏膜上皮细胞破损会显著降低绒毛高度，且提高隐窝深度，这是隐窝干细胞增殖、增生对肠绒毛上皮细胞的损伤修复作用[19, 31]。本试验结果显示：感染ETEC K88断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度显著降低，隐窝深度显著提高，且绒毛高度/隐窝深度值显著降低，这与前人报道结果[19, 22, 24]一致，表明ETEC K88及所产毒素破坏了仔猪肠道形态，不利于营养物质吸收和生长性能发挥。
本试验结果还显示：饲用凝结芽孢杆菌处理恢复了ETEC K88感染断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度，降低了隐窝深度，且绒毛高度/隐窝深度值得到提升。Che等[19]研究表明，饲用酵母菌恢复了感染ETEC K88断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度，降低了隐窝深度。Pan等[24]报道，饲粮添加地衣芽孢杆菌和酵母菌提高了感染ETEC K88断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度，降低了隐窝深度。以上结果表明，饲用益生菌通过拮抗有害菌及毒素的入侵，维持肠道菌群平衡，从而有利于肠道正常形态的维护。
3.5 饲用凝结芽孢杆菌对ETEC K88感染断奶仔猪肠道黏膜IL-6和IL-10 mRNA表达量的影响促炎细胞因子IL-6主要由活化的巨噬细胞、淋巴细胞和肠上皮细胞分泌，正常情况下浓度很低。肠上皮细胞受到有害菌及其分泌内毒素的刺激后，IL-6迅速表达，因此IL-6是肠道炎症的重要指标之一[32]。IL-10是由活化的单核细胞、巨噬细胞和肠上皮细胞产生，作为公认的抗炎细胞因子，能够显著抑制机体及相关组织的炎症反应[33]。本试验结果显示：感染ETEC K88断奶仔猪空肠黏膜IL-6 mRNA表达量显著上升，IL-10 mRNA表达量显著降低。周栋[34]检测ETEC K88感染仔猪的小肠T淋巴细胞，发现空肠表达抗炎细胞因子IL-10的T淋巴细胞百分率显著下降。Zhu等[35]报道，ETEC K88感染仔猪回肠促炎细胞因子IL-6 mRNA表达量显著上升。以上结果均表明，口服ETEC K88造成了断奶仔猪小肠炎症反应。
本试验结果显示：饲用凝结芽孢杆菌处理显著降低了感染ETEC K88断奶仔猪空肠黏膜促炎因子IL-6 mRNA表达量，显著提高了抗炎因子IL-10 mRNA表达量。Li等[36]报道，饲用丁酸梭菌能够显著增加ETEC K88感染仔猪空肠抗炎因子IL-10 mRNA表达量。Zhu等[35]研究表明，饲用鼠李糖乳酸杆菌能够显著增加ETEC K88感染仔猪回肠抗炎因子IL-10 mRNA表达量。以上结果表明，饲用益生菌屏蔽有害菌及毒素对肠上皮细胞的免疫刺激，具有降低肠道炎症反应的作用。
此外，除腹泻指数外，饲用凝结芽孢杆菌处理与ETEC K88感染处理之间对主要生长性能以及肠道菌群、肠道形态和肠细胞因子等指标均无显著互作效应。这表明，无论是否ETEC K88感染处理，饲用凝结芽孢杆菌均能发挥改善断奶仔猪生长性能及肠道健康的效果。
4 结论结合单株凝结芽孢杆菌对ETEC K88显著抑制的体外抑菌试验数据，本研究进一步采用口服ETEC K88感染断奶仔猪试验模型证明：无论是否ETEC K88感染处理，饲粮添加该株凝结芽孢杆菌在肠道内均能显著抑制大肠杆菌，平衡肠道菌群，进而通过维持肠道正常形态与缓解肠道炎症反应，改善断奶仔猪生长性能。
致谢:
感谢云南农业大学动物科学技术学院葛长荣教授对文稿所提的宝贵意见。
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