2. 青海高原牦牛研究中心, 西宁 810016;
3. 青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室, 西宁 810016
2. Qinghai Plateau Yak Research Center, Xining 810016, China;
3. Key Laboratory of Plateau Grazing Animal Nutrition and Feed Science of Qinghai Province, Xining 810016, China
牦牛主要分布于海拔3 000 m以上的青藏高原等高寒草原地区[1]。中国现有牦牛1 300万头，约占世界牦牛总数的92.8%[2]，是世界上牦牛最主要的种质资源库和最大的牦牛畜产品生产基地。大部分牦牛生活在青藏高原超净区，这种特殊的自然环境使牦牛乳中的蛋白质、干物质、脂肪及乳糖等营养物质的含量高于其他乳。牦牛乳是一种天然、独特的浓缩乳，具有“高浓度、高比重、高含量”的特点，被誉为“乳中之王”，还被誉为“上帝赐与人类最接近完美的食品”[3]。
原料奶具有复杂的微生物生态系统，其中包含许多菌株。牛乳微生物对健康的潜在影响包括阻断肠胃病原体、中和结肠中产生的食物诱变剂，增强免疫反应，降低血清胆固醇含量，预防结肠癌和肝性脑病，治愈肠道功能障碍、便秘以及消化性溃疡[4]。人类膳食结构的改变增加了对乳制品的需求，生鲜乳的质量安全受到密切关注。食源性致病菌是引发食源性疾病的重要因素，牦牛乳极高的营养价值为各类微生物的生长提供了良好的介质，致病微生物的代谢产物对牦牛生鲜乳的质量起着重要作用[5]。对生鲜乳微生物结构和组成的研究在乳品质的把控中十分关键，牛乳中的致病菌和腐败菌可反映母牛的健康状况、生鲜乳的卫生状况、储存时间等重要指标[6]。曾学琴等[7]为了对引起奶牛乳房炎的病原菌进行溯源，通过高通量测序技术检测了乳房炎奶牛和正常奶牛的乳头擦拭子和牛乳中细菌的16S rRNA，结果发现，患病奶牛乳头及牛乳微生物组成与健康奶牛乳头及牛乳微生物组成存在差异。胡婕[8]通过比较Illumina MiSeq和IonS5TMXL 2个二代测序平台对4 ℃冷藏、间隔6 d的原料乳微生物多样性分析，发现原料乳冷藏过程中由于微生物的生长代谢会导致其腐败变质。牛乳中有些微生物使得其风味更加理想，有些则会使其发生腐败变质[9]。
微生物的组成由遗传背景、宿主饮食、环境差异和温度等多种因素决定，微生物在极端环境下经过长期的自然选择，具备相对特殊的结构、机能以及遗传特性，以应答相应的胁迫因子[10-12]。目前，对于青海地区不同海拔高度牦牛生鲜乳的研究大多集中在其脂肪酸组成及营养成分含量等方面[13-14]，但对于不同海拔高度牦牛乳微生物区系的组成及多样性分析未见相关报道，因此对不同海拔高度牦牛乳微生物组成和多样性进行研究十分必要。
微生物的传统检测方法主要有纯培养法、计数法、血清检测法、特定引物的PCR检测法等，虽然这些检测方法都有利于病原微生物的鉴定，但也存在局限性，很难对微生物进行全面检测[15]。随着科学技术的发展，高通量测序技术因不依靠传统培养基方法而简单高效，是研究复杂微生物结构组成的较好选择。因此，本研究利用16S rDNA分析方法，基于Illumina Nova测序平台对青海地区高寒草地类不同海拔高度牦牛乳微生物群落结构及其多样性进行研究，旨在为进一步开发牦牛乳提供基础参考。
1 材料与方法 1.1 采样信息选自然放牧状态下全天候随群放牧的体况、年龄、胎次基本一致的牦牛，以天然草场为主，不补充任何饲料。泌乳期的母牛和犊牛分开过夜，每天人工挤奶1~2次但不完全挤完，以便犊牛可以喝到奶。3个采样点挤奶、采样方法相同。本试验于2019年7-8月，分别在青海省玉树州的称多县(yak1)、海西州的天峻县(yak2)、海南州的共和县(yak3)，采集高寒草甸类的天然草场的泌乳中期4~5胎次的健康牦牛乳样本，每个采样点采集5个样本。采样点基本信息见表 1。每份牦牛乳样本约50 mL，取5 mL于无菌无酶冻存管中，液氮速冻，运回实验室后储存在-80 ℃冰箱备测。
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表 1 采样点基本信息 Table 1 Basic information of sampling points |
DCC体细胞检测仪，利拉伐天津有限公司；超低温(-80 ℃)冰箱，美国Thermo公司；Fresco21型高速冷冻离心机，美国Thermo公司；Tprofessiona PCR仪，德国Biometral公司；Gel DOC XR凝胶成像系统、PowerPac Universal水平电泳仪、SUBCELL GT电泳槽(20 cm×25 cm)，美国Bio-Rad公司。
1.3 检测方法 1.3.1 基因组总DNA提取及PCR扩增、测序参照Yu等[16-17]的方法提取牦牛乳样本中的DNA，用16S V4区引物(515F和806R)进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的条带。采用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit构建文库，文库合格后，使用NovaSeq6000进行上机测序。PCR的扩增，PCR产物的混样、纯化，文库的构建和上机测序流程均由天津诺禾致源生物信息科技有限公司完成。基于天津诺禾致源云平台(https://magic.novogene.com)、SPSS Statistics软件(version 19.0)、I-Sanger云平台(https://www.i-sanger.com/)、R软件(version 3.5.1)以及ITOL(https://itol.embl.de/)等软件平台进行生物信息学及数据统计分析。
1.3.2 环境因子的获取3个采样点的海拔高度等信息利用天宝Juno SA无线GPS记录器定位获得，在国家气象科学数据中心(http://data.cma.cn/site/index.html)获取采样点年平均气温。
1.4 数据处理与分析 1.4.1 测序数据处理测序所得原始序列截去Barcode和引物序列后, 使用FLASH(version 1.2.7)进行拼接获得原始Tags数据，拼接得到的原始Tags数据经Qiime软件(version 1.9.1, http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)质量控制后获得高质量Tags(clean Tags)数据，通过与物种注释数据库(https://github.com/torognes/vsearch/)进行比对检测嵌合体序列，去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效Tags(effective Tags)数据。
1.4.2 微生物多样性分析基于有效数据进行操作分类单元(OTUs)聚类分析和物种分类分析。使用Qiime软件(Version 1.9.1)计算Observed-species、Chao1、Shannon及Simpson指数，使用R软件(Version 2.15.3)完成Alpha多样性指数组间差异分析。
利用Mothur(version 1.30.1)计算Alpha多样性指数。利用QIIME(version 1.17)计算Beta多样性距离矩阵。基于Bray-Curtis距离进行相似性分析(ANOSIM)，基于Unweighted UniFrac距离对不同海拔高度牦牛乳微生物进行主坐标分析(CoA)。对牦牛乳微生物组成进行差异判别分析(LEfSe)，再根据分类学组成对样本按照不同的分类水平进行线性判别分析(LDA，阈值为4)，找出对样本划分产生显著性影响的菌群。此外，基于海拔高度以及年平均气温等环境因子数据，分析产生差异的原因。
2 结果与分析 2.1 样本测序结果及Alpha多样性指数基于Illumina Nova测序平台测序，构建PCR-free文库，然后进行双末端(paired-end)测序。通过对Reads拼接，平均每个样本测得90 459条Tags，经过质控平均得到76 843条有效数据，质控有效数据量达60 460，质控有效率达67.18%。以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，共得到12 329个OTUs，然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释。注释结果中，共有4 211个(34.16%)OTUs注释到属水平。
Alpha多样性指数中的Observed species、Shannon、Simpson和Chao1指数主要用于反映样本中菌群的丰富度。由表 2可知，不同采样点牦牛乳样本中Observed species、Shannon、Simpson和Chao1指数均无显著差异(P＞0.05)，表明不同海拔高度牦牛乳中菌群的丰富度差异不显著。
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表 2 Alpha多样性指数 Table 2 Alpha diversity indexes |
如图 1所示，yak1牦牛乳中总的OTUs数为5 367个，yak2牦牛乳中总的OTUs数为7 212个，yak3牦牛乳中总的OTUs数为6 095个。重叠的部分表示3个采样点牦牛乳中共有的OTUs数，为2 988个。没有重叠的部分表示3个采样点牦牛乳中所特有的OTUs数，其中yak1为1 183个，yak2为2 143个，yak3为1 192个。yak1与yak2重叠的OTUs数为3 669个，yak1与yak3重叠的OTUs数为3 503个，yak2与yak3有4 388个OTUs重叠在一起。
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图 1 基于OTUs的Venn图 Fig. 1 Venn diagram based on OTUs |
图 2显示，不同海拔高度牦牛乳样本中排名前10的菌门均为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸酐菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。3个采样点的15个样本中均有分布且相对丰度较高的菌门为变形菌门和厚壁菌门，这2个菌门在yak1牦牛乳中分别占细菌总序列的44.49%和20.93%，在yak2牦牛乳中分别占细菌总序列的39.30%和32.66%，在yak3牦牛乳中分别占细菌总序列的41.32%和23.90%。由此可知，变形菌门和厚壁菌门为3个海拔高度牦牛乳中的优势菌门，变形菌门在海拔最高、年平均气温最低的称多县歇武镇歇武村牦牛乳中占比最高，在海拔和年平均气温适中的天峻县织合玛乡牦牛乳中占比最低。厚壁菌门的占比变化与变形菌门恰好相反，即海拔最高、年平均气温最低的称多县歇武镇歇武村牦牛乳中厚壁菌门的占比最低，海拔和年平均气温适中的天峻县织合玛乡牦牛乳中厚壁菌门的占比最高。
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Proteobacteria：变形菌门；Firmicutes：厚壁菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Actinobacteria：放线菌门；Cyanobacteria：蓝藻门；Planctomycetes：浮霉菌门；Acidobacteria：酸酐菌门；Chloroflexi：绿弯菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Gemmatimonadetes：芽单胞菌门；Others：其他。 图 2 门水平下牦牛乳中微生物的相对丰度 Fig. 2 Relative abundances of microorganisms in yak milk at phylum level |
图 3显示，不同海拔高度牦牛乳样本中排名前10的菌属为同栖水菌属(Enhydrobacter)、蓝藻门未定义菌属(unidentified_Cyanobacteria)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、马赛菌属(Massilia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、肠杆菌科未定义菌属(unidentified_Enterobacteriaceae)、棒杆菌科未定义菌属(unidentified_Corynebacteriaceae)、科萨克氏菌属(Kosakonia)、肉杆菌属(Atopostipes)。其中不动杆菌属为yak1(海拔最高、年平均气温最低)和yak3(海拔最低、年平均气温最高)牦牛乳中的优势菌属，分别占细菌总序列的8.29%和7.71%，乳杆菌属为yak2牦牛乳中相对丰度较高的菌属，占细菌总序列的8.20%。未分类菌属在yak1、yak2和yak3牦牛乳中的占比分别为68.44%、67.99%、73.22%。
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Enhydrobacter：同栖水菌属；unidentified_Cyanobacteria：蓝藻门未定义菌属；Chryseobacterium：金黄杆菌属；Lactobacillus：乳杆菌属；Massilia：马赛菌属；Acinetobacter：不动杆菌属；unidentified_Enterobacteriaceae：肠杆菌科未定义菌属；unidentified_Corynebacteriaceae：棒杆菌科未定义菌属；Kosakonia：科萨克氏菌属；Atopostipes：肉杆菌属；Others：其他。 图 3 属水平下牦牛乳微生物的相对丰度 Fig. 3 Relative abundances of microorganisms in yak milk at genus level |
热图(heat map)可呈现出样本群落物种组成信息，反映每个分类级别的不同分组或样本群落组成的相似性和差异性。图 4中，丰度较高的菌属以红色显示，丰度较低的菌属以蓝色表示。在门水平上，所有样本在左侧物种聚类分支上分为七大支，分别为放线菌门、拟杆菌门、蓝藻门、厚壁菌门、浮霉菌门、变形菌门、疣微菌门。在属水平上，yak1牦牛乳中中金黄杆菌属、Lutibacter、红小梨形菌属(Rhodopirellula)、Persicirhabdus的丰度较高；yak2牦牛乳中乳杆菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、水栖菌属(Enhydrobacter)、马赛菌属的丰度较高；yak3牦牛乳中贪铜菌属(Cupriavidus)、微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、动性球菌属(Planococcus)的丰度较高。
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Cupriavidus：贪铜菌属；Microbacterium：微杆菌属；Bacillus：芽孢杆菌属；Planococcus：动性球菌属；unidentified_Corynebacteriaceae：棒杆菌科未定义菌属；Bergeyella：伯杰菌属；Kosakonia：科萨克氏菌属；Moraxella：莫拉菌属；Bradyrhizobium：慢生根瘤菌属；Ralstonia：劳尔氏菌属；Streptococcus：链球菌属；Sphingomonas：鞘氨醇单胞菌属；Acinetobacter：不动杆菌属；Bifidobacterium：双歧杆菌属；unidentified_Lachnospiraceae：毛螺菌科未定义菌属；Arsenophonus：杀雄菌属；Enhydrobacter：水栖菌属；Lactobaillus：乳杆菌属；Massilia：马赛菌属；Gardnerella：加德纳氏菌属；Chryseobacterium：金黄杆菌属；Rhodopirellula：红小梨形菌属；unidentified_Cyanobacteria：蓝藻门未定义菌属；Pseudomonas：假单胞菌属；Bacteroides：拟杆菌属；Enterococcus：肠球菌属；Psychrobacter：嗜冷杆菌属；Phylum：门；Actinobacteria：放线菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Cyanobacteria：蓝藻门；Firmicutes：厚壁菌门；Planctomycetes：浮霉菌门；Proteobacteria：变形菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门。 图 4 属水平牦牛乳微生物聚类热图 Fig. 4 Genus horizontal yak milk microbial clustering heat map |
由表 3可知，奥斯陆莫拉氏菌(Moraxella_osloensis)、鲁氏不动杆菌(Acinetobacter lwoffii)和Kosakonia_oryzae为不同海拔高度牦牛乳样本中所共有的微生物，但它们在3个采样点牦牛乳中的相对丰度各不相同。奥斯陆莫拉氏菌为yak2牦牛乳中的优势菌种，相对丰度为7.50%；鲁氏不动杆菌为yak1牦牛乳中的优势菌种，相对丰度为3.98%；Kosakonia_oryzae为yak3牦牛乳中的优势菌属，相对丰度为5.78%。
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表 3 种水平下牦牛乳微生物的相对丰度 Table 3 Relative abundances of microorganisms in yak milk at species level |
PCoA结果如图 5所示，第1主成分对样本差异的贡献值为14.37%，第2主成分对样本差异的贡献值为11.37%。yak2和yak3样本距离较近而离yak1样本距离较远，由此可知，yak2和yak3样本的群落结构相似度较高，而与yak1样本的群落差异较大。这可能是由于天峻县织合玛乡与共和县黑马河乡之间的距离与称多县歇武镇歇武村相比较近，地理环境相似。且天峻县织合玛乡与共和县黑马河乡之间海拔高度差距与称多县歇武镇歇武村相比较小。由此推测，微生物群落结构相似度与地理环境与海拔高度有关。
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图 5 基于Unweighted UniFrac距离的PCoA Fig. 5 PCoA based on Unweighted UniFrac distance |
yak1和yak3的海拔高度相差1 409 m，差距明显，因此选取这2个采样点进行不同海拔高度牦牛乳中微生物组成分析。线性判别分析(LDA)值分布柱状图(图 6-A)及进化分支图(图 6-B)中体现了不同海拔高度牦牛乳间具有统计学差异的生物标志物(biomarker)和差异显著的物种。由此可知，yak1牦牛乳中主要影响微生物组成的差异物种为放线菌门和放线菌门未定义菌纲(unidentified_Actinobacteria)，yak3牦牛乳中主要影响微生物组成的差异物种为黄杆菌目(Flavobacteriales)、拟杆菌纲(Bacteroidia)。
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A：LDA值分布柱状图LDA score distribution histogram；B：进化分支图evolutionary branch diagram。p：门phylum；c：纲class；o：目order；f：科family；g：属genus；s：种species。Actinobacteria：放线菌门；unidentified_Actinobacteria：放线菌门未定义菌纲；Corynebacteriales：棒杆菌目；Corynebacteriaceae：棒杆菌科；unidentified_Corynebacteriaceae：棒杆菌科未定义菌属；Micrococcales：微球菌目；Kosakonia：科萨克氏菌属；Rhodobacterales：红杆菌目；Rhodobacteraceae：红杆菌科；Chryseobacterium：金黄杆菌属；unidentified_Flavobacteriales：黄杆菌目未定义菌科；Bacteroidetes：拟杆菌门；Bacteroidia：拟杆菌纲；Flavobacteriales：黄杆菌目。 图 6 LEfSe组间差异分析 Fig. 6 LEfSe analysis of differences between groups |
牦牛乳是青藏高原区域游牧民族日常必需品，也是引起许多食源性疾病的主要来源。对不同海拔高度牦牛乳微生物多样性的研究发现，青海地区牦牛乳中厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，优势菌属为不动杆菌属和乳杆菌属，这与现有的研究结果[18-19]基本一致。
微生物的多样性不仅受到动物的影响，还与环境密切相关，高海拔生态系统通常具有气温低、降水量低、大气压力低的特征，这对微生物的多样性有重大影响[20-21]。因此，海拔高度及气温差异可能是门、属、科水平牦牛乳微生物组成差异的主要原因。不同海拔高度的牧草的营养成分含量及生物量存在差异。高利娥[22]的研究结果显示，不同海拔高度的传统发酵牦牛乳中乳酸菌的多样性不同。微生物群落非常复杂，随气温变化而变化，气温在微生物种群中起着至关重要的作用，高气温更有利于微生物的繁殖[23]。在海拔相对较低、气温相对较高的共和县黑马河牦牛乳中乳杆菌属的占比最高，且该采样点牦牛乳在门、属、科水平下未分类的微生物占比最高。乳杆菌属是乳酸菌群中的主要菌属，是调节人体肠道菌群并使其保持正常状态的重要细菌类群，在机体内可将糖转化为乳酸，利于发酵活性的维持，多数乳杆菌属被用作益生菌[24-25]。海拔越高，则微生物多样性越小，且极端温度也与微生物活性和新陈代谢的降低有关[26]。海拔高度和气温呈负相关，由此推测海拔较低、气温较高的地区的可能更有利于提高牦牛乳中乳杆菌属的占比，有利于机体胃肠疾病的改善，是牦牛乳发酵制品更理想的原料乳。
变形菌门在海拔高度为4 781 m的yak1牦牛乳中占比最高，厚壁菌门在海拔高度为3 984 m的yak2牦牛乳中占比最高。变形菌门包括一些致病菌，如奈瑟氏属、耶尔森氏属和博尔塔氏属、农杆菌属、根瘤菌属和大肠杆菌属等[27]。有研究表明，γ-变形杆菌门尤其是肠杆菌科在未成熟的小鼠肠道大量存在，与早期肠道炎症有关，不利于犊牛早期肠道微生物的定植[28-29]。变形菌门占比最高yak1牦牛乳可能更容易使肠道细菌在犊牛肠道定植，从而引起犊牛及饮用者的腹泻和肠道炎症。在属水平上，作为优势菌属的不动杆菌属，虽然在一些研究人员看来其产生的蛋白质水解酶和脂解酶可能有助于改善乳制品的风味、气味或质地[30]，但Gurung等[31]和Dijkshoorn等[32]认为不动杆菌属具有致病性，是被低估的食源性病原体[33]。并且，不动杆菌属是原料乳中常见的嗜冷菌，若大量繁殖会破坏乳成分，导致腐败变质，从而影响牛乳品质[34-35]。yak1牦牛乳中嗜冷菌占比最高的原因可能是该采样点是3个采样点中海拔最高、气温最低的。一般原料乳中不存在致病菌，而该乳中存在致病菌可能是因为牧民手工挤乳过程中被污染。本试验中各采样点均为牧民手工挤乳，这个过程中牛奶多次接触空气，空气中的各种细菌、灰尘、杂物等必然污染牛奶[36]。目前未加工食品是食源性疾病患病率不断上升的主要原因之一，如果原料乳中存在人畜共患病原体，则可能对公众健康造成威胁，需尽量避免致病菌的附着。因此，应规范牦牛的饲养管理，重视畜舍卫生，生鲜牦牛乳应严格按照生产规范，尽量实现牦牛乳的机械化挤乳，做好杀菌消毒等工作，避免因生鲜乳引起的食源性疾病，提高原料乳的品质及安全性。
4 结论青海地区不同海拔高度牦牛乳中微生物组成和丰度存在差异。yak2和yak3牦牛乳中微生物群落结构相似度较高，并与yak1牦牛乳中微生物群落结构均存在较大差异。
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