2. 宁夏草牧业工程技术研究中心, 银川 750021
2. Ningxia Grassland and Animal Husbandry Engineering Technology Research Center, Yinchuan 750021, China
抗生素通过减少动物疾病来提高其生产性能和饲料转化率，但由于细菌抗药性的发展和对人类健康的潜在威胁，抗生素的使用一直存在争议[1]。因此，寻求有效的营养添加剂成为新时代养殖行业的重中之重。枸杞种植、加工和利用是宁夏的一项重点产业，枸杞副产物是指在枸杞种植和加工过程中，产生大量的枸杞枝、叶和残渣。这些剩余物通常当作废弃物处理，未得到科学有效利用，导致资源浪费和环境污染，同时增加生产成本。研究表明，枸杞副产物中富含粗脂肪(ether extract，EE)、粗蛋白质(crude protein，CP)、钙和磷等营养物质，营养价值丰富且无耐药性，是畜禽良好的饲料来源[2]，可代替抗生素增强动物机体的免疫力。多糖、黄酮、类胡萝卜素、有机酸、氨基酸等是枸杞副产物中活性物质[3]，其中枸杞多糖是枸杞副产物中主要功能性成分，具有抗氧化、免疫刺激、抗应激、抗炎抑菌、增强血糖控制能力等生物活性[4]。枸杞多糖在饲喂动物方面的研究已有报道。Long等[5]研究发现，饲粮中添加枸杞多糖能提高肉仔鸡生长性能、消化酶活性、抗氧化能力和免疫功能。佘禄明等[6]研究发现，饲粮中添加高剂量枸杞多糖显著增加断奶仔猪生长性能。Tan等[7]研究发现，饲料中添加枸杞提取物可以促进杂交石斑鱼生长和蛋白质沉积。目前，国内外对枸杞产品在动物生产应用研究多集中在枸杞多糖的功效与作用，而有关枸杞副产物利用方面的报道较少。
我国柠条主要利用方式多集中在改善生态环境方面，柠条种植6~8年后出现生长衰退、生产力下降的现象，因此柠条的平茬复壮极为关键[8]。合理的平茬不仅能够保护柠条正常生长，还能够带来丰富的饲草资源。与其他优质粗饲料相比，柠条木质化程度高，适口性和养分平衡性较差，因此柠条作为饲料开发利用的量较小，一般家畜食用的只是当年生幼嫩枝叶。近年来柠条饲料处理技术呈多样化，突出表现在氨化、青贮和粉碎制粒等方面[9]，提高了柠条作为家畜饲料的利用率、适口性和营养价值。柠条的可溶性碳水化合物含量低，蛋白质含量和缓冲能高，单独青贮不易成功。国内对柠条青贮调制及利用的研究已见报道，添加剂对柠条青贮饲料发酵品质影响的研究也有所开展[10-12]，但不同研究的柠条青贮饲料发酵品质差异较大。本研究以不同添加量的枸杞副产物与柠条锦鸡儿混合青贮为材料，分析混合青贮发酵过程中营养成分、发酵品质、有氧稳定性及微生物多样性的变化情况，旨在为提高柠条青贮品质和拓宽草食家畜优质饲草料来源提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验样地概况试验地为宁夏自治区吴忠市盐池县十六堡新村，位于宁夏东部，在我国北方农牧交错带北缘，东经107°41′，北纬37°37′。属典型的大陆性季风气候，气候干燥，降水量少而集中。年平均温度7.7 ℃，年平均日照2 867.9 h，平均无霜期128 d，年平均降水量270 mm，主要集中在7—9月。年平均蒸发量2 727.24 mm，大约是全年降水量的9.6倍。土壤类型主要为灰钙土、风沙土[13]。
1.2 试验材料试验于2019年6—9月在宁夏大学农学院草业科学实验室进行，选用盛花期柠条锦鸡儿品种，于2019年6月刈割，刈割后，由Aurora型手持式近红外光谱仪确定水分含量，加入蒸馏水将含水量调制在60%左右进行青贮。试验所用枸杞副产物由宁夏某生物科技有限公司馈赠，柠条锦鸡儿和枸杞副产物营养成分如表 1所示。
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表 1 柠条锦鸡儿和枸杞副产物营养成分(干物质基础) Table 1 Nutrient composition of Caragana korshinskii and Lycium barbarum by-product (DM basis) |
试验采用单因素完全随机设计，分为4个组，每组6个重复。各组柠条锦鸡儿原料中枸杞副产物添加量分别为0(对照组)、3%(L3组)、6%(L6组)和9%(L9组)。将柠条锦鸡儿原料用铡刀铡成2 cm的小段，将枸杞副产物均匀的拌于原料之中，装于500 mL青贮罐中压实，瓶口直径92 mm，封盖高97 mm，密度约为775 kg/m3，每罐350 g，青贮时间为60 d。
1.4 原料取样与测定 1.4.1 营养成分分别取柠条锦鸡儿、枸杞副产物原料及青贮60 d后柠条锦鸡儿500 g置冻干机中冻干，冻干后再次称量，计算干物质(dry matter，DM)含量。经粉碎机粉碎，过40目筛，装袋置干燥处保存。CP、EE、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、可溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate，WSC)含量参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[14]进行。
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称取5 g样品于锥形瓶中，加入45 mL蒸馏水，振荡30 min，并使样品完全浸入水中，用封口膜封口，于4 ℃下保存24 h，用4层纱布过滤取上清液，使用雷磁PHS-3G精密pH计测定pH。氨态氮/总氮(AN/TN)的测定采用苯酚-次氯酸钠比色法[15]。
挥发性脂肪酸(VFA)含量的测定：取滤液0.5 mL，加入等体积的8.2%偏磷酸，13 000 r/min离心10 min，取上清液加入内标巴豆酸，使用GCMS-TQ8040型气相色谱仪(日本岛津公司)，Rtx®-Wax毛细管色谱柱，分析测定上清液中丙酸、乙酸及丁酸含量[16]。上清液乳酸(lactic acid，LA)含量按照南京建成A019-2-1乳酸测定试剂盒进行检测。
1.4.3 有氧稳定性有氧稳定性的测定，在发酵60 d后打开全部发酵袋青贮，将温度记录仪(HOBO Pendant Temperature/Light，美国)放入发酵袋几何中心处，封口并在青贮袋上刺小孔，置于室温下保存，使空气可以自由进入袋中。同时在室内不同位置放置3个温度记录仪。若青贮袋中的温度高于室温2 ℃，则说明青贮开始腐败变质，计算开袋至腐败变质的时间，即为有氧稳定性。
1.4.4 微生物多样性分析根据E.Z.N.A.® soil DNA kit (Omega Bio-Tek公司，美国)说明书进行微生物群落总DNA抽提，DNA浓度和纯度利用NanoDrop2000进行检测，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量。用338F和806R引物对V3~V4可变区进行PCR扩增。使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences公司，美国)进行纯化，三羟甲基氨甲烷盐酸盐(Tris-HCl)洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST(Promega公司，美国)进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台(Illumina公司，美国)标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300的文库。利用Illumina公司的MiSeq PE300平台进行测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。根据97%的相似度对序列进行操作分类单元(OTU)聚类并剔除嵌合体，使用软件为UPARSE。利用RDP classifier对每条序列进行物种分类注释，比对Silva数据库，设置比对阈值为70%，并统计各样本在分类学水平上群落物种组成。采用mothur进行Alpha多样性分析。Venn图、群落组成图和偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)采用R语言软件包分析作图。
1.5 数据处理使用Excel 2010对测定指标数据预处理，再使用SPSS 23.0统计分析软件中广义线性模型(GLM)进行单因子方差分析和Duncan氏法多重比较，P < 0.05为显著差异。
2 结果与分析 2.1 不同添加量枸杞副产物对柠条锦鸡儿青贮营养成分的影响由表 2可见，各组之间DM含量无显著差异(P>0.05)。L9组CP含量最高，为11.74%，显著高于其他各组(P < 0.05)。L9组EE含量最高，为7.13%，显著高于其他各组(P < 0.05)。各组之间WSC含量无显著差异(P>0.05)，其中L9组最高，为0.33%；对照组最低，为0.29%。L6组和L9组多糖含量显著高于对照组(P < 0.05)，分别比对照组提高了1.52%和1.83%。NDF含量随枸杞副产物添加量的增加而降低，L9组NDF含量最低，为62.27%，显著低于其他各组(P < 0.05)。L9组ADF含量最低，为53.14%，显著低于其他各组(P < 0.05)。L9组相对饲喂价值显著高于其他各组(P < 0.05)。
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表 2 不同添加量枸杞副产物对柠条锦鸡儿青贮营养成分的影响(干物质基础) Table 2 Effects of different supplemental levels of Lycium barbarum by-product on nutrient composition of Caragana korshinskii silage (DM basis) |
由表 3可知，添加枸杞副产物可降低柠条锦鸡儿青贮pH，其中对照组pH最高，为5.17；L9组pH最低，为4.13，显著低于对照组(P < 0.05)；L6组和L9组pH在4.8以下，达到良好青贮饲料水平。L6组和L9组NH3-N/TN显著低于对照组(P < 0.05)，其中L9组NH3-N/TN最低，为4.87%。L9组乳酸含量显著高于其他各组(P < 0.05)，比对照组提高了1.2%。L6组和L9组乙酸和丙酸含量显著低于对照组(P < 0.05)，与L3组差异不显著(P＞0.05)。L6组和L9组乳酸/乙酸显著高于对照组(P < 0.05)。各组未检测到丁酸含量。
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表 3 不同添加量枸杞副产物对柠条锦鸡儿青贮发酵品质的影响(干物质基础) Table 3 Effects of different supplemental levels of Lycium barbarum by-product on fermentation quality of Caragana korshinskii silage (DM basis) |
由图 1可知，在有氧暴露后，各组有氧稳定性分别为49.7、51.8、58.3、53.8 h，均超过49.0 h，即在有氧暴露49.0 h内均未发生有氧腐败。L6组和L9组有氧稳定性显著高于对照组(P < 0.05)。
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数据柱标注相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。 Value columns with the same small letter mean no significant difference (P＞0.05), while with different small letters mean significant difference (P＜0.05). 图 1 不同添加量枸杞副产物对柠条锦鸡儿青贮有氧稳定性的影响 Fig. 1 Effects of different supplemental levels of Lycium barbarum by-product on aerobic stability of Caragana korshinskii silage |
由表 4可知，各组的覆盖度均大于0.99，说明结果可以代表样本微生物群落的真实情况。L3组、L6组和L9组Chao指数和ACE指数均显著高于对照组(P < 0.05)，说明枸杞副产物可以增加柠条锦鸡儿青贮微生物丰度。L3组和L9组Shannon指数显著高于对照组(P < 0.05)，说明枸杞副产物能提高柠条锦鸡儿青贮微生物多样性。对照组Simpson指数最高，显著高于L3组和L9组(P < 0.05)，说明对照组的微生物群落组成的丰富度和均匀度更低。
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表 4 Alpha多样性指数 Table 4 Alpha diversity indexes |
由图 2可知，根据高通量测序结果在属水平上分析核心菌群，结果表明不同样本在属水平优势菌群相似，但相对丰度不同。其中，青贮过程中乳杆菌属(Lactobacillus)相对丰度高于其他菌属，也从微生物的角度说明枸杞副产物处理的柠条锦鸡儿青贮中，乳杆菌属为优势菌属，其隶属于厚壁菌门、芽孢杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科，是导致样本中厚壁菌门微生物相对丰度高的直接原因。片球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)相对丰度次之。与对照组相比，L3组、L6组和L9组微生物群落中不仅发现了乳杆菌属，还有一定数量的魏斯氏菌属(Weissella)和肠杆菌属(Enterobacter)等在发挥作用，对于降低发酵环境的pH和提高有机酸的含量有重要作用。
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Lactobacillus：乳杆菌属；Pediococcus：片球菌属；Enterobacter：肠杆菌属；Enterococcus：肠球菌属；Weissella：魏斯氏菌属；Vibrio：弧菌属；Halomonas：盐单胞菌属；Kosakonia：小坂菌属；Rhodococcus：红球菌属；Pantoea：泛菌属；Sphingomonas：鞘氨醇单胞菌属；Marinilactibacillus：海生乳杆菌属；Staphylococcus：葡萄球菌属；Hymenobacter：薄层菌属；Others：其他。FM：柠条锦鸡儿；LBR：枸杞副产物。图 3同。 FM：Caragana korshinskii；LBR：Lycium barbarum by-product. The same as Fig. 3. 图 2 微生物群落组成分析图 Fig. 2 Analysis chart of microbial community composition |
由图 2可知，在OTU水平上分析了柠条锦鸡儿青贮前后微生物群落组成情况，青贮前的柠条锦鸡儿OTU数最多，达568个，特有的OTU数为378个。青贮后，L9组OTU数和特有OTU数最高，分别为218和45个；对照组特有OTU数最少，为3个；所有组共有的OTU数为30个。这说明与对照组相比，L3组、L6组和L9组的微生物多样性均有所增加。
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图 3 微生物群落Venn图 Fig. 3 Venn map of microbial community |
枸杞副产物中含有较高的CP、EE和消化能，归于能量饲料原料。柠条锦鸡儿青贮中添加枸杞副产物，可以降低水分含量，有助于改善柠条锦鸡儿营养成分。饲料中多糖是瘤胃微生物的重要能量和碳源[17]。本研究中，添加枸杞副产物组DM损失减少，青贮过程中发酵底物充足，枸杞副产物中的碳氮源转换为有机酸，使pH下降，促进青贮时乳酸发酵，有效地抑制了酵母菌及霉菌等有害菌增殖，减缓DM与营养成分损失。由于柠条锦鸡儿和枸杞副产物中CP含量较高，经过混合青贮后贮后各组的CP含量高于单一柠条锦鸡儿青贮，且随枸杞副产物添加量的增加，柠条锦鸡儿青贮的CP含量增加，与成启明等[10]试验结果一致。L9组WSC含量增加，推测枸杞副产物抑制乳酸菌的生长，且木质纤维素降解过程中产生过量WSC未被微生物完全利用或无法被微生物利用[18]。枸杞中含有多种生物活性成分，如黄酮类化合物、枸杞多糖，枸杞多糖具有促进生长、调节免疫力、消炎抑菌等多种生物学功能。本研究中，添加9%枸杞副产物显著提高了柠条锦鸡儿青贮中多糖含量。研究表明，在鸡、猪、兔及反刍动物饲粮中添加适量的枸杞多糖，可增强动物免疫力，提高生长性能及改善肉品质，一定程度上提高了畜禽养殖的经济效益[19]。本试验中，添加枸杞副产物有效降低了柠条锦鸡儿青贮中NDF和ADF含量，推测枸杞副产物为乳酸菌和纤维素分解菌等饲用菌提供了充足的能源，促进了纤维素分解菌对青贮饲料细胞壁的破坏，降解纤维成分。NDF和ADF含量是反映纤维质量好坏的有效指标，ADF含量与动物消化率呈负相关，ADF含量越低，饲草的消化率越高，相对饲用价值越大[20]。这与本研究结果的变化趋势基本一致，说明添加枸杞副产物对保存营养成分、提高相对饲喂价值有一定作用。
3.2 枸杞副产物对柠条锦鸡儿青贮发酵品质的影响pH和氨态氮是评定青贮发酵品质的重要指标，反映了腐败菌分解程度，较低的pH更有利于青贮饲料的长期稳定保存。本试验中，在添加枸杞副产物的各组中，随着枸杞副产物添加量逐渐提高，pH随之下降。初期柠条锦鸡儿青贮中大量碳水化合物转化为乳酸，一定程度上抑制了柠条锦鸡儿青贮中腐败菌的生长，导致pH下降。NH3-N/TN反映青贮饲料中蛋白质和氨基酸分解程度，正常青贮饲料中蛋白质只分解至氨基酸，氨存在则表明有腐败现象，NH3-N/TN越大，说明蛋白质和氨基酸分解得越多，意味着青贮饲料品质不佳。本研究中，L6组和L9组NH3-N/TN显著低于对照，且均低于10%，这与Fang等[21]和于浩然等[22]的研究结果一致，说明添加枸杞副产物降低了蛋白质水解程度，青贮发酵品质较好[23]。本试验中，添加枸杞副产物能降低柠条锦鸡儿青贮pH、NH3-N/TN及乙酸和丙酸含量，提高乳酸含量。乳酸的生成是由于青贮中乳酸菌利用自身的酶类物质，通过糖酵解(EMP)途径降解了枸杞副产物中的碳水化合物(如葡萄糖)，进而发酵产生了以乳酸、石酒酸和草酸为主的有机酸[24-25]，因此添加枸杞副产物可提高乳酸含量。这说明添加枸杞副产物可以促进柠条锦鸡儿青贮中乳酸发酵，提高青贮饲料的发酵品质和营养价值，与王保平[26]研究结果相似。在青贮开袋后，由于表层压实密度降低，青贮料与空气接触，导致青贮中的酵母菌、霉菌等好氧微生物开始活跃，使得青贮料变质进程开始，其中好氧微生物利用青贮中的营养物质进行大量繁殖。柠条锦鸡儿青贮在开袋49.7~58.3 h后已经开始变质，说明好氧微生物的霉菌和酵母菌开始快速繁殖。较低的pH为青贮提供稳定的发酵环境，可以更好地抑制腐败菌生长，使有氧稳定时间延长，而酵母菌可以利用乳酸产生酒精，并发生有氧变质[27]。添加枸杞副产物改善了柠条锦鸡儿青贮有氧稳定性，推测枸杞副产物中的枸杞多糖等活性物质抑制了腐败微生物，如酵母菌和霉菌的生长繁殖，从而降低了对青贮饲料营养物质的消耗利用。
3.3 枸杞副产物对柠条锦鸡儿青贮微生物多样性的影响微生物多样性指数Chao指数逐渐增加，样品中OTU数也随之增加。本试验中，随着枸杞副产物添加量的增加，柠条锦鸡儿青贮中细菌的物种总数增加，整个发酵环境适合细菌的生长与繁殖。添加枸杞副产物组的Shannon指数升高，Simpon指数降低，说明添加枸杞副产物组的微生物多样性处优势地位，推测柠条锦鸡儿发酵过程中微生物利用了氨基酸或水解了蛋白质，导致微生物多样性增加。
不同处理的青贮饲料中微生物多样性具有明显差异。本试验中，对照组微生物多样性较低，乳杆菌属相对丰度较高，可能是发酵底物较少，发酵过程中乳杆菌属占优。有研究发现，乳杆菌属是青贮发酵饲料菌群的关键菌属[28]。李凤姿[29]在酸菜发酵中添加乳酸杆菌后，总酸含量显著提高，pH显著降低。本试验在添加枸杞副产物后，柠条锦鸡儿青贮中发挥主要作用的乳酸菌为乳酸杆菌，此结果与Bai等[30]试验结果一致。在青贮中常见的乳酸杆菌有布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌及干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等[31]。随着青贮发酵时间的延长，pH不断降低，较耐酸的乳杆菌属微生物更具优势，这可能是导致其相对丰度最高的主要原因。有研究证明，在青贮过程中参与乳酸发酵的细菌菌群主要有乳杆菌属、片球菌属、魏斯氏菌属和肠球菌属[32-33]。本试验中，与对照组相比，L3组、L6组和L9组肠球菌属和魏斯氏菌属相对丰度增加，L6组和L9组片球菌属相对丰度增加。片球菌是同型发酵乳酸菌，能产生更多乳酸。添加枸杞副产物后柠条锦鸡儿青贮中不只1种乳酸菌在发挥作用，片球菌、肠球菌及魏斯氏菌在共同发挥作用，可能是枸杞副产物中的枸杞多糖作为益生元被乳杆菌吸收、利用，从而起到了增菌作用。这与Tohno等[33]报道的青贮过程中乳酸菌属主要为乳杆菌、片球菌和肠球菌的结果相一致。枸杞副产物可改变柠条锦鸡儿青贮的微生物群落组成，降低柠条锦鸡儿青贮中乳杆菌属的相对丰度，增加片球菌属的相对丰度，产生更多乳酸[34]，进一步说明枸杞副产物可增加柠条锦鸡儿青贮中乳酸含量，改善发酵品质。
4 结论① 添加枸杞副产物改善了柠条锦鸡儿青贮的营养价值、发酵品质和有氧稳定性。
② 添加枸杞副产物改变了柠条锦鸡儿青贮的微生物群落结构，增加了魏斯氏菌属和肠球菌属的相对丰度，降低了乳杆菌属的相对丰度。
③ 综合考虑，枸杞副产物添加量为9%时柠条锦鸡儿的青贮效果最好。
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