2. 广东燕塘乳业股份有限公司, 广州 510507;
3. 中国农业大学动物科技学院, 北京 100193
2. Guangdong Yangtang Dairy Company, Guangzhou 510507, China;
3. College of Animal and Technology, China Agricultural University, Beijing 100193, China
犊牛养殖存在腹泻、肺部疾病高发和断奶应激等诸多问题，严重影响了犊牛的健康和生长性能，如何改善犊牛健康和生长性能，对反刍动物生产具有重要意义。通常将出生后至6月龄之间的小牛称为犊牛，这个阶段生理功能急剧变化，自身免疫系统尚未完全建立，抵抗力差，淘汰率高[1]。尤其是断奶阶段的犊牛，其消化系统和免疫系统未发育成熟[2]，腹泻发生率较高。犊牛腹泻易造成生长速度缓慢且机体素质变差，感染呼吸道疾病的风险增加，成年后生长性能降低[3]。有研究表明，乳酸菌、酵母菌和丁酸梭菌等益生菌类添加剂可有效降低犊牛腹泻率[4]，改善动物健康，提高生长性能[5-6]。我国2020年7月1日起已全面禁止在饲料中使用促生长类抗生素，表明政府、消费者和养殖从业人员对于动物养殖安全的重视。益生菌产品被认为是安全绿色可靠的饲料添加剂，研究表明益生菌可显著提高饲料消化率和养殖生产效率[7]。丁酸梭菌生长代谢产物包括短链脂肪酸、氨基酸和促消化酶，能促进有益菌双歧杆菌、乳酸杆菌等的生长，调节肠道微生态平衡，改善营养物质代谢，提高动物生产性能。丁酸梭菌在生长后期会形成芽孢，因此受颗粒饲料加工过程中的高温、机械摩擦、高压等不利环境影响较小，能耐受酸碱、动物胃肠液的影响[8]。
相较于其他益生菌，目前对丁酸梭菌的研究主要集中在单胃动物领域[7, 9-10]，丁酸梭菌在反刍动物上的应用研究较少，仅李文茜[11]和Uyeno等[12]做过一些研究，发现饲粮中添加丁酸梭菌对犊牛、奶牛的生长性能和肠道健康有影响，但研究的数据偏少，且对丁酸梭菌产生作用的机理不是很清晰。因此，本试验旨在研究饲粮中添加丁酸梭菌对犊牛生长性能和血清生化、抗氧化、免疫指标及粪便微生物数量的影响，探究丁酸梭菌对犊牛生长性能和健康的影响，并在一定程度上研究其作用机理，为其可能在反刍动物养殖上的应用提供更多的理论支持。
1 材料与方法 1.1 试验材料丁酸梭菌产品由广东某生物科技股份有限公司提供，产品主要由丁酸梭菌和载体组成，丁酸梭菌活菌数为5×108 CFU/g，载体主要成分为玉米淀粉。
1.2 试验设计与饲养管理试验采用完全随机分组设计，选用体重相近、健康状况良好的45头(30±3)日龄的海福特牛♂×日本黑牛♀杂交一代犊牛，随机分为3组，每组15头牛。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别在基础饲粮的基础上添加4(CB4组)和8 g/d丁酸梭菌(CB8组)。试验期30 d。
试验采用分栏散养，每天饲喂3次，分别在06:00、14:00和20:30饲喂。每天定时清扫犊牛栏，并定期消毒。每头犊牛代乳粉饲喂量为650 g/d，用50 ℃左右的温开水按6 ∶ 1的比例冲调代乳粉，混匀后用奶盆饲喂，试验组饲喂的丁酸梭菌直接加到奶盆中，搅拌均匀。开食料和苜蓿干草放置在食槽中供犊牛自由采食，并自由饮用温水。开食料组成及营养水平见表 1。代乳粉使用荷兰普瑞福犊牛代乳粉，其营养水平见表 2。
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表 1 开食料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the starter (air-dry basis) |
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表 2 代乳粉营养水平 Table 2 Nutrient levels of milk replacer |
在试验期第30天(断奶前)，全部犊牛晨饲后3 h进行颈静脉采血。分别用加入抗凝剂(肝素钠)和无抗凝剂的5 mL真空采血管收集血液，置于冰盒中低温保存，迅速带回实验室离心、分装。3 000 r/min离心15 min，血清收集分装于2 mL离心管中，-20 ℃保存待测。粪便样品连续采集3 d，并冷藏保存，立即进行微生物数量的检测。
1.4 检测指标与方法 1.4.1 开食料和代乳粉营养成分含量干物质(DM)含量按照GB/T 6435—2014方法测定；粗脂肪(EE)含量按照GB/T 6433—2006方法测定；粗灰分(Ash)含量按照GB/T 6438—2007方法测定；粗蛋白质(CP)含量按照GB/T 6432—1994方法测定；中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量采用ANKOM纤维分析仪并结合ANKOM滤袋技术进行测定；淀粉含量采用酶分析法，使用Megazyme公司淀粉总量检测试剂盒测定；磷含量采用钒钼酸铵显色法，用分光光度计测定；钙含量采用原子吸收仪测定。
1.4.2 生长性能及腹泻情况试验开始和结束当天对试验牛进行称重，计算初始体重、终末体重和平均日增重(average daily gain，ADG)；每周测1次采食量，记录犊牛开食料投料量和剩料量，计算开食料平均日采食(starter ADFI)；每天10:00—11:00观察试验牛只的腹泻情况，对粪便进行评分，试验结束时计算腹泻率(diarrhea rate)。
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血清总蛋白(TP)含量采用双缩脲法测定，尿素氮(UN)含量采用脲酶法测定，葡萄糖(GLU)含量采用二硝基水杨酸(DNS)还原法测定，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性及总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量均采用相应的试剂盒测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.4.4 血清抗氧化和免疫指标血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量均采用相应的试剂盒测定，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。
血清免疫球蛋白G(IgG)含量的测定采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法，使用试剂盒测定，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.4.5 粪便微生物数量将粪便样品梯度稀释后，选择合适的稀释倍数涂布于对应的固体培养基平板上，观察菌落形态，进行计数。大肠杆菌数量的测定参考GB/T 18869—2019，沙门氏菌数量的测定参考GB/T 13091—2002，丁酸梭菌数量的测定参考GB/T 4789.35—2016。
1.5 数据统计与分析所有试验数据均用Excel 2010进行初步处理，应用SPSS 22.0软件中的one-way ANOVA过程进行单因素方差分析。数据以平均值和均值标准误(SEM)表示。P＜0.05为差异显著，0.05≤P＜0.10为有显著趋势。
2 结果 2.1 丁酸梭菌对犊牛生长性能的影响丁酸梭菌对犊牛生长性能的影响见表 3。饲粮中添加丁酸梭菌对犊牛终末体重、平均日增重和开食料平均日采食量无显著影响(P＞0.05)；CB4组和CB8组的平均日增重较对照组分别提高了90和120 g，腹泻率较对照组分别降低了0.20和0.52个百分点。
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表 3 丁酸梭菌对犊牛生长性能的影响 Table 3 Effects of Clostridium butyrate on growth performance of calves |
丁酸梭菌对犊牛血清生化指标的影响见表 4。CB4组和CB8组的血清TP含量较对照组显著升高(P＜0.05)。CB4组和CB8组的血清ALT和AST活性较对照组显著升高(P＜0.05)。CB4组和CB8组的血清UN含量较对照组有升高的趋势(P=0.061)。CB8组的血清GLU含量较对照组和CB4组显著升高(P＜0.05)，CB4组的血清GLU含量与对照组差异不显著(P＞0.05)。CB8组的血清HDL-C含量较对照组有降低的趋势(P=0.066)。饲粮中添加丁酸梭菌对犊牛血清TCH和LDL-C含量无显著影响(P＞0.05)。
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表 4 丁酸梭菌对犊牛血清生化指标的影响 Table 4 Effects of Clostridium butyrate on serum biochemical indexes of calves |
丁酸梭菌对犊牛血清抗氧化和免疫指标的影响见表 5。对于血清抗氧化指标，CB8组的血清T-AOC较对照组有升高的趋势(P=0.073)，血清GSH-Px活性较对照组显著升高(P＜0.05)。CB4组的血清SOD活性较对照组显著升高(P＜0.05)，血清T-AOC较对照组有升高的趋势(P=0.073)。CB8组的血清GSH-Px活性较CB4组显著升高(P＜0.05)。饲粮中添加丁酸梭菌对犊牛血清MDA含量无显著影响(P＞0.05)。对于血清免疫指标，CB8组的血清IgG含量较对照组显著升高(P＜0.05)，CB4组的血清IgG含量与对照组和CB8组无显著差异(P＞0.05)。
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表 5 丁酸梭菌对犊牛血清抗氧化和免疫指标的影响 Table 5 Effects of Clostridium butyrate on serum antioxidant and immune indexes of calves |
丁酸梭菌对犊牛粪便微生物数量的影响见表 6。CB4组和CB8组的粪便丁酸梭菌数量较对照组显著升高(P＜0.05)，分别较对照组提高了5.3倍和7.4倍。CB4组和CB8组的粪便大肠杆菌数量较对照组显著降低(P＜0.05)。CB4组的粪便沙门氏菌数量较对照组显著降低(P＜0.05)。
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表 6 丁酸梭菌对犊牛粪便微生物数量的影响 Table 6 Effects of Clostridium butyrate on fecal microorganisms number of calves |
动物生长性能反映了动物的生长状况对某一因素的变化，是机体代谢的综合性指标。研究表明，丁酸梭菌等益生菌作为饲料添加剂使用可有效提高动物的生长性能和饲料转化效率[13-15]。Casas等[16]研究发现，饲粮中添加1.25×1011~3.00×1011 CFU/kg的丁酸梭菌饲喂20~55日龄的仔猪，与添加抗生素和不添加抗生素的对照组相比，均可提高断奶期仔猪平均日增重和饲料转化效率。王海亮等[17]研究发现，饲粮中添加0.5×108、1.0×108和5.0×108 CFU/kg的丁酸梭菌饲喂28~56日龄的断奶期仔猪，显著提高了仔猪平均日增重和平均日采食量，显著降低了料重比，腹泻率与对照组相比分别降低了45.38%、52.75%、54.62%。Liao等[18]研究发现，饲粮中添加2.5×108~10.0×108 CFU/kg丁酸梭菌饲喂肉鸡，可显著提高1~21日龄肉鸡的平均日增重，与抗生素添加组效果相同，饲粮中添加5.0×108 CFU/kg丁酸梭菌提高了21~42日龄肉鸡的平均日增重。Svejstil等[19]研究发现，饲粮中添加5×108 CFU/kg的丁酸梭菌可提高1~20日龄、36~49日龄肉鸡的平均日增重，同时降低了1~20日龄、36~49日龄肉鸡的的料重比。对于丁酸梭菌在反刍动物上的应用，李文茜等[20]研究发现，断奶期犊牛在基础饲粮的基础上饲喂2×108 CFU/kg丁酸梭菌可显著提高犊牛平均日增重，有提高动物饲料转化效率的趋势，丁酸梭菌组犊牛腹泻率降低了3.62%。本试验得到相似的结果，在试验期内，饲粮中添加4和8 g/d丁酸梭菌分别提高犊牛终末体重2.7和3.5 kg，分别提高平均日增重90和120 g，分别降低腹泻率0.20和0.52个百分点，但各组犊牛开食料平均日采食量和平均日增重无显著差异，这可能与动物种类、年龄阶段、试验重复数和丁酸梭菌的添加量等因素有关。
3.2 丁酸梭菌对犊牛血清生化指标的影响血清生化指标可作为预测犊牛健康的关键指数。血清TP含量主要反映了机体的营养状况及蛋白质的代谢水平。反刍动物采食含氮饲粮后，瘤胃微生物迅速将蛋白质分解成氨，一部分作为微生物氮的来源，另一部分吸收至体内，经肝脏代谢生成UN；然后一部分随尿液排出，一部分经尿素循环进入瘤胃供动物利用，同时动物机体自身的蛋白质降解也会产生UN[21]。本试验中，CB4和CB8组的血清TP含量较对照组显著升高，这与前人在肉鸡[22]、鸭[23]、乳鸽[24]和猪[25]上的研究结果一致，表明机体蛋白质代谢旺盛，蛋白质的吸收利用提高，肝脏的蛋白质合成能力及组织蛋白质的沉淀作用增强[26]。同时，CB4组和CB8组的血清UN含量较对照组有升高的趋势，可能是丁酸梭菌进入瘤胃代谢增殖，促进了瘤胃微生物对含氮饲粮的分解代谢，产生更多的氨，经瘤胃壁吸收，随血液循环进入肝脏生成UN，导致血清UN含量升高。AST和ALT是动物体重要的氨基酸转移酶，在正常范围内，这2种酶对动物体蛋白质代谢起关键性作用，能减少蛋白质分解，促进蛋白质合成[27-28]。
血清TC含量可以反映动物机体的脂类代谢是否异常，TC主要由低密度脂蛋白(LDL)携带运输出肝脏，高密度脂蛋白(HDL)有助于清除细胞中的TC，它们的含量具有相关性。本试验中虽然CB8组血清HDL-C含量较对照组有降低的趋势，但各组血清TC和LDL-C含量没有显著差异，表明犊牛脂类代谢正常。
幼龄反刍动物血清中GLU主要从消化道吸收获得，但随着动物的生长发育，肝脏的糖异生作用逐渐增强，血清中的GLU变成主要来源于肝脏合成。而肝脏合成GLU的前体物是丙酸，饲粮添加丁酸梭菌能增加瘤胃中丙酸和丁酸的含量。本试验中，CB8组的血清GLU含量较对照组和CB4组显著升高，可能是由于丁酸梭菌提高了犊牛瘤胃发酵产生的丙酸含量，进而通过肝脏的糖异生作用产生了更多的GLU。
血清生化指标是分析动物体内物质代谢情况和机体生理情况的重要依据。本试验血清生化指标大部分结果与李文茜等[20]在犊牛断奶阶段上的研究并不一致，但与丁酸梭菌在单胃动物上的研究结果[29]基本一致。目前，丁酸梭菌的研究主要集中在鸡、猪等单胃动物上，在反刍动物上的研究还很少，因此需要更多的试验去探究丁酸梭菌对犊牛血清生化指标及机体健康的影响。
3.3 丁酸梭菌对犊牛血清抗氧化和免疫指标的影响动物在健康状态下，机体氧化应激和抗氧化状态维持在一种良好的动态平衡。犊牛在氧化应激状态下，机体内自由基过量，氧化物过量，会对机体造成氧化损伤，MDA作为脂质过氧化反应的产物，可以反映机体的氧化应激程度。而抗氧化相关指标反映机体清除自由基的能力，SOD是生物体内重要的抗氧化物酶，T-AOC是衡量抗氧化功能的综合指标，GSH-Px是机体内最重要的非酶性抗氧化物。廖秀冬[30]研究发现，饲粮中添加2.5×108~10.0×108 CFU/kg的丁酸梭菌可显著增加血清和组织中SOD、谷胱甘肽S转移酶(GST)活性和谷胱甘肽(GSH)含量，提高21和42日龄肉鸡十二指肠、空肠、回肠黏膜及肝脏和血清的抗氧化能力。本试验结果显示，饲粮中添加丁酸梭菌对犊牛血清MDA含量没有显著影响，但CB8组的血清GSH-Px活性较对照组显著升高，CB4组的血清SOD活性较对照组显著升高，T-AOC有升高的趋势。这与前人的研究结果[31-32]一致。这表明饲粮中添加丁酸梭菌能够提高犊牛的抗氧化水平，更好地清除氧化自由基，改善机体健康。丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸和氢气也具有抗氧化的作用。丁酸及丁酸盐能够增强动物体内过氧化氢酶(CAT)活性，降低MDA含量，缓解皮质酮诱导的氧化应激[33]。氢气是具有还原性质的物质，能选择性地清除细胞中羟自由基，起到抗氧化作用[34]。
血清免疫球蛋白是机体抗感染的重要物质，含有特异和非特异性抗体，具有抗菌、抗病毒、抗外毒素等多种功能[26]。丁酸梭菌能激活动物机体免疫系统，机理尚不明确，但丁酸梭菌及其产生的物质能够刺激肠道黏膜的免疫活性，提高动物免疫力[35-36]。本试验中，饲粮中添加丁酸梭菌后，CB8组的血清IgG含量显著升高，CB4组有升高的趋势，与上述文献中的研究结果[35-36]一致，表明饲粮中添加丁酸梭菌及其代谢物能提高犊牛机体的免疫功能。
3.4 丁酸梭菌对犊牛粪便肠道微生物数量的影响反刍动物胃肠道存在大量的微生物，在一定生长阶段饲粮不变的情况下，微生物区系处于一种相对稳定的状态。这些微生物包括有益菌、有害菌和条件致病菌，有益菌可促进胃肠道对营养物质的吸收，有害菌会释放内毒素等有害物质，造成动物感染和炎症反应。研究表明，丁酸梭菌可有效地促进胃肠道中有益菌粪链球菌、粪杆菌等的增殖和代谢，抑制肠道内产气荚膜梭菌、大肠杆菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌等病原菌的黏附和生长[37]。王远霞等[38]研究发现，丁酸梭菌能改善断奶仔猪空肠的微生物多样性，提高有利于肠道健康的有益菌瘤胃球菌属、粪球菌属、布劳特氏菌属、罗斯氏菌属等菌属的相对丰度，降低条件致病菌假单胞菌属和肠杆菌科等有害菌的相对丰度，有效改善动物的肠道微生态结构。本试验结果显示，与对照组相比，CB4组和CB8组的粪便中丁酸梭菌数量分别提高了5.3倍和7.4倍，粪便中大肠杆菌数量显著降低；CB4组的粪便中沙门氏菌数量显著降低，CB8组有降低的趋势。其原因可能是丁酸梭菌通过了犊牛的前胃到达肠道，丁酸梭菌及其代谢物丁酸等可有效抑制有害菌的生长，同时产生的消化酶把多聚糖转化为低聚糖，给肠道有益微生物提供必需生长物质，利于有益菌的生长和繁殖。
4 结论① 饲粮中添加丁酸梭菌能一定程度上提高犊牛的生长性能，降低腹泻率；提高血清GLU和IgG含量；增强机体抗氧化能力和免疫功能，改善犊牛健康。
② 本试验中，饲粮中添加8 g/d丁酸梭菌(活菌数为5×108 CFU/g)的效果优于4 g/d。
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