2. 西南大学动物科学技术学院, 重庆 402460
2. College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 402460, China
非结构性碳水化合物(nonstructural carbohydrate，NSC)是反刍动物重要的能量来源之一。幼龄反刍动物的健康状况与成年畜生产水平密切相关，由于其瘤胃发育尚不完善，对纤维物质的消化能力较弱，其主要依靠降解NSC获取能量。NSC主要包括可溶性糖和淀粉。根据淀粉的分子结构，可将其分为直链淀粉和支链淀粉[1]。直链淀粉易老化形成抗性淀粉，阻止内源淀粉酶接近，难以被机体直接利用，但能被消化道微生物降解，从而有益于肠道健康[2]。支链淀粉在瘤胃内降解速率快，能迅速为机体提供能量，有效促进瘤胃上皮发育。但是，支链淀粉进食量过高，会使挥发性脂肪酸(VFA)快速累积，可能引起瘤胃pH下降，诱发亚急性或急性瘤胃酸中毒，进而危害瘤胃健康，反而不利于瘤胃上皮发育[3]。因此，通过调控饲粮中淀粉结构的组成比例，进而调节瘤胃发酵过程以促进羔羊瘤胃发育、维持和提升瘤胃功能的稳定是动物营养学家关注的焦点之一。研究表明，当饲粮直链/支链淀粉比例从0.12增加到0.48时并不影响羔羊瘤胃细菌多样性、均匀度和丰度[4]。而给断奶前羔羊补饲直链/支链淀粉比例为0.11~0.44的饲粮时，会显著降低羔羊瘤胃上皮乳头长度及上皮各层的厚度[5]。Wang等[2]发现，给山羊饲喂高直链淀粉饲粮，不仅会改善瘤胃pH及VFA浓度与组成，还可改善机体葡萄糖代谢、氮代谢及健康状况。进一步提高饲粮直链淀粉比例是否会改善瘤胃功能及其上皮形态目前并不清楚。因此，本试验以高直链玉米淀粉(简称高直玉米)替代正常玉米淀粉，配制3种不同直链/支链淀粉比例的饲粮，研究其对断奶羔羊瘤胃液物理特征、瘤胃细菌组成、瘤胃发酵及其上皮乳头形态特征等的影响，以明晰直链淀粉对断奶羔羊的营养生理作用，并为饲粮配制提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所用试验羊及高直链淀粉分别由浏阳某研发中心和海南某科技有限公司提供。
1.2 试验动物及饲养管理选取27头体况良好、体重为(8.97±0.19) kg的3月龄湘东黑山羊断奶羔羊，将其随机分为3组，每组9头，其中公羔4头，母羔5头。所有试验羊统一驱虫，单笼饲养，每日饲喂2次(09:00和17:00)，自由饮水。试验期间密切观察试验羊采食规律、行为表现及健康状况。
1.3 试验饲粮试验饲粮配方与陈凯等[6]的研究相同，饲粮精粗比设为60 ∶ 40，直链/支链淀粉比例分别约为0.263、0.611和1.833，饲粮精料组成与营养水平见表 1。粗料为苜蓿干草，铡短，长度为1~2 cm；精料经2.5 mm筛粉碎。试验羊自由采食，根据当日剩料量调整后1 d的投料量。
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表 1 精料组成与营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of concentrates (DM basis) |
采用单因子随机区组试验设计，将3种饲粮随机分配给3组试验羊。试验期共35 d，其中1~7 d为预试期，8~35 d为正试期。预试期内，在同一饲养管理条件下，将饲粮逐步过渡到试验羊各自的试验饲粮。
1.5 样品采集及预处理在正式期结束的第2天晨饲前，对所有试验羊处以安乐死，取出的瘤胃液经4层纱布过滤后立即测定瘤胃液Zeta电位、电泳速率及表面张力。同时，从瘤胃腹侧、背侧、前部、后部及中间5个位点共取内容物约100 g，立即用4层纱布过滤，滤液装入1.5 mL无菌无酶管，滤渣装入50 mL无菌无酶管，迅速放入液氮速冻后，-80 ℃保存待测。从瘤胃顶部、中部及底部分别剪取1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的组织块放入事先准备好的固定液(赛维尔生物技术公司生产，主要成分为多聚甲醛和磷酸盐缓冲液)中固定。
1.6 指标测定 1.6.1 瘤胃液表面张力与电化学指标用JYW-200B全自动界面张力仪(承德市科承试验机器有限公司)测定瘤胃液表面张力。用Zeta电位分析仪(Brookhaven Instruments company)测定瘤胃液Zeta电位与电泳速率等电化学指标。
1.6.2 瘤胃液微生物酶活性参照试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提供的方法测定瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶、中性木聚糖酶及纤维素酶等微生物酶活性；参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)提供的方法测定瘤胃液蛋白质含量。
中性蛋白酶活性单位(U)定义为30 ℃、碱性条件下每分钟每毫克蛋白质水解产生1 μmol酪氨酸的量为1个酶活性单位。α-淀粉酶活性单位(U)定义为40 ℃、中性条件下每分钟每毫克蛋白质催化产生1 mg还原糖的量为1个酶活性单位。中性木聚糖酶活性单位(U)定义为50 ℃、pH 6.0下每分钟每毫克蛋白质水解木聚糖产生1 μmol还原糖的量为1个酶活性单位。纤维素酶活性单位(U)定义为40 ℃、中性条件下每分钟每毫克蛋白质催化产生1 μg还原糖的量为1个酶活性单位。
1.6.3 瘤胃内容物微生物qPCR定量采用Light Cycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR仪[罗氏诊断产品(上海)有限公司]测定瘤胃内容物滤液中总细菌、真菌、产甲烷菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、反刍兽新月形单胞菌、栖瘤胃普雷沃氏菌、普雷沃氏菌属及嗜淀粉瘤胃杆菌等微生物的数量。参照Yu等[7]的方法提取细菌DNA。引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，质粒DNA提取试剂盒购于艾科瑞生物工程有限公司，实时定量PCR试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司，具体操作步骤按试剂盒说明书进行。质粒构建和标准曲线的制作参照焦金真等[8]的方法进行。微生物qPCR引物序列见表 2。
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表 2 微生物qPCR引物序列 Table 2 Microbial qPCR primer sequences |
称取约3 g瘤胃内容物滤渣，用20 mL生理盐水洗涤，振荡30 s，350 r/min离心5 min，沉淀物用20 mL含15%吐温80的生理盐水在0 ℃环境下振荡2.5 h，4 ℃、15 000 r/min离心15 min后弃去上清液，沉淀物用于测定上述微生物的数量，操作方法与步骤相同。
1.6.4 瘤胃液VFA的含量参考Wang等[13]的方法测定VFA含量。发酵结束后，取2 mL发酵液，在15 000 r/min、4 ℃条件下离心10 min后，取1 mL上清液于1.5 mL离心管，加入0.1 mL 25%偏磷酸固定，静置15 min。使用1 mL注射器抽取0.8 mL液体过水系0.22 μm滤膜(天津市科亿隆实验设备有限公司)后装入上机瓶中，利用液体进样气相色谱仪(安捷伦7890A，美国)测定发酵液中各VFA含量。
1.6.5 瘤胃乳头形态特征委托武汉塞维尔生物科技有限公司对瘤胃组织样品进行包埋和切片。使用BX51正置荧光显微镜(Olympus Corporation)观察瘤胃乳头高度、宽度及绒毛面积。每张切片选取4个形态较好的瘤胃乳头进行观测，将瘤胃3个部位的所有数据归类取平均值进行统计。
1.7 统计分析用Excel 2010软件对数据进行基本处理，结果采用SPSS 19.0软件中的GLM模块进行方差分析和显著性检验，采用Duncan氏法进行多重比较，P≤0.05表示差异显著，0.05 < P < 0.10表示存在趋势。
2 结果与分析 2.1 瘤胃液表面张力与电化学指标由表 3可知，饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃液表面张力及瘤胃液Zeta电位与电泳速率等电化学指标均无显著影响(P>0.05)。
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表 3 饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃液表面张力与电化学指标的影响 Table 3 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on surface tension and electrochemistry parameters of rumen fluid in weaned lambs |
由表 4可知，改变饲粮直链/支链淀粉比例对瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶及纤维素酶活性无显著影响(P>0.05)。提高饲粮直链/支链淀粉比例显著提高中性木聚糖酶活性(P < 0.05)，饲粮直链/支链淀粉比例为1.833时，其瘤胃液中性木聚糖酶活性分别比饲粮直链/支链淀粉比例为0.611和0.263的组高341%和518%。
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表 4 饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃液微生物酶活性的影响 Table 4 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on microbial enzyme activities of rumen fluid in weaned lambs |
由表 5可知，饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃内容物液相总细菌、真菌、产甲烷菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、反刍兽新月形单胞菌、普氏菌属及嗜淀粉瘤胃杆菌等微生物数量均没有显著影响(P>0.05)。饲粮直链/支链比例对断奶羔羊瘤胃内容物固相细菌菌群的影响与液相相似，但提高饲粮直链/支链比例时，固相内容物中栖瘤胃普雷沃氏菌数量会显著下降(P < 0.05)。
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表 5 饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃内容物微生物数量的影响 Table 5 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on microbial population of rumen digesta in weaned lambs |
由表 6可知，提高饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃液总VFA的浓度以及乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸浓度和乙酸/丙酸均无显著影响(P>0.05)。
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表 6 饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃液VFA组成的影响 Table 6 Effects of dietary amylose/amylopectin ratio on VFA composition of rumen fluid in weaned lambs |
由图 1和表 7可知，饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃乳头高度、宽度与表面积均无显著影响(P>0.05)，但饲粮直链/支链淀粉比例为1.833时，瘤胃上皮乳头宽度相对饲粮直链/支链淀粉比例为0.611组提高17.0%(P=0.010)。
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图 1 断奶羔羊瘤胃上皮乳头形态特征 Fig. 1 Morphological characteristics of rumen epithelial in weaned lambs(200×) |
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表 7 饲粮直链/支链淀粉比例对断奶羔羊瘤胃乳头形态特征的影响 Table 7 Effects of dietary amylase/amylopectin ratio on morphological characteristics of rumen papilla in weaned lambs |
表面张力是液体物质的特性，其大小对瘤胃发酵、微生物活性及酶活性及微生物的黏附能力都有影响[14-15]，并受两相界面中离子浓度的影响，一般随溶质浓度的增加而降低，而且乙酸、丙酸、丁酸等有机酸都有降低溶液表面张力的作用[16]。本试验发现，3组试验羊的瘤胃液表面张力在48.8~51.1 mN/m，略低于瘤胃液正常表面张力范围(50~69 mN/m)[17]，这可能与本研究饲粮中淀粉含量较高、生成较多的有机酸(如乙酸、丙酸、丁酸等)有关，进而降低了瘤胃液的表面张力。张芳芳[4]采用精料淀粉含量为44%左右的饲粮饲喂断奶羔羊35 d时，瘤胃液总VFA浓度(44~47 mmol/L)低于本研究采用精料淀粉含量为50%~55%的饲粮饲喂断奶羔羊35 d的结果(53~57 mmol/L)。由于可供参考的文献相当少，引起瘤胃液表面张力降低的具体原因还需更多研究加以证实。本研究中改变饲粮直链/支链淀粉比例对瘤胃液表面张力无显著影响，产生这种结果可能与本试验各组均采用相同的粗饲料，而精饲料中的淀粉含量相同，进而3组试验羊瘤胃液总VFA浓度相近有关。微生物表面界面电动势，即Zeta和电泳速率，表示微生物表面固液界面上电势差，是反映微生物表面物理化学特性的因素之一，它与微生物的黏附过程及生物膜的形成有关[18]。Zeta电位绝对值越高，则微生物聚集程度越低，体系越稳定，并且死亡细菌的Zeta电位绝对值更低[19]。本试验结果表明，改变饲粮直链/支链淀粉比例不会影响瘤胃微生物体系的稳定性，同时也说明3组的微生物体系的稳定性相近。
3.2 瘤胃内容物微生物数量及酶活性饲粮化学成分及其摄入量是影响瘤胃微生物区系的关键因素。嗜淀粉瘤胃杆菌、栖瘤胃普雷沃氏菌及反刍兽新月形单胞菌是主要的淀粉降解菌，瘤胃球菌与产琥珀酸丝状杆菌是主要的纤维降解菌。栖瘤胃普雷沃氏菌是瘤胃数量较多的一类细菌，具有降解淀粉、植物细胞壁多糖及蛋白质的能力[15]。本试验中，饲粮直链/支链淀粉比例对瘤胃液相内容物优势菌种数量无显著影响，这可能与本试验中3组饲粮的蛋白质与纤维等的含量与来源都比较一致有关。但当饲粮直链/支链淀粉比例提高到0.611以上时显著降低瘤胃固相内容物中栖瘤胃普雷沃氏菌的数量，栖瘤胃普雷沃氏菌的数量主要与底物蛋白质含量和能量水平有关[20]。本试验中发酵底物蛋白质含量差异较小，故引起栖瘤胃普雷沃氏菌数量差异的主要原因可能是饲粮直链/支链淀粉比例超过0.611的组别其总淀粉含量比0.263组低(表 1)。由于试验中酶活性的测定条件与瘤胃环境条件不一致，其降解饲粮养分的酶活性可能不完全能反映其真实的活性，但由于3组瘤胃液酶活性是在相同条件下进行测定的，因此研究结果在一定程度上可以反映饲粮直链/支链淀粉比例对瘤胃液酶活性的影响。
饲粮中营养物质的降解效率的高低很大程度上受瘤胃内酶活性的影响，本试验中提高饲粮直链/支链淀粉比例对瘤胃液中性蛋白酶、α-淀粉酶及纤维素酶活性无显著影响，可能与3组间瘤胃内容物中合成上述酶相关微生物，如嗜淀粉瘤胃杆菌、瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和普氏菌属等的数量变化较小有关；另外，1.833组的试验羊瘤胃液中性木聚糖酶活性较其余2组要高。这可能与该组瘤胃固相内容物中含有产琥珀酸丝状杆菌数量较多有关，其产琥珀酸丝状杆菌数量相对其他2组高4.67%。此外，淀粉的降解程度以及酶的可及性与其结晶度呈负相关关系，结晶度越高淀粉的抗性越强[2]。直链淀粉含有大量氢键，可在淀粉分子表面形成致密的网状结构，增加表面疏水性，降低淀粉溶解性，阻碍底物与酶的结合。Stevnebø等[21]对不同直链淀粉含量的大麦淀粉水解特性的研究表明，含高直链(36.0%~49.0%)或中等直链淀粉(23.1%~29.4%)的大麦淀粉的水解率比低直链淀粉(0~3.3%)的低34%~54%。本研究中，饲粮直链/支链淀粉比例为1.833组的直链淀粉含量较其余2组高(1.833组相对0.263组和0.611组直链淀粉含量分别高22.1%和13.4%)，进而淀粉的水解也低于其他2组。Huang等[22]发现，底物快速降解组分的终产物浓度与微生物纤维降解酶活性间呈负相关关系，增加可溶性碳水化合物组分，会使纤维降解酶活性降低，这可能也是直链/支链淀粉比例为1.833组的瘤胃液木聚糖酶活性高于其他2组的原因之一。饲粮直链/支链淀粉比例为1.833组的中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维消化率最高(分别为80.45%、72.90%)也可能与该组瘤胃液中性木聚糖酶活性较高有关[6]。本试验中，虽然3组间瘤胃液α-淀粉酶活性差异不显著，但其活性随饲粮直链/支链淀粉比例的提高而降低，与前人的研究结果相同，说明直链淀粉对淀粉酶的降解有抗性作用，不易被瘤胃微生物降解。
3.3 瘤胃上皮乳头形态特征瘤胃壁凸起的乳头可增大上皮与内容物的接触面积，提高育肥羊瘤胃乳头长度、宽度和密度等组织形态结构可提高育肥性能、屠宰性能和营养物质消化率[23]。在本试验中，虽然3组间瘤胃乳头高度无显著差异，但提高饲粮直链/支链淀粉比例为0.611时瘤胃乳头高度相对0.263组和1.833组，分别提高了18.6%和10.2%，可能与该组瘤胃液中启动瘤胃上皮发育的关键性短链脂肪酸-丁酸的浓度较高有关[24]，相对0.263组和1.833组，0.611组瘤胃液丁酸浓度分别提高了32.2%和41.5%。另外，饲粮直链/支链淀粉比例提高到1.833时断奶羔羊瘤胃上皮乳头宽度相对0.263组和0.611组分别提高了8.12%和17.00%，同时，饲粮直链/支链淀粉比例提高到0.611或1.833时断奶羔羊瘤胃乳头表面积相对0.263组分别提高13.7%和20.3%，更有利于断奶羔羊瘤胃对营养的吸收，这也可能是我们前期研究中发现饲粮直链/支链淀粉比例为0.611和1.833时羔羊平均日增重显著高于0.263组的原因之一[6]，同时，结果说明适当提高饲粮直链淀粉比例可促进断奶羔羊瘤胃乳头发育。Zhao等[25]通过饲喂4种含不同淀粉来源的饲粮后发现，提高饲粮直链/支链淀粉比例可增大哺乳羔羊瘤胃乳头面积，与本试验结果相近。孙大明等[5]提高开食料直链/支链淀粉比例减少了哺乳羔羊瘤胃乳头高度与面积，与本试验结果不一致。上述试验结果不同，可能与羊只生长阶段、饲粮结构、营养组成及直链/支链淀粉设置比例等因素有关。
4 结论改变饲粮中直链/支链淀粉比例不会影响断奶羔羊瘤胃微生物体系稳定性和瘤胃液表面张力；适当提高饲粮直链/支链淀粉比例可促进断奶羔羊瘤胃上皮发育；提高瘤胃直链/支链淀粉比例会提高瘤胃液木聚糖酶活性；在湘东黑山羊断奶羔羊饲粮中直链/支链淀粉比例不超过0.611较为适宜。
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