2. 上海海洋大学水产与生命学院, 农业农村部鱼类营养与环境生态研究中心, 上海 201306;
3. 上海海洋大学水产与生命学院, 水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心, 上海 201306;
4. 上海市松江区水产良种场, 上海 201203
2. Centre for Research on Environmental Ecology and Fish Nutrition of the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
3. Shanghai Collaborative Innovation for Aquatic Animal Genetics and Breeding, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
4. Shanghai Songjiang Aquatic Products Breeding Farm, Shanghai 201203, China
随着抗生素在饲料中的禁用，替代抗生素的添加剂备受关注。柠檬酸作为一种无残留且不产生抗药性的有机酸，可以有效地替代抗生素。目前，在水产饲料中补充柠檬酸的报道已见于虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[1]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[2]、大黄鱼(Larimichthys crocea)[3]、大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)[4]、异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[5]、罗非鱼(Oreochroms mossambcus)[6]、真鲷(Pagrus major)[7]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[8]等水产动物，这些研究结果表明，柠檬酸提高了水产动物对营养物质的消化利用率，促进了水产动物生长。其原因，一方面可能与柠檬酸能降低饲料pH、提高饲料适口性、增强消化酶活性有关；另一方面可能与柠檬酸是三羧酸循环中的初级代谢产物，能在异柠檬酸脱氢酶的作用下生成大量ATP，为机体提供能量有关。然而，在不同水产动物上，柠檬酸的添加量和作用效果并不一致。
草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国主要的淡水养殖品种，但在高密度集约化养殖过程中易感染疾病，从而造成损失。有关柠檬酸在草鱼上的研究鲜有报道。尚卫敏等[9]在饲料中添加0.21%的柠檬酸显著提高了草鱼的增重率，但对饲料系数没有显著影响，但该研究中仅设置了1个添加梯度(0.21%)，是否是草鱼饲料中柠檬酸的最适添加量尚无法确定。此外，柠檬酸对营养物质特别是磷的利用以及对肠道组织形态的影响均不清楚。因此，本试验以草鱼为研究对象，在饲料中添加不同水平的柠檬酸，饲养草鱼60 d，考察其对草鱼生长性能、营养物质利用、血清生化指标和肠道组织形态的影响，以期为柠檬酸在水产饲料中的合理使用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲料配方以鱼粉、豆粕、菜籽粕和棉籽粕为主要蛋白质源，配制蛋白质水平为30%的基础饲料，在基础饲料中分别添加0(对照)、0.15%、0.30%和0.45%的柠檬酸(纯度≥99.5%)，配制成4种等氮等脂的试验饲料。配制试验饲料时，所添加的柠檬酸量以减少等量麸皮的方式来维持各组分平衡。饲料中添加0.05%的三氧化二钇(Y2O3)作为指示剂，用于测定营养物质的表观消化率。
主要饲料原料用粉碎机粉碎后，过40目筛，准确称量各饲料原料，逐级混匀，加入豆油和水后，充分混匀，用单螺杆挤压机(SLP-45，中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所研制)制成直径为2 mm的沉性颗粒饲料(制粒温度90~95 ℃)，自然风干备用。试验饲料组成及营养水平见表 1。饲料pH随柠檬酸添加量的增加而降低，依次为5.75、5.67、5.48、5.42。
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表 1 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
试验用草鱼购于浙江省湖州市南浔区菱湖镇宸浩水产经营部，在上海海洋大学滨海基地养殖车间暂养2个月。暂养期间，用商品饲料(粗蛋白质含量≥30%)进行投喂，每天投喂2次(08:00、15:00)，使之适应养殖环境。正式试验开始时，选择平均体重为(17.0±0.2) g、体质健壮、规格整齐的草鱼240尾，随机分为4组，每组3个重复(网箱)，每个重复20尾。养殖试验在水泥池(5.0 m×3.0 m×1.2 m)里的网箱(1.5 m×1.0 m×1.2 m，网箱箱体网孔直径3 mm，箱底网孔直径1 mm)中进行，养殖期为60 d。每日投喂3次(07：00、12:00、17:00)，日投喂量为鱼体质量的3.0%~5.0%，并根据天气、水温和摄食情况进行调整，每次投饲以10 min内无残饵为宜，并且各网箱的投喂量保持基本一致。试验期间，养殖水体24 h连续供氧，供氧设施为鼓风增氧机(HG710-38BS7，YASHIBA，浙江)，每个网箱中央用气管悬挂1个气石，保证各网箱气石的深度一致，每隔5 d换水1次，每隔10 d吸污1次，每次换水量约为总水体的1/3。每天监测水质指标，水温为(28±2) ℃，pH为7.5~8.0，溶解氧浓度>5.0 mg/L，总氨氮浓度 < 0.2 mg/L，亚硝酸盐浓度 < 0.1 mg/L。
1.3 样品采集和处理正式试验开始前，随机取9尾鱼置于-20 ℃冰箱中冷冻保存，用于初始全鱼常规营养成分测定。试验结束时，饥饿24 h后对各个网箱的试验鱼进行计数称重，计算增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、饲料系数(FCR)和存活率(SR)。每个网箱随机取3尾鱼，置于-20 ℃冰箱中冷冻保存，用于终末全鱼常规营养成分测定。每个网箱再随机取3尾鱼，逐条称重并测量体长，尾静脉采血，离心(4 ℃、3 000 r/min，10 min)，取上清液，-80 ℃冷冻保存，用于血清生化指标测定。试验鱼采完血后立即解剖，分离内脏团、肝脏和肠脂并称重，计算肥满度(CF)、脏体比(VSI)、肝体比(HSI)和肠脂比(MSI)。取出肠道，排空食糜，截取1 cm的前肠(根据前中肠结点确定)，用生理盐水冲洗，Bouin氏液固定，用于制作肠道组织切片。每个网箱另随机取3尾鱼，抽血后立即解剖，分离出肠道，剥离肠脂，排空食糜，截取完整的前肠，-80 ℃冷冻保存，用于肠道消化酶活性测定。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 生长性能和形体指标
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饲料、粪便和全鱼常规营养成分含量测定方法如下：水分含量的测定采用105 ℃烘干法；粗蛋白质含量的测定采用凯氏定氮法；粗脂肪含量的测定采用氯仿-甲醇抽提法；粗灰分含量的测定采用马弗炉灰化法；总磷含量的测定采用磷钼酸法(试剂盒购买于南京建成生物工程研究所)。饲料的pH参考Radecki等[10]的方法，称量20 g饲料放入烧杯中，加入40 mL去离子水，用玻璃棒搅拌形成浆液后，用电子pH计(便携pH计，AS700，日本)测定pH。根据上述的测定值计算营养物质沉积率，计算公式如下：
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养殖试验的后2周，用捞网收集每个网箱粪便(投饲2 h后)，取包膜完整的粪便，-20 ℃保存备用，测定粗蛋白质和总磷含量。饲料、粪便中Y2O3含量采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICAP Q-MS电感耦合等离子体质谱仪，Thermo iCAP Q，美国)测定。根据上述数据，计算各营养物质表观消化率，计算公式如下：
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式中：a、A分别表示饲料和粪便中粗蛋白质含量；b、B分别表示饲料和粪便中Y2O3含量；c、C分别表示饲料和粪便中总磷含量。
1.4.4 血清生化指标血清中葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)含量采用全自动生化分析仪测定；血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性与丙二醛(MDA)含量采用相应的试剂盒(购买于南京建成生物工程研究所)测定。
1.4.5 肠道组织切片肠道组织经乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片(厚度5 μm，Leika RM 2235切片机，德国)，再经苏木精-伊红(HE)染色，中性树胶封片，光学显微镜(Nikon YS100显微摄影系统)下进行拍照，测量绒毛高度(VH)、绒毛宽度(VW)和肌层厚度(MT)。
1.4.6 肠道消化酶活性将冷冻的肠道组织4 ℃解冻，按重量(g)：体积(mL)为1:4加入4倍体积的生理盐水，匀浆，4 ℃离心10 min(2 500 r/min)，取上清液，24 h内测定蛋白酶和淀粉酶活性。蛋白酶活性采用福林酚法测定，以2%酪蛋白溶液为底物，每微克组织蛋白在pH 7.2、37 ℃条件下每分钟分解酪蛋白生成1 μg酪氨酸定义为1个蛋白酶活性单位。淀粉酶活性采用淀粉-碘比色法(试剂盒购买于南京建成生物工程研究所)测定，每毫克组织蛋白质在37 ℃与底物作用30 min，水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活性单位。蛋白质浓度采用考马斯亮蓝法(试剂盒购买于南京建成生物工程研究所)测定。
1.5 数据统计与分析试验数据先用Excel 2017进行整理，再采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P < 0.05表示差异显著，若差异显著，则用Duncan氏法进行多重比较。除存活率外，其他数据均用平均值±标准差(mean±SD)表示。
2 结果 2.1 生长性能和形体指标各组草鱼的生长性能和形体指标见表 2。养殖期间，各组草鱼的存活率均为100%。与对照组相比，饲料中添加0.30%柠檬酸使草鱼的增重率提高了11.37%(P < 0.05)，特定生长率提高了5.68%(P < 0.05)，饲料系数降低了10.34%(P < 0.05)；0.15%和0.45%柠檬酸组草鱼的生长性能较对照组有改善趋势，但未达到显著水平(P>0.05)。0.45%柠檬酸组草鱼的脏体比显著低于其他组(P < 0.05)，0.15%和0.30%柠檬酸组的肝体比以及0.15%柠檬酸组的肠脂比均显著高于对照组(P < 0.05)。各组草鱼在肥满度上无显著差异(P>0.05)。
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表 2 柠檬酸对草鱼生长性能和形体指标的影响 Table 2 Effects of citric acid on growth performance and body indices of grass carp |
各组草鱼全鱼营养成分含量和营养物质沉积率见表 3。与对照组相比，饲料中添加0.15%、0.30%柠檬酸显著降低了全鱼水分含量(P < 0.05)，显著提高了全鱼粗脂肪含量(P < 0.05)。各组草鱼全鱼粗蛋白质、粗灰分和磷含量均无显著差异(P>0.05)。在营养物质沉积率方面，0.30%柠檬酸组的蛋白质沉积率较对照组显著升高(P < 0.05)；各柠檬酸添加组的脂肪和磷沉积率均显著高于对照组(P < 0.05)，其中以0.30%柠檬酸组的脂肪和磷沉积率最高。
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表 3 柠檬酸对草鱼全鱼营养成分含量和营养物质沉积率的影响 Table 3 Effects of citric acid on whole body nutritional component contents and nutrient retention rates of grass carp |
各组草鱼营养物质表观消化率和肠道消化酶活性见表 4。与对照组相比，在饲料中添加不同水平的柠檬酸均显著提高了总磷表观消化率(P < 0.05)，其中0.30%柠檬酸组的总磷表观消化率最大；此外，饲料中添加0.30%柠檬酸还显著提高了干物质和粗蛋白质表观消化率(P < 0.05)。在肠道消化酶活性方面，与对照组相比，各柠檬酸添加组肠道蛋白酶活性均显著提高(P < 0.05)，其中0.30%柠檬酸组的数值最高；0.30%和0.45%柠檬酸组肠道淀粉酶活性显著高于对照组(P < 0.05)。
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表 4 柠檬酸对草鱼营养物质表观消化率和肠道消化酶活性的影响 Table 4 Effects of citric acid on nutrient apparent digestibility and intestinal digestive enzyme activities of grass carp |
各组草鱼血清生化指标见表 5。与对照组相比，0.15%和0.30%柠檬酸组血清SOD活性、TP含量显著增加(P < 0.05)，MDA含量显著降低(P < 0.05)；此外，0.30%和0.45%柠檬酸组血清GLU含量也显著升高(P < 0.05)。各组血清TG和TC含量以及ALT、AST、AKP和CAT活性均无显著差异(P>0.05)。
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表 5 柠檬酸对草鱼血清生化指标的影响 Table 5 Effects of citric acid on serum biochemical indices of grass carp |
由表 6可知，各柠檬酸添加组的肠道绒毛高度和肌层厚度均显著高于对照组(P < 0.05)，而绒毛宽度则表现为各组间无显著差异(P>0.05)。各组肠道组织切片见图 1。
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表 6 柠檬酸对草鱼肠道组织形态的影响 Table 6 Effects of citric acid on intestinal tissue morphology of grass carp |
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A：对照组control group；B：0.15%柠檬酸组0.15% citric acid group；C：0.30%柠檬酸组0.30% citric acid group；D：0.45%柠檬酸组0.45% citric acid group。 图 1 草鱼肠道组织切片 Fig. 1 Intestinal tissue sections of grass carp |
在饲料中添加柠檬酸的作用效果受到饲料系酸力、柠檬酸添加量、鱼的种类及生长阶段等多方面因素影响。柠檬酸的作用首先是对饲料的酸化作用，同时柠檬酸带有一定的芳香气味，具有诱食效果[11]。Xie等[12]研究发现，适宜添加量的柠檬酸能有效刺激罗非鱼的摄食行为。Kohbara等[13]发现L-乳酸能刺激褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus)的味觉感受器。本次试验重在研究饲料质量的效果，故各组的投喂量基本保持一致，关于柠檬酸对草鱼的诱食效果有待进一步研究。
对于罗非鱼的研究表明，饲料pH随着柠檬酸添加量的增加而下降，在柠檬酸添加量分别为0.20%、0.30%时，增重率显著提高，饲料系数显著降低[14]。此外，饲料中添加柠檬酸还显著提高了大黄鱼[2]、黄颡鱼[7]、黄鱼(Seriola quinqueradiata)[15]和南亚野鲮(Labeo rohita)[16]的饲料利用率，改善了生长性能。本试验中，随着柠檬酸添加量的增加，饲料pH降低；当柠檬酸添加量为0.30%时，草鱼的增重率显著提高，饲料系数显著降低；更高添加量(0.45%)的柠檬酸并没有导致生长性能的进一步提高，反而略有下降，说明适量添加柠檬酸对草鱼的生长和饲料利用具有促进作用，而过量添加则具有抑制作用，其适宜添加量为0.30%。
柠檬酸对草鱼的促生长作用与其提高消化酶活性、提高营养物质利用有关。对于无胃鱼类来说，柠檬酸不可能通过激活胃蛋白酶对其产生作用，但柠檬酸可以使食糜呈酸性，进而刺激肠道消化腺分泌更多的消化液，提高营养物质的消化率。研究表明，柠檬酸能提高罗非鱼的胃蛋白酶和肠道胰蛋白酶活性[14, 17]。在红鼓鱼(Sciaenops ocellatus)[18]幼鱼饲料中添加1.50%的柠檬酸提高了肠道胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。王纪亭等[19]在饲料中添加0.30%的复合酸显著提高了鲤鱼(Cyprinus carpio)肠道蛋白酶活性，淀粉酶和脂肪酶活性也有上升的趋势。本试验在饲料中添加适量的柠檬酸对草鱼肠道消化酶活性有促进作用，同时干物质、蛋白质和磷的表观消化率也得到了提高；但当柠檬酸添加量过高时，肠道消化酶活性和营养物质表观消化率开始降低，说明过量的有机酸可能超过了肠道的中和作用，破坏肠道pH环境，导致肠道消化酶活性下降。过量酸化剂使肠道消化酶活性降低的报道也见于凡纳滨对虾[2]和罗非鱼[17]。
柠檬酸对草鱼的促生长作用还与磷等矿物元素利用率提高有关。一些矿物元素在碱性环境中易形成不溶性的盐，难以被消化吸收。在酸性条件下，柠檬酸可以与一些矿物元素发生螯合作用，形成生物效价很高的螯合物而易被吸收。在低磷饲料中添加柠檬酸可以提高真鲷[7]、大口黑鲈(Micropterus salmoides)[20]和虹鳟[21]对磷的利用率，从而改善生长性能。Khajepour等[22]试验表明，柠檬酸能提高欧洲鳇(Huso huso)的磷表观消化率。Pandey等[23]发现，柠檬酸可以提高虹鳟对氮和磷的保留率。本试验中，饲料中添加不同水平的柠檬酸均能显著提高草鱼的磷表观消化率和沉积率，当柠檬酸添加量为0.30%时，磷的表观消化率和沉积率达到最大，但草鱼的全鱼磷含量各组之间没有显著差异，说明基础饲料中的磷已能满足生长的需要，磷沉积率的提高主要来自体增重的提高。
鱼体脂肪的沉积受脂肪合成和分解代谢的影响。在肝脏中，脂肪由甘油-3-磷酸和脂肪酸合成，甘油-3-磷酸主要由糖代谢提供，脂肪酸主要来源于脂肪酸的从头合成。柠檬酸能显著提高小鼠细胞中乙酰辅酶A羧化酶的活性，促进脂肪的合成和沉积；同时也能显著降低激素敏感脂酶的活性，抑制脂肪的分解[24]。在罗非鱼饲料中添加柠檬酸，显著提高了肝脏6-磷酸葡萄糖脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，而这2种酶均参与磷酸戊糖途径，有助于产生还原型辅酶Ⅱ(NADPH)，从而促进脂肪的合成代谢[25]。敬婷等[26]在饲料中添加不同水平的L-苹果酸，发现湘云鲫(Carassius auratus)的全鱼粗脂肪含量和脂肪沉积率显著提高。本试验结果与之类似，即在饲料中添加柠檬酸提高了草鱼的全鱼粗脂肪含量和脂肪沉淀率，其原因可能与脂肪合成代谢的增加和(或)脂肪分解代谢的减弱有关。各柠檬酸添加组草鱼血清中GLU、TG和TC的含量均有上升的趋势，也可能与此有关。
3.2 柠檬酸对草鱼血清生化指标的影响血清GLU是机体主要的供能物质。血清TP反映机体蛋白质的代谢，同时也与免疫相关联。血清胆固醇和TG是重要的脂类物质，反映机体的脂类吸收和肝脏脂肪代谢状况。在饲料中添加L-苹果酸和柠檬酸显著提高了异育银鲫血清TP和白蛋白含量[27]。潘庆等[25]研究显示，在饲料中添加柠檬酸和乳酸显著提高了罗非鱼血清中TG的含量。本研究中血清GLU、TP和TC含量随柠檬酸添加量的增加呈现出先上升后下降的趋势，说明适量的柠檬酸可以促进草鱼的营养物质代谢。ALT和AST主要存在于动物的肝脏中，参与机体内转氨基作用。当动物肝脏受损或发生病变时，ALT和AST会释放到血液中，导致血清中ALT和AST的活性升高[28]。血清AKP活性是判断骨代谢状况的一项重要指标，当动物骨骼未发育完全或患佝偻病和软骨症时，其血清中AKP的活性会出现异常升高。李建平等[29]在断奶仔猪饲粮中添加柠檬酸，结果发现对血清ALT、AST和AKP活性没有显著影响。在哲罗鲑(Hucho taimen)饲料中添加柠檬酸对血清ALT、AST和AKP活性也没有显著影响[30]。本研究中，各柠檬酸添加组草鱼血清ALT、AST和AKP活性无显著差异，说明柠檬酸不会影响草鱼肝脏生理代谢和骨代谢。
此外，机体处于应激条件下会产生过量的活性氧和自由基，导致机体受损。SOD能以氧自由基为反应底物，通过歧化作用产生过氧化氢和氧，CAT能将产生的过氧化氢分解；丙二醛是脂质过氧化的产物，其含量的多少反映组织过氧化损伤程度[31]。郑建婷等[32]在肉兔饲粮中添加1.50%的柠檬酸，结果发现血清SOD活性显著升高；程义等[27]在异育银鲫饲料中添加L-苹果酸和柠檬酸，结果发现显著提高了肝脏SOD和CAT活性；程年成等[33]在黄颡鱼饲料中添加柠檬酸，结果发现血清SOD和CAT活性均有不同程度的提高。本研究表明，在饲料添加0.15%和0.30%的柠檬酸能显著提高草鱼血清SOD活性，降低血清MDA含量，反映出草鱼的血清抗氧化能力得到了提高。
3.3 柠檬酸对草鱼肠道组织形态的影响肠道绒毛高度、数量和形态结构可在一定程度上反映鱼类肠道消化吸收能力的强弱。研究表明，有机酸对高豆粕饲料造成的龙胆石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)肠道损伤有修复作用[34]。在凡纳滨对虾[35]和罗非鱼[36]的研究中，有机酸能改善肠道菌群，提高机体抵抗力，从而促进动物生长。李赞等[37]在饲料中添加1.0~16.0 g/kg L-苹果酸，结果显示罗非鱼肠道表皮生长因子和表皮生长因子受体含量得到提高，前肠和中肠的绒毛高度和密度也有所提高。Chen等[38]发现，柠檬酸能缓解豆粕对大菱鲆肠道黏膜层造成的损伤，维持肠道菌群平衡。本试验中，柠檬酸能显著提高草鱼前肠的绒毛高度，肌层厚度也呈现上升的趋势，说明柠檬酸能改善草鱼肠道组织形态，一方面可能是柠檬酸参与了三羧酸循环，为肠道组织提供了更多的能量，促进了肠绒毛发育；另一方面可能是柠檬酸通过降低肠道pH，抑制有害微生物生长，改善肠道菌群结构，从而促进肠绒毛的发育。
值得注意的是，当柠檬酸的添加量为0.45%时，肠道绒毛的中央乳糜管与周围的平滑肌束分离，呈现“空泡”现象(图 1-D)。这表明过量的柠檬酸进入肠道后，超出了草鱼的调节能力，可能对肠道组织结构产生了不利影响，这可能也是0.45%柠檬酸组生长性能较0.30%柠檬酸组下降的重要原因。这种过量添加有机酸导致肠道结构受损的报道也见于罗非鱼[37]。
4 结论本试验条件下，在饲料中添加柠檬酸能提高草鱼的营养物质消化率和沉积率，降低饲料系数，改善肠道组织形态和功能，提高血清抗氧化能力，从而改善生长性能；柠檬酸在草鱼饲料中的适宜添加量为0.30%。
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