2. 新疆伊犁哈萨克自治州昭苏县种马场, 昭苏 835000
2. Yili Kazak Autonomous Prefecture of Zhaosu Racecourse, Zhaosu 835000, China
运动马比赛成绩优劣依赖于马匹多种器官机能和功能的协调配合及高效运行，运动系统在马匹完成高强度训练和竞赛中具有重要作用[1]。马匹骨骼肌的能量贮备和供能效率对速度赛马具有重要意义[2]。胍基乙酸(guanidineacetic acid，GAA)又称为N-咪基甘氨酸(N-amidinoglycine)，在动物体内由甘氨酸和L-精氨酸合成，甲基化后形成肌酸(creatine，Cr)[3]。GAA可作为肌酸激酶(creatine kinase，CK)和补充磷酸肌酸(phosphocreatine，PCr)的底物，提高肌肉中磷酸肌酸贮备量及转化为ATP的效率，保持肌肉高强度剧烈运动[4]；可通过节约精氨酸来促进蛋白质和一氧化氮(NO)的合成，进而提高肌肉发达能力，舒张血管[5]；可通过激活一些抗氧化酶的活性和增加总抗氧化能力来提高细胞抗氧化水平[6]。Ostojic等[7]研究发现年轻个体中补充1.2~4.8 g/d GAA 6周后，可以提高志愿者手握力、肌肉耐力，进而提高运动能力。有研究表明，饲粮中添加38 g/d的GAA，饲喂38 d后可提高速步马的运动成绩, 提高赛后血浆中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力[8]。Ale等[9]在研究GAA对肉鸡能量代谢的影响时发现，饲粮中添加1.2 g/kg的GAA，饲喂35 d后可以促进肌肉的能量代谢，而且影响肌肉中肌酸总量、磷酸肌酸及ATP的含量，从而提高能量利用率。伊犁马是我国自主育成的马品种，主要分布于新疆伊犁地区，具有良好的运动性能，在2019中国“丝绸之路杯”比赛中，3 600和8 000 m速度赛冠军均为伊犁马，展现出超凡的速度和耐力。但伊犁马目前存在激烈运动竞赛后易疲乏、恢复慢等问题，严重制约了伊犁马优异运动性能的发挥。因此，本试验选用速度赛用伊犁马为研究对象，探究饲粮中添加不同剂量的GAA对伊犁马2 000 m速度赛成绩、运动性能、糖代谢以及抗氧化能力的影响，为GAA在运动马饲粮中的应用提供科学参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验时间及地点本试验于2020年5月17日至2020年7月2日在新疆维吾尔自治区伊犁哈萨克自治州昭苏种马场进行。
1.2 试验设计及饲粮组成挑选20匹年龄为2~3岁、体重[(373.20±30.53) kg]相近且经过训练的速度赛用伊犁马，随机分为4组，每组5匹(3♀+2)，进行为期8周的试验。所有试验马匹试验饲粮组成及营养水平一致，具体见表 1。每匹马每天饲喂精料补充料4 kg，自由采食青干草(苜蓿和山草)，在此基础上，各组每天每匹马分别补喂0(CON组)、25(25 GAA组)、50(50 GAA组)、75 mg/kg(75 GAA组)的GAA(购自北京某农牧科技股份有限公司，纯度≥98.0%)。GAA与玉米和次粉按照2 ∶ 1 ∶ 1制作成颗粒后，混合于精料补充料中补喂。本试验中GAA的补喂量参考Ostojic等[10]和Setoue等[11]的研究结果。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (DM basis) |
试验马匹单厩饲养管理，自由饮水。补喂的GAA与精料补充料分为2份装入封口袋，每日分2次饲喂，分别在08:00和20:00；青干草每日分3次添喂，分别在07:30、13:30和19:30。饲喂时先粗后精，先采食粗饲料1 kg，再补给精料补充料，待精料补充料采食完毕后，继续添喂粗饲料。每天按时打扫马厩，清除粪便和垫草，并更换为干燥柔软的垫草。
1.4 训练方案及场地试验马匹每天进行1次速度训练，马匹训练时间安排在11:00—13:00或者17:30—19:30。首先进行热身训练，骑手骑乘试验马先在草道上慢步10 min，随即进入沙道，进行10 min快步训练，然后15 min慢跳训练，最后停止训练，牵遛5~10 min，直至马匹呼吸平稳。训练场地为新疆昭苏种马场伊犁马测试调训中心，赛道由椭圆形沙道和草道组成。内部沙道由细沙构成，深度40 cm，底部为土基，道宽21 m，周长为800 m；外部草道由天然的牧草形成，宽20 m，周长为1 000 m。
1.5 样品采集及指标测定 1.5.1 平均速度测定在试验第0天(正试期开始前)和试验第47天在新疆昭苏种马场伊犁马测试调训中心进行2 000 m速度赛，用秒表记录每匹马的比赛用时，用以下公式计算平均速度、平均每千米耗时、平均耗时减少以及成绩提高幅度。
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在试验第47天进行2 000 m速度赛，用脉搏仪记录每匹马赛前2 h(备好鞍前)、赛后即刻以及赛后2 h的心率，同时测定呼吸频率。
1.5.3 血浆生化指标测定于试验第47天进行2 000 m速度赛的赛前2 h、赛后即刻、赛后2 h使用5 mL肝素钠抗凝管和4 mL氟化钠抗凝管于马匹颈静脉采集血液各1管，以3 500 r/min离心10 min，收集血浆，分装，-20 ℃冷冻保存。
血浆送至北京华英生物技术研究所测定血浆生化指标。胰岛素(INS)、胰高血糖素(Gc)含量采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法测定；葡萄糖(GLU)、乳酸(LD)、丙二醛(MDA)含量，肌酸激酶(CK)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活性及总抗氧化能力(T-AOC)采用比色法测定。
1.5.4 尿液肌酸代谢物含量测定于试验第47天，实时跟踪监测马匹赛后状态，使用自制移动收尿装置，收集试验马匹赛后尿样，将尿液充分摇匀后，收集样品50 mL存入冻存管，-20 ℃冷冻保存。
马匹血浆及尿液中GAA、肌酸、肌酐含量在新疆农业大学动物科学学院动物营养与饲料科学实验室利用高效液相色谱法测定[12]。取待检测血浆样本200 μL置于EP管中，加入400 μL乙腈，涡旋混匀，静置10 min，12 000 r/min离心10 min，取100 μL上清用200 μL磷酸溶液(2 mmol/L)稀释，涡旋混匀，取20 μL进样，进行高效液相色谱分析。处理后的样品经IC YS-50弱酸性阳离子交换柱分离，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，用紫外检测器于210 nm波长处进行检测。
1.6 数据处理与分析试验数据均采用Excel 2010进行初步整理，SPSS 19.0统计软件的ANOVA程序进行单因素方差分析，差异显著则用Duncan氏法进行多重比较，采用正交多项式对比，检验血浆和尿液中肌酸代谢物、糖代谢及抗氧化指标变化的线性和二次效应。结果以“平均值±标准差”(mean±SD)表示，以0.05≤P < 0.10作为有显著趋势，P < 0.05为差异显著水平，P < 0.01为差异极显著水平。
2 结果 2.1 补喂GAA对伊犁马运动性能的影响 2.1.1 补喂GAA对伊犁马2 000 m速度赛成绩的影响结果见表 2，与CON组相比，各试验组试验初始和试验第47天时2 000 m速度赛平均速度、平均每千米耗时均无显著差异(P>0.05)；与试验初始相比，试验第47天时，CON组、试验组2 000 m速度赛的平均速度均有所提高，成绩提高幅度呈现二次显著性变化，其中25 GAA组、50 GAA组以及75 GAA组成绩提高幅度分别为5.23%、6.68%、2.70%，各试验组均显著高于CON组(P < 0.05)。
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表 2 补喂GAA对伊犁马2 000 m速度赛成绩的影响 Table 2 Effects of supplementary feeding GAA on performance of 2 000 m speed race of Yili horses (n=5) |
结果见表 3，各组马匹赛前2 h生理状态稳定，呼吸和心率差异均不显著(P>0.05)。与CON组相比，各试验组马匹赛后即刻呼吸、心率差异均不显著(P>0.05)；赛后2 h时，各组马匹呼吸心率恢复到正常水平，各组间差异不显著(P>0.05)。
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表 3 补喂GAA对伊犁马2 000 m速度赛赛前、赛后即刻及赛后呼吸心率的影响 Table 3 Effects of supplementary feeding GAA on respiratory heart rate before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5) |
结果见表 4，各试验组赛前2 h血浆GAA含量与CON组相比均无显著差异(P>0.05)；50 GAA组赛后即刻血浆GAA含量显著高于CON组(P < 0.05)；75 GAA组赛后2 h血浆GAA含量显著低于CON组(P < 0.05)；各试验组赛后2 h血浆肌酸含量与CON组相比，均无显著差异(P>0.05)；25 GAA组赛前2 h血浆肌酸含量显著低于CON组(P < 0.05)；50 GAA组赛后即刻血浆肌酸含量显著高于CON组(P < 0.05)。与CON组相比，各试验组赛前2 h、赛后2 h血浆肌酐含量均无显著差异(P>0.05)；50 GAA组赛后即刻血浆肌酐含量显著高于CON组(P < 0.05)。赛前2 h和赛后即刻肌酸激酶活性在总体、线性和二次效应上均呈现显著性变化，75 GAA组赛前2 h、赛后2 h的血浆肌酸激酶活性最高，极显著高于25 GAA组(P < 0.01)；50 GAA组、75 GAA组赛后即刻各试验组血浆肌酸激酶活性极显著高于CON组(P < 0.01)，同时50 GAA组极显著高于75 GAA组(P < 0.01)。
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表 4 补喂GAA对伊犁马2 000 m速度赛赛前、赛后即刻及赛后血浆肌酸代谢物含量的影响 Table 4 Effects of supplementary feeding GAA on plasma creatine metabolites content before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5) |
结果见表 5，GAA、肌酸和肌酐排出量在总体、线性和二次效应上均呈现极显著性变化，25 GAA组、75 GAA组赛后尿的GAA排出量均极显著高于CON组(P < 0.01)；25 GAA组、50 GAA组赛后尿的肌酸排出量均极显著高于CON组(P < 0.01)；各试验组赛后尿的肌酐排出量均极显著高于CON组(P < 0.01)。
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表 5 补喂GAA对伊犁马2 000 m速度赛赛后尿液肌酸代谢物排出量的影响 Table 5 Effects of supplementary feeding GAA on urinary creatine metabolite excretion after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5) |
结果见表 6，赛后即刻、赛后2 h血浆胰高血糖素含量在总体和线性效应上呈现极显著性变化，75 GAA组赛后即刻和赛后2 h的胰高血糖素含量极显著低于CON组(P < 0.01)，50 GAA组赛后即刻和赛后2 h的胰高血糖素含量极显著低于CON组(P < 0.01)；赛前2h、赛后即刻和赛后2 h血浆胰岛素含量在总体和线性效应上呈现极显著性变化，与CON组相比，各试验组赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h的胰岛素含量均极显著高于CON组(P < 0.01)；赛后即刻、赛后2 h血浆葡萄糖含量在总体和线性效应上呈现极显著性变化，各试验组赛前2 h葡萄糖含量均显著高于CON组(P < 0.05)，赛后即刻和赛后2 h葡萄糖含量均极显著高于CON组(P < 0.01)；赛前2 h、赛后2 h血浆乳酸含量在总体、线性和二次效应上均呈现极显著性变化，与CON组相比，各试验组赛前2 h、赛后即刻和赛后2 h的乳酸含量均极显著低于CON组(P < 0.01)。
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表 6 补喂GAA对伊犁马2 000 m速度赛赛前、赛后即刻及赛后糖代谢指标的影响 Table 6 Effects of supplementary feeding GAA on glucose metabolism indexes before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5) |
结果见表 7，赛前2 h、赛后即刻、赛后2 h血浆谷胱甘肽过氧化物酶活性在总体和二次效应上呈现极显著性变化，各试验组赛前2 h和赛后2 h血浆谷胱甘肽过氧化物酶活性均显著高于CON组(P < 0.05)，25 GAA组、50 GAA组赛后即刻血浆谷胱甘肽过氧化物酶活性极显著高于CON组(P < 0.01)；赛前2 h、赛后2 h血浆超氧化物歧化酶活性在总体、线性和二次效应上均呈现极显著性变化，与CON组相比，各试验组赛前2 h和赛后2 h血浆超氧化物歧化酶活性均显著高于CON组(P < 0.05)，25 GAA组、50 GAA组赛后即刻血浆超氧化物歧化酶活性极显著高于CON组(P < 0.01)；各组马匹赛前2 h、赛后即刻血浆过氧化氢酶活性均无显著差异(P>0.05)，各试验组赛后2 h过氧化氢酶活性均极显著高于CON组(P < 0.01)；赛后2 h血浆总抗氧化能力在总体、线性和二次效应上均呈现极显著性变化，各试验组赛前2 h和赛后2 h血浆总抗氧化能力均显著高于CON组(P < 0.05)，50 GAA组赛后即刻血浆总抗氧化能力极显著高于CON组(P < 0.01)；血浆丙二醛含量变化趋势相反，50 GAA组赛后即刻及赛后2 h血浆丙二醛含量极显著低于CON组(P < 0.01)。
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表 7 补喂GAA对伊犁马2 000 m速度赛赛前、赛后即刻及赛后抗氧化能力的影响 Table 7 Effects of supplementary feeding GAA on antioxidant capacity before, immediately and after 2 000 m speed race of Yili horses (n=5) |
在肌肉活动急需能量的情况下，细胞内的磷酸肌酸很容易将磷酸基团传递给ADP生成ATP和肌酸；运动后的恢复期，细胞内积累的肌酸又可以转化成磷酸肌酸在肌肉中进行贮存[13]。肌酸和磷酸肌酸作为骨骼肌能量的储存物质，可能是决定运动马运动性能的关键物质，GAA作为合成肌酸和磷酸肌酸的中间前体物质，对骨骼肌中的能量供应起着重要的调节作用。
本试验中，各试验组成绩提高幅度均显著高于CON组，50 GAA组在试验第47天，2 000 m速度赛比赛成绩比CON组缩短了5.16%，比试验初始缩短了6.68%，说明补喂GAA能够改善伊犁马的运动性能。这与Ostojic等[7]在人体试验中得出的补充1.2~4.8 g/d的GAA 6周后，可以提高肢体的肌肉耐力，提高运动能力的结果相一致。补喂GAA能够提高运动机体的运动水平可能与增加肌肉中肌酸、磷酸肌酸的储备量有关。研究显示，GAA不仅能增加骨骼肌中肌酸的贮存量，并可促进高强度运动导致肌酸减少后细胞生物能的恢复[14]。在育肥猪试验中发现，添加600 mg/kg GAA可以影响杂交仔猪肌肉中肌酸总量、磷酸肌酸及ATP的含量，使肌肉有足够的能量收缩，从而提高能量利用率[14]。
3.2 补喂GAA对运动马赛前、赛后即刻及赛后肌酸代谢物含量的影响GAA由甘氨酸和L-精氨酸合成，通过血液循环被转运至肝脏，经载体蛋白转运进入肝脏细胞合成肌酸，释放进入血液循环，然后经肌酸转运蛋白(CreaT)将肌酸转运进入肌纤维和其他组织中[14]。肌酸通过肌酸转运蛋白进入骨骼肌细胞后，在肌肉组织中被磷酸化形成磷酸肌酸[15]，参与机体反应后，代谢为肌酸酐，经尿液排出体外。
在本试验中，补喂GAA显著提高了50 GAA组马匹赛后即刻血浆GAA、肌酸、肌酐含量以及赛后尿中肌酸、肌酐的排出量，极显著提高了25 GAA组、75 GAA组赛后尿液中GAA和肌酐的排出量。Mcbreairty等[16]研究发现给3月龄仔猪补喂157 mg/kg GAA 18 d，可提高仔猪肝脏和肌肉中肌酸含量。Ardalan等[17-18]发现在牛瘤胃后补充10~30 g/d GAA 30 d，可增加血浆GAA、肌酐含量，提高尿中GAA、肌酸含量，增加牛机体的肌酸供应，这与本试验研究结果一致。机体在运动过程中需要消耗大量的能量，肌酸储备量的增加，可加强肌酸和磷酸肌酸之间的转化，进而为机体提供即时可用的能量。本试验中，赛后即刻50 GAA组的血浆GAA、肌酸、肌酐含量均高于其他各组。这与Tachikawa等[19]体外培养的非洲爪蟾细胞对GAA的吸收呈现饱和效应，且GAA、肌酸均可作为细胞摄取GAA的抑制剂结果相一致。这可能是由于肌酸和GAA在细胞内共用一个CreaT转运载体，肌酸的大量产生会对GAA的转运产生抑制，同时过量的GAA也会对转运产生自身抑制，降低机体对GAA的转运吸收。
肌酸激酶是将肌酸转化为磷酸肌酸的催化酶，机体运动时，ATP供能的水平下降不能满足机体需要，磷酸肌酸可脱掉1个磷酸根，迅速与ADP合成ATP，进而参与机体的能量代谢[20-21]。本试验中，50 GAA组、75 GAA组赛后即刻各试验组血浆肌酸激酶活性极显著高于CON组。Aziza等[22]给尼罗罗非鱼补喂不同水平GAA(0.06%、0.12%、0.18%)，结果表明，各GAA组血清肌酸激酶活性、胆固醇含量均显著高于对照组。李洁蕾[14]选用保育猪为试验对象，随机分为2组，研究表明补喂600 mg/kg GAA可极显著提高饲喂21 d后保育猪血浆肌酸激酶活性。即试验组肌酸激酶的高活性可在运动中为运动马机体提供大量可即时供能的磷酸肌酸，对运动马的运动性能有一定的积极作用。
3.3 补喂GAA对运动马2 000 m速度赛赛前、赛后即刻及赛后糖代谢的影响动物体内激素含量受多种因素影响，如运动会导致胰岛素、胰高血糖素含量发生改变。胰岛素在代谢调节中是一种作用较强的激素，能够全面促进机体的合成代谢[23-24]。在本试验中，补喂GAA极显著提高了伊犁马2 000 m速度赛赛前、赛后即刻及赛后血浆胰岛素含量，降低了血浆胰高血糖素、葡萄糖和乳酸的含量。Marco等[25]最早在动物试验中研究发现，体外注射GAA及胍基衍生物，能够刺激大鼠的胰腺分泌胰岛素，并且胍基团可是刺激胰岛素分泌的一个重要原因。GAA刺激胰岛素分泌的具体机制可能是由于GAA分子的极性能影响胰岛细胞膜去极化，并通过蛋白激酶A和C增强靶细胞膜表面胰岛素受体的活性，从而激活胰岛素信号通路[26]。胰岛素的生理功能主要表现为降低血糖含量，因此，外源性添加GAA能够降低血浆中的葡萄糖含量，从而维持血糖稳态。在保育猪的试验中，补喂600 mg/kg GAA 21 d后，发现补喂GAA可提高保育猪的血浆果糖-6-磷酸激酶、丙酮酸激酶、异柠檬酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸-辅酶Q还原酶、三磷酸腺苷合成酶活性，通过提高糖代谢和呼吸链相关酶的活性来增加ATP的合成，进而影响能量代谢[14]。孙正武[27]在探讨磷酸肌酸对脂多糖(LPS)诱导的人静脉细胞(HUVECs)及其细胞线粒体氧化磷酸化途径的调节作用时发现，磷酸肌酸对以琥珀酸为底物的呼吸控制率和磷氧比值的改善程度大于以苹果酸和谷氨酸为底物的情况，并且磷酸肌酸能够增强细胞线粒体内磷酸激酶的活性，稳定细胞整体能量代谢。
3.4 补喂GAA对运动马2 000 m速度赛赛前、赛后即刻及赛后抗氧化能力的影响GAA作为超氧化剂能够从它的共轭碱提供1个电子生成超氧阴离子－氧自由基，从而产生活性氧[28]。其代谢物肌酸是温和的直接抗氧化剂(自由基清除剂)，可通过直接清除细胞内的活性氧特别是羧基以及活性氮来保护细胞，且肌酸激活肌酸激酶，通过ADP再循环机制消耗自由基，从而发挥抗氧化作用[29]。磷酸肌酸可以抑制氧化应激反应增强抗氧化酶系统功能。生理状态下，体内自由基的产生与消除维持动态平衡。在应激情况下，自由基大量产生，当超过抗氧化防御系统的能力时，就会引起自由基的堆积，产生氧化损伤，动物通过抗氧化系统及时清除体内过多的自由基维持机体的自由基平衡[27]。
在本试验中，补喂GAA均显著提高了运动马血浆的总抗氧化能力，血浆超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性，显著降低了50 GAA组、75 GAA组血浆丙二醛含量。闻爱友等[30]研究发现在28日龄断乳仔猪饲粮中添加150~450 mg/kg GAA可以提高动物血清中总抗氧化能力以及超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性，并且降低血清丙二醛含量。Wang等[31]学者发现，在育肥猪饲粮中添加2.0 g/kg GAA，补喂54 d后显著提高了育肥猪肌肉超氧化物歧化酶活性、总抗氧化能力和血液总抗氧化能力、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶等抗氧化酶活性，极显著降低了肌肉和血液丙二醛含量。Aziza等[22]学者给180尾尼罗罗非鱼补喂不同水平GAA，结果表明，0.12%组和0.18%组血清丙二醛含量显著降低，血清超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性和一氧化氮含量均显著升高。这与本试验研究结果相一致。此外，GAA是体内合成肌酸的前体物质，添加外源性GAA可有效增加机体肌酸、磷酸肌酸的含量，同时，补喂GAA可能节省了体内从头合成肌酸的原料，增加细胞内精氨酸的含量，而精氨酸具有较强的抗氧化功效[32]。综上所述，外源补喂GAA可以提高运动马机体的抗氧化能力。
4 结论在本试验条件下，补喂25~75 mg/kg GAA提高了伊犁马血浆肌酸代谢物含量、肌酸激酶活性、赛后肌酸代谢物排出量以及机体抗氧化能力，促进了运动马机体糖代谢对运动的供能，提高了伊犁马2 000 m速度赛的运动成绩，每匹马补喂50 mg/kg时效果最佳。
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