2. 榆林市佳县方塌镇瑞兴种羊场, 榆林 719208
2. Ruixing Sheep & Goat Breeding Farm in Fangta Town of Jia County of Yulin City, Yulin 719208, China
目前，我国山羊数量及羊肉产量均位居世界第一，在世界养羊业生产中占有重要地位。陕北白绒山羊是用杂交方式培育而成的绒肉兼用型山羊新品种，具有肉质细嫩、膻味轻、口感好、肉中蛋白质高和胆固醇低等特点[1]。绒山羊以传统放牧为主，但随着我国草原面积减少，集约化舍饲养殖已成为绒山羊的主要养殖方式，这造成了羊肉风味品质的下降[2]。通过营养调控改善羊肉风味已成为一种重要的手段，大量的学者进行了相关研究。Gkarane等[3]研究发现，饲粮中不同水平的青贮饲料能引起羔羊肉风味物质的改变；刘畅等[4]研究发现，饲粮中添加亚麻籽能改变羊肉挥发性风味物质的组成和含量，提高羊肉的抗氧化能力，减少肉中不良风味的产生。刘旺景等[5]研究发现，在杜寒杂交羊饲粮中添加沙葱粉能改善肌肉中脂肪酸和风味物质的组成和含量，这与沙葱中含有黄酮类和挥发油等多种活性成分有关。刘瑞生等[6]在羔羊的精料中添加中草药，发现羊肉挥发物的种类和含量明显增加，羊肉风味得到改善。
枣中含有丰富的微量元素、维生素、多糖以及黄酮类物质，陕北佳县产枣量大，伴随有大量残次枣，可开发残次枣加工成枣粉，作为非常规的饲料资源[7]。解彪等[8]用枣粉替代羔羊饲粮中的玉米，发现枣粉能提高羔羊的生长性能，降低料重比。本课题组研究也发现饲粮中添加枣粉能提高陕北白绒山羊的生长性能以及干物质和粗蛋白质降解率，并能改善肉色，饲粮枣粉水平为20%时能有效缓解山羊肉组织中的氧化应激，提高抗氧化能力[9]。目前在饲粮中添加枣粉改善绒山羊风味物质方面的研究较少。因此，本试验在白绒山羊饲粮中添加不同水平的枣粉，研究枣粉对羊肉挥发性风味物质的影响，筛选出适宜的饲粮枣粉水平，为改善羊肉风味品质提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 试验材料枣粉由当地同一批次的残次陕北红枣全枣加工而成，所用枣粉均为同一批次生产，枣粉的营养成分及活性物质含量或活性如下：粗蛋白质6.07%，粗脂肪1.34%，粗灰分2.56%，粗纤维23.85%，总糖298.1 g/kg，总酸7.1 g/kg，总酚9.8 g/kg，黄酮462.1 mg/kg，皂苷1 012.1 mg/kg，单宁3 512.6 mg/kg，维生素C 96.5 mg/kg，自由基清除率41%，总抗氧化能力(T-AOC) 0.72 U/mg，超氧化物歧化酶(SOD)37.86 U/mg，过氧化氢酶(CAT)3.76 U/mg，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)46.71 U/mg。
1.2 试验设计、饲粮及饲养管理本试验于2018年9月至2018年12月在陕西省榆林市佳县瑞兴羊场进行，选取舍饲条件下健康无病的6月龄陕北白绒山羊40只，初始体重为(20.15±1.63) kg，按照每组8只(公母各4只)随机分成5组，分别饲喂枣粉水平为0(对照组)、10%(试验Ⅰ组)、15%(试验Ⅱ组)、20%(试验Ⅲ组)、25%(试验Ⅳ组)的试验饲粮，其中枣粉的添加是通过等比例代替基础饲粮中的玉米秸秆，试验饲粮组成及营养水平见表 1。试验饲粮参照配方配制并制成颗粒状，每日饲喂2次，分别在08:00和20:00饲喂，自由饮水，并定期清理羊舍。饲养试验预试期10 d，试验期70 d。饲喂试验结束后进行屠宰，宰前禁食24 h、禁水2 h，宰后1 h内取羊的背最长肌50 g左右于-20 ℃保存，进行电子鼻和挥发性风味物质测定。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
将肉样于4 ℃解冻后切成肉糜状，称取5 g放入15 mL进样瓶密封，60 ℃水浴45 min后，室温条件下平衡2 h，进行电子鼻检测。电子鼻(PEN3，德国Airsense公司)的试验参数：采样频率1 Hz，进气流速200 mL/min，清洗时间90 s，进样时间120 s。PEN3电子鼻的性能和参数见表 2。
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表 2 PEN3电子鼻的性能描述 Table 2 Performance description of PEN3 electronic nose |
称取1.68 mg的2-甲基-3-庚酮(色谱纯，美国Sigma公司)，先用甲醇(色谱纯，美国Sigma公司)定容至100 mL，得到0.168 mg/mL的2-甲基-3-庚酮溶液，进一步用甲醇稀释成0.168 μg/mL的2-甲基-3-庚酮溶液，作为内标物进行后续分析。
1.3.2.2 挥发性风味物质的萃取先将萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS，美国Supelco公司)置于气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)进样口进行老化；称取上述肉糜状的肉样5 g于15 mL进样瓶中，加入1 μL内标物溶液，萃取头插入进样瓶距离肉样1 cm处，于60 ℃吸附45 min，萃取结束后，取出萃取头并插入GC-MS进样口，在250 ℃条件下解吸附5 min[10]。
1.3.2.3 GC-MS条件气相色谱：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，流速l mL/min；进样口和传输线温度为250 ℃；起始温度为35 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升温到80 ℃并保持2 min，再以5 ℃/min升到130 ℃并保持2 min，最后以8 ℃/min升到230 ℃并保持5 min，不分流进样。
质谱：离子源温度250 ℃，电离方式为电轰击电离(EI)，电子能量70 eV，质量扫描范围质荷比(m/z) 30~400，溶剂延迟1 min。
质谱图经系统自带的数据库MEANLIB、NistDemo和Wiley Library检索定性，匹配度大于800作为鉴定依据。选择已知质量浓度的2-甲基-3-庚酮作为内标物，按内标物的峰面积对各挥发性风味物质进行定量分析。
1.3.2.4 关键挥发性风味物质确定采用气味活性值(odor activity value, OAV)法评价各挥发性风味物质对羊肉总体风味的贡献，计算公式如下：
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式中：C为挥发性风味物质含量(μg/kg)；T为气味阈值(μg/kg)。
1.4 数据统计与分析试验数据采用Excel 2003软件进行初步整理，采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行组间多重比较和差异显著性分析，结果以“平均值±标准差”表示。P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 不同枣粉水平对绒山羊肉电子鼻响应值的影响由表 3可知，饲粮枣粉水平对羊肉的W1C、W1W和W2W响应值有显著影响(P＜0.05)。试验Ⅲ组羊肉的W1C响应值显著高于试验Ⅳ组(P＜0.05)；试验Ⅳ组羊肉的W1W响应值显著高于试验Ⅲ组(P＜0.05)；试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组羊肉的W2W响应值显著高于试验Ⅲ组(P＜0.05)。
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表 3 不同枣粉水平对绒山羊肉电子鼻响应值的影响 Table 3 Effects of different levels of jujube powder on electronic nose response values of cashmere goat meat |
采用顶空固相微萃取(HS-SPME)结合GC-MS萃取和分离鉴定不同枣粉水平下陕北绒山羊肉中的挥发性风味物质，通过NIST数据库检索，在绒山羊肉中共检出47种挥发性风味物质，分别为醛类(15种)、醇类(11种)、酮类(4种)、烃类(6种)、酸类(5种)、酯类(2种)、其他化合物(4种)。由表 4可知，饲粮枣粉水平对羊肉中大多数的挥发性风味物质含量有显著影响(P < 0.05)。
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表 4 不同枣粉水平对绒山羊肉挥发性风味物质的影响 Table 4 Effects of different levels of jujube powder on volatile flavor substances of cashmere goat meat |
绒山羊肉中检出的醛主要为饱和醛，包括己醛、庚醛、辛醛和壬醛等。对照组的己醛含量最高，显著高于试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)，并随着饲粮枣粉水平的增加先降低后升高，以试验Ⅱ组最低(47.306 μg/kg)；对照组的壬醛、庚醛和辛醛含量显著高于试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)；癸醛、十三醛和肉豆蔻醛为长链直链醛，这3种醛的含量均为对照组、试验Ⅰ组显著高于试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)。在不饱和醛中，对照组、试验Ⅰ组的反-2-辛烯醛含量显著高于试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)。苯甲醛为芳香醛，其含量以试验Ⅱ组最高(2.298 μg/kg)，显著高于其他4组(P＜0.05)。支链醛为3-甲基丁醛，试验Ⅳ组中3-甲基丁醛含量(0.622 μg/kg)显著高于其他4组(P＜0.05)。
2.2.2 醇类绒山羊肉中含量较高的醇为正戊醇、正辛醇、1-辛烯-3-醇和反-2-辛烯醇等。正戊醇和正己醇含量均随饲粮中枣粉水平的提高而增加，试验Ⅲ和Ⅳ组的正戊醇和正己醇含量显著高于对照组和试验Ⅰ组(P＜0.05)；试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的正辛醇含量显著高于对照组和试验Ⅰ组(P＜0.05)。不饱和醇中，试验Ⅲ和Ⅳ组中1-辛烯-3-醇含量显著高于对照组和试验Ⅰ组(P＜0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的反-2-辛烯醇含量显著高于对照组、试验Ⅰ组(P＜0.05)。此外，对照组中没有检测到苯甲醇和2, 4-二甲基环己醇，在挥发性风味物质丰富度上不及4个试验组。
2.2.3 酮类羊肉中检出的酮类挥发性风味物质种类比较少，其中2, 3-辛二酮是最具代表性的物质，对照组的含量最高(46.219 μg/kg)，与对照组相比，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组均显著降低(P＜0.05)，分别降低了17.92%、44.75%、56.59%和58.43%。
2.2.4 烃类羊肉中共检出6种烃，其中试验Ⅱ和Ⅳ组检测到了6种，种类最多；试验Ⅲ组检测到了5种，试验Ⅰ组检测到了4种，对照组仅检测出3种，种类最少。在对照组中，乙苯、十三烷和十二烷的含量最高，其中乙苯含量显著高于试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)，而十三烷和十二烷含量显著高于试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)。
2.2.5 酸类羊肉中共检出了5种酸，分别为丁酸、己酸、辛酸、4-甲基辛酸和4-甲基壬酸，均为短链脂肪酸，其中己酸、4-甲基辛酸和4-甲基壬酸含量均以对照组最高，显著高于试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组(P＜0.05)。
2.2.6 酯类羊肉中检出的酯类较少，试验Ⅱ和Ⅲ组检测到了2种，试验Ⅰ和Ⅳ组检测到了1种，而对照组则没有检测到酯类，其中，试验Ⅲ和Ⅳ组的丙烯酸辛酯含量显著高于试验Ⅱ组(P＜0.05)。
2.2.7 其他类物质在羊肉还检测到了5种其他类物质，其中对照组2种，试验Ⅰ组4种，试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组各5种。其中，试验Ⅳ组的3-羟基-2-丁酮含量显著高于对照组以及试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组(P＜0.05)，试验Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的苯并噻唑含量显著高于试验Ⅰ组(P＜0.05)。
2.3 绒羊肉关键挥发性风味物质确定通常认为OAV＞1的挥发性风味物质对肉风味有贡献，OAV＞5认为是重要香气物质；在一定范围内，OAV越大，说明该物质对总体风味贡献越大。根据挥发性风味物质的OAV共筛选出13种关键挥发性风味物质(表 5)，整体上对羊肉总体风味贡献较大(OAV＞5)的主要为己醛、辛醛、壬醛、癸醛、1-辛烯-3-醇和2, 3-辛二酮。
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表 5 关键挥发性风味物质及对应OAV Table 5 Critical volatile flavor substances and theirs OAV |
电子鼻传感器能敏感获取羊肉的气味信息，较好反映出肉中总体挥发性风味物质[11]。马小明等[12]通过电子鼻检测了饲喂不同配方饲粮的滩羊肉风味，发现不同的饲料配方能影响滩羊肉的风味，且电子鼻能很好地区分。本试验结果显示，饲粮枣粉水平影响羊肉电子鼻响应值，W1C传感器对芳香类物质比较敏感，试验Ⅲ组羊肉的W1C响应值最高，说明枣粉水平为20%时，羊肉中的芳香类化合物比较丰富；W1W传感器对含硫有机物、萜烯类和吡嗪类物质敏感，这类物质气味阈值低，对肉香味的贡献很大，试验Ⅳ组的W1W响应值最高，说明添加25%的枣粉能有效提高羊肉中萜烯类和吡嗪类物质的含量，改善羊肉的香味；W2W传感器则对芳香族化合物、有机硫化物敏感，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组羊肉的W2W响应值高于其他组，说明在试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ组羊肉含有丰富的芳香族化合物以及有机硫化合物。本研究显示，饲粮中添加25%的枣粉时羊肉的挥发性风味物质含量较高，会使羊肉产生良好嗅感，但还需要结合固相微萃取-气相色谱-质谱(SPME-GC-MS)法针对单一挥发性风味物质进行分析。
3.2 枣粉对绒山羊肉挥发性风味物质的影响羊肉中醛类、醇类及酮类含量不同可能是造成羊肉风味有差异的原因[13]。醛类物质多由脂肪氧化产生，阈值较低，有强烈的果香、花香味，对肉香味的贡献很大[14]。试验结果显示，己醛在羊肉中的含量最高，其次为壬醛，己醛来源于亚油酸和花生四烯酸的氧化[15]，辛醛则由油酸氧化产生[16]，这两者在羊肉的风味中均是关键物质(OAV＞5)，在各试验组的趋势一致，均随饲粮枣粉水平的提高而减少，且在试验Ⅳ组含量最低；己醛有青草香味，但含量高时有酸败味、腥味，其在对照组含量最高(106.995 μg/kg)；壬醛在含量低时兼具脂肪味、花香和柑橘香味，饱和醛在肉中含量过高时会形成酸败味，对肉的香味不利[17]。本团队前期研究发现，饲粮中添加枣粉能显著提高绒山羊肌肉的抗氧化能力，并且在饲粮枣粉水平为20%时抗氧化酶活性达到最大[18]。本试验发现，饲粮枣粉水平为20%时，羊肉中的醛类含量最低，这可能是因为枣粉中含有大量的抗氧化物质(多酚、黄酮等)，绒山羊长期摄入能抑制脂质自由基的链式反应，并降低肌肉中的直链醛，从而达到抗氧化的效果[19]；随着饲粮枣粉水平的提高，直链醛含量稳定不变，说明添加20%枣粉时羊肉中的抗氧化成分达到了极值。肉中长链直链醛有癸醛(柑橘香和脂肪味)、十三醛(木香)和肉豆蔻醛(烧烤香)，在肉中的含量较少，对羊肉的整体风味起到修饰作用(OAV <1)[20]；羊肉中检测到的3-甲基丁醛为支链醛，阈值较低(0.3 μg/kg)，3-甲基丁醛源于支链氨基酸(如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)的降解，对羊肉的香味有一定贡献[21]，在饲粮枣粉水平为25%时含量最高(0.622 μg/kg)，其原因可能是枣粉能促进支链氨基酸在肉中的积累，从而引起3-甲基丁醛含量的增加。一般来说，醛的含量越高，代表其氧化程度越严重，对羊肉的香味越不利[22]，将醛类控制在适当范围内能改善羊肉的香味，因此20%和25%的枣粉水平能降低羊肉中醛类的含量，改善羊肉的香味。
醇类是脂肪酸在脂肪氧合酶和过氧化氢酶作用下生成或由羰基化合物还原生成的[23]。饱和醇的阈值比较高，对肉香味的贡献小，不饱和醇阈值低，对肉香味的贡献大[24]。本研究结果显示，羊肉正辛醇和正戊醇含量均随饲粮枣粉水平的提高而增加，这与醛类的研究结果相反。正辛醇有强烈的脂肪味和坚果香，阈值比较低(110 μg/kg)，在饲粮枣粉水平为25%时含量最高；正戊醇有果香和酒香，正己醇有花香和脂肪味，两者的阈值分别为4 000和2 500 μg/kg，对羊肉的气味有加和作用。不饱和醇中，1-辛烯-3-醇是亚油酸酯或亚麻酸酯的氢过氧化物的降解产物[25]，以饲粮枣粉水平为20%时含量最高，是关键挥发性风味物质(OAV＞5)，赋予羊肉浓郁的蘑菇香和玫瑰香气味；反-2-辛烯醇含量随饲粮枣粉水平的提高而增加，其风味特征为脂肪味和腥味[26]。本试验中，对照组中没有检测到苯甲醇和2, 4-二甲基环己醇，在丰富度上不及其他4组，说明枣粉有改善羊肉醇类风味的作用。
2, 3-辛二酮(OAV＞5)是脂质氧化的另一重要产物，在含量低时有果香，含量高时能促进腥味的形成[27]。试验Ⅳ组的2, 3-辛二酮含量最低，说明枣粉中的抗氧化成分能够抑制肉质氧化，从而将羊肉中的2, 3-辛二酮含量控制在较低的范围内，在对照组和试验I组中均没有检测到甲基庚烯酮(果香、霉香和酮香)，说明随着饲粮枣粉水平的提高，羊肉中的酮类种类增多，这有益于羊肉的风味。
烃类可能是来源于烷基自由基的脂质自氧化，能够赋予清香和甜香的气味，但由于其香味阈值高，需要在高含量下才能引起嗅觉反应，因此对羊肉嗅感的整体贡献不大[28]。随着饲粮枣粉水平的提高，羊肉中的烃类种类增多，整体上，对照组中烃类含量高，种类少，而在添加枣粉后，烃类种类增加，含量降低，能够对羊肉的香味起到改善作用[29]。羊肉中的酸类均为短链脂肪酸，部分酸类是由脂肪酸甘油酯和磷脂加热氧化或酶解产生的，其中己酸、4-甲基辛酸和4-甲基壬酸含量较高，是羊肉中主要的致膻物质[30]。本试验结果显示，随着饲粮枣粉水平的提高，羊肉中己酸、4-甲基辛酸和4-甲基壬酸含量逐渐降低，说明添加枣粉能够抑制羊肉膻味，这可能是因为枣粉中特殊的活性成分能够分解肉中的己酸、4-甲基辛酸和4-甲基壬酸，从而抑制羊肉的膻味，并在饲粮枣粉水平为20%时羊肉中的膻味物质较低。酯类能产生特定的香味，但在羊肉中的含量较低[31]，饲粮枣粉水平为20%的组羊肉中酯类含量较其他组高，能够对羊肉的香味起到积极作用。在其他类物质中，3-羟基-2-丁酮是一些风味的中间产物，有甜香、奶香和油腻脂肪香，在饲粮枣粉水平为25%时含量最高(0.266 μg/kg)；苯并噻唑是含氮含硫类化合物，其阈值比较低(80 μg/kg)，含量低有甜橙香、脂肪蜜香，对香味的贡献较大[32]。本试验结果显示，枣粉能增加上述这类物质的含量，丰富羊肉的香味。
4 结论电子鼻结果显示枣粉能提高白绒山羊肉的风味强度，通过GC-MS分析羊肉中挥发性风味物质，确定对羊肉风味贡献较大挥发性风味物质主要是己醛、辛醛、壬醛、癸醛、1-辛烯-3-醇和2, 3-辛二酮，醛类和酮类主要由脂质氧化产生，含量过高时不利于羊肉香味，枣粉能影响挥发性风味物质的含量和构成，并降低羊肉中醛类和酮类的含量，平衡羊肉风味。从整体上看，饲粮枣粉水平为20%时，羊肉中挥发性风味物质的种类较多，醛类和酮类含量低，香味最好。
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