2. 广东华威洋畜牧有限公司, 河源 517379
2. Guangdong Hua Wei Yang Livestock Co., Ltd., Heyuan 517379, China
反刍动物胃肠道存在丰富且多样的微生物菌群，并在维持消化系统的稳态和免疫系统的功能中起着至关重要的作用[1]。正常情况下，胃肠道中的微生物与宿主之间处于一种动态平衡状态，但饲粮营养水平改变较大时通常会影响胃肠道中的菌群结构，从而打破这种平衡[2]。研究发现，饲喂高精料水平饲粮会增加奶牛粪便中毛螺菌属和嗜麦芽寡养单胞菌属的相对丰度，降低赖氨酸芽孢杆菌属的相对丰度[3]。饲粮精料水平可影响反刍动物瘤胃和后肠道中挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)的组成和产量[4]，而VFA可为机体提供70%~80%的能量，因此精料补饲与反刍动物能量利用和生长性能密切相关[5]。雷州山羊是华南地区主要的地方优良山羊品种之一，但饲粮营养水平和饲喂模式多样，相关研究较少，使得生长性能得不到充分发挥，严重制约着其养殖效益。因此，迫切需要确定雷州山羊适宜的营养或补饲水平。
丙酸铬作为一种新型有机铬添加剂，其吸收效率要高于其他形式的有机铬，目前已被美国食品药品监督管理局认证为是可以在畜禽饲粮中添加的铬源[6]。在以往的研究中，铬对反刍动物采食量和生长性能影响的结果并不一致，部分研究报道，补充铬能增加反刍动物的干物质采食量和体重[7]；也有研究报告，铬对反刍动物的干物质采食量和体重没有影响[8-9]。胃肠道是反刍动物消化的主要场所，热应激时可对胃肠道健康产生严重的不利影响。研究表明，铬能有效缓解热应激，并影响反刍动物的胃肠道发酵参数和微生物多样性[10]。铬可通过促进胰岛素与细胞表面受体相结合来增强胰岛素的作用，而胰岛素与机体血糖平衡和糖脂代谢相关[11]，因此饲粮中精料水平，尤其能量水平，可能与铬含量存在互作效应。但是，目前关于饲粮精料水平和丙酸铬及其交互作用对雷州山羊生长性能影响和机制的相关研究报道较少。因此，本试验旨在研究饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊生长性能、粪便发酵参数和微生物区系的影响，以期保证在胃肠道健康的前提下，提高雷州山羊的生长性能，为生产实践提供理论指导和借鉴。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点试验于2019年8—9月在广东省华威洋畜牧有限公司进行。预试期7 d，正试期42 d。
1.2 试验设计选择32只健康的4~5月龄雷州山羊母羊，体重(16.63±0.24) kg，采用完全随机试验设计将羊只分为4组，每组8只羊。对照组(Ⅰ组)饲粮精料水平为200 g/(只·d)，精料添加组(Ⅱ组)在对照组饲粮精料水平基础上添加100 g/(只·d)精料，丙酸铬添加组(Ⅲ组)在对照组饲粮精料水平基础上添加2 mg/(只·d)丙酸铬(铬含量0.4%)，精料和丙酸铬添加组(Ⅳ组)在对照组饲粮精料水平基础上添加100 g/(只·d)精料和2 mg/(只·d)丙酸铬。饲喂方式为先精后粗，各组均自由采食粗饲料，每天07:00和15:00饲喂，充足饮水。丙酸铬采用逐级稀释法混入精饲料后进行饲喂。精料组成及营养水平见表 1。粗饲料(花生秧)营养成分含量为：干物质(DM)91.62%，粗蛋白质(CP)9.40%，中性洗涤纤维(NDF)44.16%，酸性洗涤纤维(ADF)38.54%，粗脂肪(EE)1.51%。
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表 1 精料组成及营养水平(风干基础) % Table 1 Composition and nutrient levels of the concentrate (air-dry basis) |
试验期每天记录每组山羊的精料和粗饲料饲喂量及剩料量，计算每组羊的干物质采食量，并于试验期最后3 d采集饲料样品，用于分析营养成分。饲料样品于65 ℃烘干后粉碎，参照《饲料分析及饲料质量检测技术》中的方法测定DM、CP、EE、NDF和ADF含量。正试期第1天和第42天晨饲前对所有羊只空腹称重，计算总增重和平均日增重。试验期间每天记录试验羊的健康情况。
1.3.2 粪便样品采集和发酵参数测定试验期第42天采食后3~4 h，每组选择5只羊，采用直肠取粪法收集粪便50 g左右，一部分粪便样品放入-20 ℃保存，用于测定氨态氮(NH3-N)和VFA含量；另一部分粪便样品放置于冰上，并迅速分装入2 mL冻存管中，投入液氮保存，用于测定微生物区系。粪便中NH3-N含量通过冯宗慈等[12]的方法测定，VFA含量采用气相色谱仪(Aglient 7890B，美国)测定[13]。
1.3.3 粪便微生物多样性检测对采集的所有粪便样品进行16S rRNA基因V3~V4区域高通量测序，分析微生物多样性。测序由自上海百趣生物医学科技有限公司完成。使用DNA强力提取试剂盒提取粪便微生物基因组DNA，根据保守区设计得到引物，上游：5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′；下游：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。PCR扩增步骤为：模板DNA经加热至98 ℃左右持续30 s，轮回10次循环，依次经过98 ℃×10 s、65 ℃×30 s、72 ℃×30 s，最后于72 ℃下延长7 min。通过对原始测序序列进行过滤、双端拼接，得到优化序列(Tags)；将优化序列进行聚类，划分操作分类单元(OTU)，并根据OTU的序列组成得到其物种分类；使用Qiime 2软件生成不同分类水平上的物种相对丰度表，用R软件绘制成样品各分类水平上的群落结构图。
1.4 统计分析采用Excel 2010软件对数据进行预处理，通过SPSS 20.0统计软件一般线性模型(GLM)程序进行双因素方差分析，用LSD法进行多重比较，数据用平均值和均值标准误(SEM)表示，P < 0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。
2 结果 2.1 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊生长性能的影响由表 2可知，饲粮添加精料显著提高了山羊的终末体重、精料干物质采食量、总增重和平均日增重(P < 0.05)，显著降低了粗饲料干物质采食量和总干物质采食量(P < 0.05)。饲粮添加丙酸铬及精料和丙酸铬的交互作用对山羊的终末体重、精料干物质采食量、粗饲料干物质采食量、总干物质采食量、总增重和平均日增重均无显著影响(P>0.05)。
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表 2 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary concentrate and chromium propionate levels on growth performance of Leizhou goats |
由表 3可知，饲粮添加精料显著提高了山羊粪便中乙酸、丙酸、异丁酸和总挥发性脂肪酸含量(P < 0.05)，显著降低了乙酸/丙酸(P < 0.05)，对NH3-N和丁酸含量无显著影响(P>0.05)。饲粮添加丙酸铬及精料和丙酸铬的交互作用对粪便发酵参数无显著影响(P>0.05)。
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表 3 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊粪便发酵参数的影响 Table 3 Effects of dietary concentrate and chromium propionate levels on fecal fermentation parameters of Leizhou goats |
如图 1所示，在97%的相似度水平上，4组共得到了987个OTU，4组间共有896个OTU，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的OTU数目分别为909、915、911和983个。
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图 1 雷州山羊粪便菌群Venn图 Fig. 1 Venn diagram of fecal flora of Leizhou goats |
由图 2可知，主成分1(PC1)、主成分2(PC2)是造成4组样本的2个最大差异特征，贡献率分别为21.05%和13.40%。饲喂相同饲粮的山羊粪便样点相对聚集，饲喂不同饲粮的山羊粪便样点相对分散。
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图 2 雷州山羊粪便菌群主成分分析图 Fig. 2 PCA diagram of fecal flora of Leizhou goats |
由表 4可知，饲粮添加精料显著提高了山羊粪便菌群的ACE指数、Chao指数、Shannon指数和覆盖率(P < 0.05)，显著降低了Simpson指数(P < 0.05)。饲粮添加丙酸铬及精料和丙酸铬的交互作用对粪便菌群α多样性指数无显著影响(P>0.05)。
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表 4 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊粪便菌群α多样性指数的影响 Table 4 Effects of dietary concentrate and chromium propionate levels on fecal flora α-diversity indexes of Leizhou goats |
由图 3和表 5可知，在门水平上，各组山羊粪便的优势菌门均为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和疣微菌门(Verrucomicrobia)，这3个菌门占总细菌比例的90%左右。饲粮添加精料显著提高了粪便中厚壁菌门相对丰度(P < 0.05)，显著降低了粪便中拟杆菌门和疣微菌门相对丰度(P < 0.05)。饲粮添加丙酸铬显著提高了粪便中放线菌门(Actinobacteria)相对丰度(P < 0.05)。
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Others：其他；Actinobacteria：放线菌门；Tenericutes：软壁菌门；Cyanobacteria：蓝藻菌门；Spirochaetes：螺旋菌门；Proteobacteria：变形菌门；Verrucomicrobia：疣微菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Firmicute：厚壁菌门。 图 3 雷州山羊粪便菌群门水平相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of fecal flora of Leizhou goats on phylum level |
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表 5 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊粪便菌群门水平相对丰度的影响 Table 5 Effects of dietary concentrate and chromium propionate levels on relative abundance of fecal flora of Leizhou goats on phylum level |
由图 4和表 6可知，在属水平上，各组山羊粪便的优势菌属均为瘤胃球菌科_UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)和艾克曼菌属(Akkermansia)。饲粮添加精料显著降低了粪便中艾克曼菌属和理研菌科_RC9_肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)相对丰度(P < 0.05)，显著提高了粪便中瘤胃球菌科_UCG-005(Ruminococcaceae_UCG-005)、瘤胃球菌科_UCG-010(Ruminococcaceae_UCG-010)、克里斯滕森菌科_R-7(Christensenellaceae_R-7_group)、普雷沃菌属_1(Prevotella_1)相对丰度(P < 0.05)。饲粮添加丙酸铬显著提高了粪便中拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度(P < 0.05)。
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Others：其他；Alistipes：另枝菌属；Prevotella_1：普雷沃菌属_1；Ruminococcaceae_UCG-013：瘤胃球菌科_UCG-013；Christensenellaceae_R-7：克里斯滕森菌科_R-7；Ruminococcaceae_UCG-010：瘤胃球菌科_UCG-010；Bacteroides：拟杆菌属；Rikenellaceae_RC9_gut：理研菌科_RC9_肠道群；Akkermansia：艾克曼菌属；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科_UCG-005。 图 4 雷州山羊粪便菌群属水平上相对丰度 Fig. 4 Relative abundance of fecal flora of Leizhou goats on genus level |
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表 6 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊粪便菌群属水平相对丰度的影响 Table 6 Effects of dietary concentrate and chromium propionate levels on relative abundance of fecal flora of Leizhou goats on genus level |
图 5展示了山羊粪便菌群属水平相对丰度(排名前20的菌属)与粪便发酵参数的相关分析。NH3-N含量与uncultured_bacterium_f_Muribaculaceae(P=0.021)和未分类O型拟杆菌属(uncultured_bacterium_o_Bacteroidales)(P=0.043)相对丰度呈显著负相关；乙酸含量与产粪甾醇菌属(Coprostanoligenes_group)(P=0.036)、索氏梭菌属(Paeniclostridium)(P=0.035)、瘤胃球菌科_UCG-005(P=0.037)、瘤胃球菌科_UCG-010(P=0.022)、克里斯滕森菌科_R-7(P=0.024)和瘤胃球菌科_UCG-013(P=0.013)相对丰度呈显著正相关，与艾克曼菌属(P=0.003)和理研菌科_RC9_肠道群(P=0.024)相对丰度呈显著负相关；丙酸含量与瘤胃球菌科_UCG-010(P=0.035)和产粪甾醇菌属(P=0.012)相对丰度呈显著正相关；异丁酸含量与瘤胃球菌科_UCG-010(P=0.024)和产粪甾醇菌属(P=0.043)相对丰度呈显著正相关；总挥发性脂肪酸含量与产粪甾醇菌属(P=0.013)、索氏梭菌属(P=0.028)、瘤胃球菌科_UCG-005(P=0.037)、瘤胃球菌科_UCG-010(P=0.012)、克里斯滕森菌科_R-7(P=0.027)和瘤胃球菌科_UCG-013(P=0.020)相对丰度呈显著正相关，与艾克曼菌属(P=0.003)、理研菌科_RC9_肠道群(P=0.027)和另枝菌属(P=0.044)相对丰度呈显著负相关。
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Akkermansia：艾克曼菌属；Alistipes：另支菌属；Bacteroides：拟杆菌属；Christensenellaceae_R-7：克里斯滕森菌科_R-7；Lachnospiraceae_NK4A136：毛螺菌科_NK4A136；Paeniclostridium：索氏梭菌属；Rikenellaceae_RC9_gut_group；理研菌科_RC9_肠道群；Romboutsia：罗姆布茨菌属；Ruminococcaceae_NK4A214：瘤胃球菌科_NK4A214；Ruminococcaceae_UCG-002：瘤胃球菌科_UCG-002；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃球菌科_UCG-005；Ruminococcaceae_UCG-010：瘤胃球菌科_UCG-010；Ruminococcaceae_UCG-013：瘤胃球菌科_UCG-013；Ruminococcus_1：瘤胃球菌属_1；Coprostanoligenes_group：产粪甾醇菌属；uncultured_bacterium_f_F082：未分类的f_F082杆菌属；uncultured_bacterium_f_Ruminococcaceae：未分类f型瘤胃球菌科；uncultured_bacterium_o_Bacteroidales：未分类O型拟杆菌属；NH3-N：氨态氮；Acetate：乙酸；Propionate：丙酸；Isobutyrate：异丁酸；Butyrate：丁酸；TVFA：总挥发性脂肪酸。 *表示P＜0.05，红色表示正相关，蓝色表示负相关。 * mean P < 0.05, red mean positive correlation, blue mean negative correlation. 图 5 雷州山羊粪便菌群属水平相对丰度对丰度与粪便发酵参数的相关分析 Fig. 5 Correlation analysis between relative abundance of fecal flora on genus level and fecal fermentation parameters of Leizhou goats |
生长速度是体现动物饲养水平的主要指标，幼龄雷州山羊瘤胃发育不完全，对于粗饲料的利用能力较差，所以适当的提高精料水平有利于充分发挥其生长潜力。本试验中，饲粮添加精料显著提高了雷州山羊的平均日增重和总增重，可见补饲精料会使饲粮养分摄入水平和平均日增重提高，这与刘嘉等[14]研究结果相似。饲粮中添加丙酸铬未显著影响雷州山羊的干物质采食量和总增重，表明饲粮丙酸铬水平对雷州山羊生长性能影响较小，Kumar等[15]研究也发现，补饲无机铬对水牛犊的养分消化率和生长性能没有显著影响。
3.2 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊粪便发酵参数的影响NH3-N和VFA是评价反刍动物胃肠道发酵参数的主要指标，间接反映了其内环境状况和健康水平。NH3-N是饲料蛋白质、肽、氨基酸及其他含氮化合物在胃肠道内分解的终产物，是微生物合成菌体蛋白的主要原料。研究表明，NH3-N含量主要受饲粮蛋白质水平、饲粮来源和精粗比等的影响，当增加饲粮精料比时，胃肠道内降解蛋白质含量增加，NH3-N含量也随之增加[16]。本试验中，各组山羊粪便NH3-N含量无显著差异，但添加精料后粪便NH3-N浓度呈增加趋势，表明饲粮精料水平可以影响后肠道中氮代谢。胡丹丹[17]研究表明，高精料组和低精料组奶牛瘤胃中NH3-N浓度无显著差异，但随着饲粮中精料水平的增加，NH3-N含量呈现增加趋势，与本试验结果相似。
VFA是反刍动物能量利用过程中重要的中间产物，主要受饲粮组成的影响，随着饲粮精料水平的増加，提高了过瘤胃淀粉比例，未被小肠消化吸收完全的淀粉则可以达到后肠道，改变后肠道中VFA比例和含量[18]。本试验中，饲粮添加精料显著提高了雷州山羊粪便中乙酸、丙酸、异丁酸和总挥发性脂肪酸含量，并显著降低了乙酸/丙酸，表明饲粮精料水平可影响反刍动物后肠道碳水化合物的发酵产物和微生物区系，进一步影响后肠道健康。Li等[19]和Ye等[20]研究也发现，饲粮添加精料会增加奶牛和山羊后肠道丙酸、丁酸及总挥发性脂肪酸含量。本试验中，饲粮添加丙酸铬对雷州山羊粪便发酵参数没有显著影响。Besong等[21]研究也发现，在肉牛饲粮中补充铬对其瘤胃液中各发酵参数没有显著影响，表明饲粮铬含量对于胃肠道发酵参数影响较小。
3.3 饲粮精料和丙酸铬水平对雷州山羊粪便微生物区系的影响本试验中，各组覆盖度均高于99%，说明测序样品取样充分。因此，本次测序结果能真实地反映雷州山羊粪便细菌群落种类和结构。粪便样品的α多样性分析可反映微生物群落的丰富度和多样性。Ace指数和Chao指数越大，群落丰富度越高；Shannon指数越大，群落多样性越高；Simpson指数越小，群落多样性越高[22]。本试验中，饲粮添加精料提高了雷州山羊粪便菌群的多样性和丰富度，而饲粮添加丙酸铬及精料和丙酸铬的互作对雷州山羊粪便菌群没有显著影响，表明提高饲粮中精料水平可以促进后肠道菌群生长，增加肠道菌群的多样性。
本研究发现，雷州山羊粪便菌群在门水平上以拟杆菌门和厚壁菌门为主要优势菌，占总菌的90%以上，这与过去关于反刍动物粪便微生物的研究结果[23]一致。厚壁菌门与碳水化合物和蛋白质的吸收有关，而拟杆菌门在非纤维物质的降解中发挥重要作用[24]。本试验中，饲粮添加精料对粪便的优势菌门种类没有影响，但提高了厚壁菌门的相对丰度，降低了拟杆菌属的相对丰度。Ley等[25]研究表明，与瘦小鼠相比较，肥胖小鼠肠道中拟杆菌门的数量有所减少，而厚壁菌门的数量增多，表明饲粮碳水化合物水平会影响后肠菌群的相对丰度。疣微菌门具有诱导和调节免疫的能力，肠道微生物可能通过干预它来达到调节免疫的目标[26]。本试验中，饲粮添加精料显著降低了疣微菌门的相对丰度，表明高精料饲喂可能会降低雷州山羊的后肠道免疫性能。放线菌能产生大量的、种类繁多的抗生素，可以消灭致病菌群，进而保护宿主，部分放线菌还可以产生蛋白酶等多种酶，帮助宿主消化分解饲粮[27]。本试验中，饲粮添加丙酸铬提高了粪便中放线菌门的相对丰度，表明丙酸铬可能会抑制肠道中致病菌的繁殖，促进营养物质的消化，进一步影响生长性能。
在属水平上，各组优势菌属为瘤胃球菌科_UCG-005和艾克曼菌属。研究表明，艾克曼菌属定居在肠道的黏膜层，与增加黏液厚度和增强肠道屏障功能方面有关，艾克曼菌属数量的增加有助于炎症性肠病症状的缓解[28]。在本试验中，饲粮添加精料降低了雷州山羊粪便中的艾克曼菌属相对丰度，表明增加精料在提高雷州山羊生长性能的同时可能会引起后肠道的黏膜炎症。Liu等[29]研究表明，高谷物饲粮导致山羊盲肠内容物和盲肠黏膜相关微生物群相对丰度的变化，并且造成了局部炎症。最近的一项研究表明，随着腹泻的严重程度增加，麝鹿粪便中理研菌科_RC9_肠道群的相对丰度显著降低[30]。在本试验中，饲粮添加精料使雷州山羊肠道内的理研菌科_RC9_肠道群下降，表明饲粮添加精料可能会引发腹泻。王梦雅等[31]研究表明，饲粮高精料水平在提高奶牛生长性能的同时会使粪便结构松软，出现泡沫状粪便或腹泻。
瘤胃菌科是厚壁菌门中一种革兰氏阴性菌，可通过产生的纤维素酶和半纤维素酶分解瘤胃内粗纤维产生乙酸[22]，其相对丰度与宿主的饲料利用率(如蛋白质水解、淀粉消化吸收)和挥发性脂肪酸的代谢呈正相关[32]。本试验中，饲粮添加精料提高了粪便中瘤胃球菌科_UCG-005属和瘤胃球菌科_UCG-010的相对丰度，从相关分析表明，瘤胃球属与乙酸和总挥发性脂肪酸含量呈显著正相关，也说明了瘤胃菌科参与VFA代谢。普雷沃氏菌是蛋白质降解菌的一种，对于蛋白质的降解发挥着积极的作用，瘤胃内较高的普雷沃氏菌相对丰度可提高蛋白质的降解利用水平[33]。本试验中，饲粮添加精料提高了粪便中普雷沃氏菌相对丰度，所以普雷沃氏菌在粪便微生物中的群落分布理论上与饲粮蛋白质水平呈正相关。王尧悦等[34]研究表明，随着饲粮蛋白质水平的提高，滩羊瘤胃属水平上的普雷沃氏菌属的数量呈线性增长的趋势。拟杆菌属产生的纤维素酶可分解纤维素并使动物能够更好地吸收[35]。本试验中，饲粮添加丙酸铬提高了粪便中拟杆菌属相对丰度，表明添加丙酸铬显著提高了粪便纤维降解菌的相对丰度，提高了肠道对纤维素的降解率。
4 结论① 饲粮添加精料可提高雷州山羊的平均日增重和总增重，改善粪便发酵参数，提高粪便微生物的丰富度，但存在降低后肠道免疫性能和引发炎症的风险。
② 饲粮添加丙酸铬可提高粪便中纤维降解菌和放线菌的相对丰度，抑制肠道中致病菌的繁殖。
③ 精料和丙酸铬的交互作用较小。
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