2. 塔里木大学, 新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室, 阿拉尔 843300
2. Tarim Key Laboratory of Animal Husbandry Science and Technology, Xinjiang Production and Construction Corps, Tarim University, Alar 843300, China
马属动物主要是指马、驴和骡等单胃食草动物,该类动物有强大的后肠微生物发酵系统,包括盲肠和结肠,特别是盲肠微生物发酵占主导地位,与反刍动物瘤胃同被称为微生物菌群“发酵罐”,为马属动物消化和水解纤维提供场所[1]。马属动物盲肠微生物发酵与反刍动物瘤胃微生物发酵具有相似的功能,有提高动物免疫力、促进营养物质消化吸收和增加肠道保护屏障等作用[2]。反刍动物瘤胃研究方法同样适合研究马属动物盲肠,但马属动物盲肠微生物活力比反刍动物瘤胃微生物活力差,消化饲粮中植物纤维能力比反刍动物弱[3]。饲粮中较高的纤维和淀粉含量会使马属动物肠道消化率下降,使盲肠内环境微生物失衡,导致有害菌群数量增加,进而引发肠道疾病甚至死亡[4]。国内关于反刍动物瘤胃微生物研究较为广泛,但有关马属动物盲肠微生物的研究可查文献有限。了解马属动物盲肠微生物菌群与发酵参数相互作用、主要降解功能菌群种类及肠道疾病等,对科学饲养马属动物及预防肠道疾病具有深远的意义。
1 马属动物盲肠微生物菌群作用动物肠道微生物菌群已成为许多学者研究的热点,并证明和动物健康有密切关系。而马属动物盲肠功能强大,其微生物菌群对植物纤维(纤维素、半纤维素、淀粉和果胶等)的消化利用至关重要。一方面盲肠微生物可将植物纤维发酵成短链脂肪酸(SCFA)又叫挥发性脂肪酸(VFA)而被肠道吸收,主要是乙酸、丁酸和丙酸等,为马属动物提供60%~70%的能量[5];另一方面盲肠黏膜上皮与有益微生物菌群发生特异性受体结合,形成保护马属动物肠道的天然生物屏障,减少有害病菌微生物的入侵[6];另外马属动物盲肠又名“水肠”,盲肠内环境发酵液的pH为6~7,呈弱酸性,为微生物繁殖提供有利条件,同时微生物发酵产生的VFA也使盲肠内环境维持在平衡状态[1]。简而言之,盲肠微生物通过独特而复杂结构降解植物纤维为宿主提供能量、调节盲肠内环境平衡、增加肠道免疫保护屏障的作用,从而到达互利共生关系。
2 马属动物盲肠微生物菌群组成及功能微生物菌群是马属动物盲肠消化功能的基础,盲肠内环境严格厌氧,pH接近中性,饲粮在前肠消化约3 h后到达盲肠,在盲肠流通速度缓慢,滞留时间平均为35 h,这为微生物提供了有利的发酵环境[7]。马属动物盲肠微生物菌群主要由细菌、真菌、原生动物和古生菌等组成,盲肠中总厌氧菌数量在107~1011 CFU/mL,其中38%~80%的细菌菌群对氧极为敏感,数量在107~109 CFU/mL,真菌游动孢子的数量在1.3×102~5.3×102 CFU/mL,原生动物的数量在103~105个/mL,古细菌数量在104~106个/g[8-13]。这表明马属动物盲肠中栖息着数量巨大、种类繁多且严格厌氧的微生物菌群。然而大部分学者对马属动物肠道微生物的研究集中在粪便,但许多研究已证实马属动物粪便微生物菌群仅代表远端结肠,并不能反映盲肠微生物结构[14]。因此,目前关于粪便微生物菌群的代表性是存在着争议的。国内对马属动物肠道微生物菌群的研究报道引起相关学者的重视[15-21]。但有关盲肠微生物菌群的信息相对匮乏,特别是盲肠微生物菌群结构及功能方面还有待进一步深入探究。
2.1 细菌种类及功能在马属动物后肠中,盲肠是厌氧细菌在植物壁上定居的主要位点,通过显微镜观察和革兰氏染色,发现了革兰氏阴性杆菌(12%~31%)、革兰氏阳性杆菌(5%~22%)、革兰氏阴性球菌(4%)和革兰氏阳性球菌(2%~12%)[22-24]。利用分子特异性杂交确定属水平有:丁酸弧菌(Butyrivibrio)、梭状芽孢杆菌(Clostridium)、真细菌(Eubacterium)、纤维杆菌(Fibrobacter)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、巨球型菌(Megasphaera)、光冈菌(Mitsuokella)、瘤胃球菌(Ruminococcus)[白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)和黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)]、链球菌(Streptococcus)和韦荣氏球菌(Veillonella)等[8, 25-26]。利用分子生物学技术鉴定出主要降解功能的细菌,如糖酵解细菌(108个/mL)、淀粉降解细菌(108个/mL)、乳酸降解细菌(105~108个/mL)、纤维素降解细菌(104~107个/mL)、半纤维素降解细菌(107~108个/mL)、果胶降解细菌(107~108个/mL)、蛋白质降解细菌(108个/mL)[27-28]。Julliand等[29-30]报道马盲肠微生物菌群中厌氧细菌数量为2.1×106~15.9×106 CFU/mL,其中,纤维素降解细菌数量为1.3×106~13.5×106 CFU/mL,蛋白降解细菌数量为0.2×106~6.0×106 CFU/mL,其平均值分别为4.6×106~9.4×106 CFU/mL和0.3×106~1.0×106 CFU/mL,所占百分比例分别为78%和22%。Santos等[31-32]在研究马盲肠纤维素降解细菌代谢的产物组成时发现,纤维素降解细菌主要由特定的瘤胃球菌菌株组成,并产生大量异脂肪酸,黄色瘤胃球菌产生奇数链异脂肪酸,白色瘤胃球菌产生偶数链异脂肪酸,其产生的异脂肪酸组成VFA可为宿主提供能量,此外纤维素降解细菌相对于蛋白降解细菌相对丰度占主导地位。
Su等[33]研究蒙古马不同肠道之间细菌的组成发现,纤维杆菌是盲肠纤维降解的主要菌属,盲肠细菌以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)占主导地位,其比例有利于能量的吸收和促进脂肪积累,还表明微生物菌群的动态变化与肥胖密切相关,同时比例影响着肠道代谢能力。Liu等[34]研究德州毛驴消化道微生物菌群多样性发现盲肠和结肠以厚壁菌门和拟杆菌门为主,属水平上以链球菌为主,并表明后肠微生物在氨基酸代谢方面比较活跃。刘宇等[20]利用高通量测序分析德州驴盲肠菌群分布特点,发现相对丰度占优势的细菌门水平有厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌门(Verrucomicrobia)和螺旋体门(Spirochaetes)等,还表明驴盲肠微生物菌群参与多种代谢活动,其中以碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢的菌群丰度相对较高。Reed等[35]通过高通量测序技术扩增样本细菌16S rRNA的V4区,证实了盲肠、结肠和粪便样本的细菌微生物菌群相似性较高,还观察到不同微生物菌群结构与骨盆弯曲区有关。综上所述,大部分报道马属动物盲肠微生物菌群的研究主要集中在细菌方面,并且被认为细菌是维持马属动物盲肠内环境稳态最重要的因素,同时也认为在饲粮的降解过程中细菌降解占主导地位。
2.2 真菌种类及功能厌氧真菌属于新壶菌门,由6个属水平组成,通过传统的显微镜观察法对马属动物后肠真菌进行研究,如菌体根状形态(单中心和多中心)、游动孢子鞭毛(单鞭毛和多鞭毛)、分离培养法和形态学分类法等[36]。Julliand等[37]从小马和驴的盲肠与绵羊和奶牛瘤胃分离梨囊鞭菌(Piromyces)对纤维素的降解和代谢的效果进行比较,发现盲肠真菌与瘤胃真菌之间存在差异,其中驴盲肠降解纤维素的速度最快,马盲肠其次,瘤胃最慢,瘤胃主要生产甲酸、乙酸、乳酸和乙醇,马盲肠只生产甲酸、乙酸和乙醇。分子生物学技术已经广泛应用于马粪便研究,但很少应用于马后肠真菌。Dougal等[14]通过定量PCR技术扩增真菌5.8S rRNA基因发现小马盲肠、结肠和马粪便样品中均检测到厌氧真菌,还发现不同肠道区域厌氧真菌和动物之间无显著差异。Mura等[38]采用克隆文库的方法研究马后肠厌氧真菌的多样性,研究显示,在647个ITS1序列克隆体中,发现61.7%是未注释的真菌属水平,另外的38.0%真菌菌群包括35.1%新美鞭菌属(Neocallimastix)、2.3%根囊鞭菌属(Orpinomyces)和0.6%厌氧鞭菌属(Anaeromyces),说明马后肠主要由新颖的、尚未培养的厌氧真菌占据。邪振存[15]通过变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)技术,同样证明马属动物肠道真菌微生物大部分是未知厌氧真菌,还发现厌氧真菌在马后肠数量很低,并表明厌氧真菌有可能在饲粮纤维降解过程中发挥重要作用。国内外厌氧真菌在反刍动物肠道已被大量研究,关于马属动物肠道真菌的文献报道有限,其消化机制和其他微生物关系尚不清楚。
2.3 原生动物原生动物又叫原虫,在马属动物消化系统中仅出现在盲肠和结肠区域,到目前为止,大约鉴定出30类属水平的50种纤毛虫,其纲主要包括根足亚纲(Rhizopoda)、鞭毛纲(Mastigophora)和纤毛纲(Ciliata)等,以纤毛纲在丰度和种类上占主导地位,体外培养发现马属动物盲肠纤毛虫作用是通过迅速定植植物组织而摄取叶绿体,部分纤毛虫还可以降解纤维素、半纤维素和果胶,并能够吞噬淀粉颗粒以防止淀粉迅速发酵[39-40]。然而,一些学者认为原虫在马属动物盲肠降解纤维过程中作用很小,赵红艳[19]研究饲粮对驴盲肠微生物影响时,发现纤毛虫对纤维降解作用最小。Moore等[41]也通过将原生生物从马后肠中驱除,发现驱虫对纤维素降解细菌和真菌总数量没有造成影响,只有总营养物质消化率和干物质消化率略有下降,表明原生动物似乎在马后肠饲粮降解过程中不起重要作用。以上研究说明原生动物在纤维的降解过程中可能不会发挥重要作用,为了更好地确定原生动物在马属动物消化过程中的重要性,还需要进行进一步的研究。
2.4 古细菌古细菌又叫古菌和古生菌,约占微生物菌群总数的3.5%,马属动物盲肠中代表性古细菌是产甲烷菌,其作用是利用二氧化碳(CO2)使氢气(H2)氧化,生成甲烷和释放能量,以促进细菌发酵繁殖,同时增强盲肠纤维素降解菌的活性以促进碳水化合物降解[42-44]。Fernandes等[45]分析了马粪便的古细菌菌群,表明古细菌菌群结构在饲喂饲粮前后保持不变,并检测出甲烷粒菌(Methanocorpusculum labreanum)和瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)为优势菌群。Fliegerova等[46]通过DGGE指纹图谱技术研究马肠道不同解剖区域(包括盲肠)样本中细菌和古细菌的多样性,发现DGGE条带与未培养细菌和产甲烷菌有关,盲肠和粪便古生菌条带Methanocorpusculum sp.有关,并表明细菌的多样性高于古细菌,部分产甲烷菌多样性占优势。对于马肠道古细菌的文献报道在可查找范围内,分类鉴定都是基于粪便古细菌研究,而盲肠古细菌研究报道较少。
3 影响马属动物盲肠微生物及微生态发酵参数的因素马属动物盲肠微生物群是一个复杂多样的微生态系统,对内环境依赖变化非常敏感,其内环境的破坏可引起胃肠道疾病发生,如酸中毒、绞痛和结肠炎等,影响马属动物盲肠微生物菌群的因素,主要包括饲粮组成、环境条件、年龄、炎症和自身遗传背景等,另外添加益生元、益生菌和抗生素也可导致盲肠微生物发生变化,对于患有肠道疾病的马属动物来说,微生态失调可能引起马属动物盲肠致病菌的过度生长、细菌毒素的产生、黏膜炎症、胆汁酸代谢和发酵参数的改变[47]。
发酵参数是反映微生物菌群在发酵过程中生理生化代谢变化底物的检测数值。一方面当盲肠的pH约为6.0时,是厌氧细菌、真菌和原生动物降解纤维素、半纤维素和果胶的理想条件,当pH低于6.0时,纤维发酵微生物,如白色瘤胃球菌和琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)的生长受到抑制,而嗜酸菌,如链球菌和乳酸杆菌数量增加,引起pH进一步降低[48-50];另一方面产乙酸细菌和产甲烷古菌对pH的变化非常敏感,pH的增加导致产生更高的脂肪酸和氨根离子(NH4+),而氨的存在会引起VFA的积累,反过来又导致pH和脂肪酸含量的下降,此外过量的氨会引起氨中毒[51];最后螺旋菌科(Spirochaetaceae)的细菌被报道为乙酸生产者,乙酸是宿主生理运动的直接能量来源,同时有助于脂肪的形成,如乳脂的合成,丙酸被用于糖异生,丁酸被肠上皮细胞利用并转化为聚β-羟基丁酸(PHB)[52-54]。因此,pH、乳酸[55]、氨态氮(NH3-N)和VFA的含量在一定程度上反映马属动物盲肠微生物菌群活动状况和盲肠环境的变化,其数值可以作为发酵模式中微生物活性和底物消化率的指标,对盲肠微生物起着监视的作用。了解微生态指示发酵参数和马属动物盲肠微生物相互关系至关重要。
3.1 饲粮对马属动物盲肠微生物菌群及内环境发酵参数影响马属动物通过摄食饲粮获取能量完成各项生理活动,而饲粮的变化是影响马属动物盲肠微生物菌群及其发酵参数最主要因素。淀粉到达后肠时,增加结肠中总厌氧细菌、链球菌和乳酸降解细菌的数量,但对盲肠微生物数量影响不大[56]。其他报道则认为淀粉摄食增加了盲肠中的微生物菌群数量,而链球菌将过量淀粉转化为乳酸,导致pH下降[4]。因此,富含淀粉的饲粮可增加马属动物肠道患病机率。饲粮影响因素主要包括组成、加工方法、投喂顺序、投喂频率、食糜的通过率等,其中以饲粮组成对马属动物盲肠微生物菌群及内环境发酵参数影响最大[57]。了解饲粮如何影响马属动物盲肠微生物菌群及微生态发酵参数具有重要意义。
3.1.1 饲粮组成对盲肠内环境发酵参数及微生物菌群影响马属动物盲肠微生物菌群生长和植物纤维降解依赖于能量和有效氮的利用率,而有效氮是由到达盲肠的饲粮蛋白质、非蛋白氮(NPN)和内源性蛋白质提供,并被降解为氨基酸、多肽和氨[31]。如Santos等[58]研究了不同氮源(酪蛋白、尿素)和碳水化合物混合物(葡萄糖、木糖和淀粉)对马盲肠内容物体外发酵参数的影响,通过体外产气法对盲肠内容物进行以下处理:碳水化合物、25 mg酪蛋白、25 mg尿素、碳水化合物+25 mg酪蛋白、碳水化合物+25 mg尿素、无底物,培养24 h后,发现氮和碳水化合物共同处理后的发酵效果较好,其中添加尿素的盲肠微生物数量、VFA含量和产气量显著增加,说明该菌群主要利用非蛋白氮生长。Halpin等[59]从4匹马获得的盲肠内容物用于体外发酵,以草原干草为底物,添加酪蛋白、鱼粉、豆粕、乳清、血浆和赖氨酸,为发酵底物提供2%的外源蛋白质,培养48 h后评估不同蛋白质来源对盲肠培养物中草原干草发酵的影响,与对照相比,所有蛋白质来源均导致pH降低,而干物质体外消化率(IVDMD)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量增加,其中酪蛋白、赖氨酸和乳清引起的影响最大,可以增加丙酸和丁酸含量,降低乙酸与丙酸的比例,VFA含量随着赖氨酸、乳清、酪蛋白、豆粕和鱼粉含量的增加而增加,产气量随着酪蛋白含量的增加而增加,表明补充蛋白质可以影响盲肠微生物培养的草原干草的发酵参数,影响最显著的是可溶性酪蛋白、乳清和赖氨酸含量。
饲粮经盲肠发酵所产生的VFA是马属动物主要能量来源,而葡萄糖和VFA含量随着饲粮精料比例的增加而增加,Vermorel等[60]报道不同牧草单独饲喂或与浓缩颗粒饲料(大麦、玉米、配合饲料和脱水甜菜粕)联合饲喂对运动马肠道消化率和能量利用状况研究,发现干草有机物消化率为45.0%~59.0%,混合饲粮的有机物消化率为61.5%~75.3%,甲烷产量平均分别占能量摄入(EI)和消化能(DE)的2.0%和3.5%,代谢能(ME)在DE的84.6%~90.5%,VFA和葡萄糖分别提供了马吸收能量的65%~78%和11%~14%。Sorensen等[61]研究不同类型干草(苜蓿或雀麦草)对成年马盲肠和粪便微生物菌群的影响,发现无论干草类型如何,马粪便pH大于盲肠,盲肠VFA含量均高于粪便,盲肠中拟杆菌门和普氏菌属(Prevotella)数量比粪便多,而瘤胃球菌数量不受干草类型的影响,每个采样点和干草类型的微生物菌群结构各不相同,表明粪便微生物菌群不能代表盲肠微生物菌群结构,且发酵参数和细菌数量受干草类型和取样位置的影响。Ade等[9]利用2种不同的饲粮D1(富含纤维秸秆)和D2(富含谷类干草)对马肠道微生物菌群和发酵参数的影响,研究发现喂食2种饲粮均影响马不同肠道微生物菌群数量和丰度,前肠微生物菌群浓度低于后肠,肠道pH均在6.1~6.6,盲肠和结肠总乳酸含量范围为0.2~0.9 mmol/L,D1组的乳酸含量高于D2组,在整个消化道中2种饲粮VFA含量在马后肠最高,D2组的VFA含量高于D1组,另外盲肠中丙酸和丁酸含量较高,表明不同肠道部位的微生物菌群种类和丰度存在显著差异。Grimm等[62]通过饲喂高纤维(100%干草)和高淀粉(57%干草+43%大麦)2种等能饲粮研究马盲肠、结肠和粪便微生物菌群在高纤维饲粮类型向高淀粉饲粮类型转变期间的变化,研究表明,干草+大麦饲粮会影响盲肠和结肠细菌组成(淀粉降解细菌和乳酸降解细菌数量的增加以及纤维降解菌数量的降低)和微生物代谢活性(VFA含量的变化和乳酸含量的增加),并提高粪便中脂多糖的含量,盲肠和粪便之间以及结肠和粪便之间的纤维素降解细菌、淀粉降解细菌和乳酸降解细菌数量显著相关,盲肠中的戊酸和丙酸的含量与粪便中的含量显著相关,表明粪便样本及其细菌分析可在饲粮类型转变时,作为诊断盲肠和结肠微生物紊乱的标记。
Hansen等[63]以干草(低营养饲粮)或干草和全燕麦的混合物(高营养饲粮)作为试验饲粮,探讨2种饲粮对马盲肠微生物菌群稳定性、多样性和功能性的影响,研究显示试验中的2种饲粮对盲肠发酵参数和细菌微生物菌群具有显著影响,低营养饲粮更利于盲肠微生物群的多样性和稳定性,这与微生物多样性具有稳定作用有关,而高营养则会改变盲肠微生物群的组成。Bergman[53]报道饲喂全粗饲粮的马后肠中VFA的摩尔百分比为75%乙酸、15%丙酸和10%丁酸,并报道乙酸、丙酸和丁酸含量会因饲粮类型的改变而不同,富含纤维的饲粮往往会增加乙酸含量,而富含非结构性碳水化合物(单糖)或淀粉的饲粮则会增加丙酸的生成。综上所述,马属动物盲肠微生物菌群因摄食饲粮的组成不同,进而影响盲肠微生物组成,饲喂含高淀粉和高浓缩精料的饲粮在盲肠发酵能导致微生物活性和发酵参数发生变化。
3.1.2 食糜的通过率对盲肠微生物菌群及内环境发酵参数影响饲粮到达马属动物盲肠的速度取决于前肠消化率,食糜在盲肠中的滞留时间会对消化率、微生物活性和水分吸收产生影响,而消化率又与通过率有关,体重、怀孕和哺乳期都会影响食糜通过率,另外小颗粒和高水分饲粮通过肠道的速率较慢,此外提高饲粮投喂频率可能会加快食糜通过率[7]。Earing[64]研究以苜蓿基础饲粮比较断奶马和成年马(试验1)、1岁马和成年马(试验2)的体内消化率和食糜通过率,发现在试验1中消化率和食糜平均滞留时间(MRT)无年龄差异,表明断奶马能够像成熟马一样有效地消化相对高质量的饲料,在试验2中1岁马的消化率大于成年马,表明1岁马消化能力的提高可能是由于MRT较长。以上都是基于马粪便上研究,对马属动物盲肠微生物菌群的影响研究尚未报道。
3.1.3 饲粮投喂顺序、投喂频率和加工方法对盲肠微生物菌群及内环境发酵参数影响大量饲粮精料可以满足马运动能量需求,但可能会导致盲肠微生物菌群及发酵参数失调,从而增加马肠道疾病的风险,为了消除这种潜在的负面影响,改变饲粮精料和干草的投喂顺序是一种有效方法,Sadet-Bourgeteau等[65]通过在晨饲时先饲喂精料、后饲喂精料以及同时饲喂精料和干草,研究精料投喂顺序对盲肠、结肠内容物和粪便的发酵参数和饲后变化的影响,发现精料投喂顺序与盲肠pH和粪便丙酸盐含量的变化显著相关,同时投喂精粗料可以显著降低盲肠、结肠和粪便中的pH,显著提高粪便中的VFA含量,因此,干草和精料可以同时投喂马匹。而另一种有效方法是调整饲粮的投喂频率。Venable等[66]通过调整饲粮的投喂频率和投喂量,研究其对马盲肠微生物菌群的影响,试验分为A组:投喂1餐(2.72 kg/餐),B组:投喂2餐(1.36 kg/餐),C组:投喂3餐(0.91 kg/餐),发现A组的微生物菌群丰度与C组相比差异显著,C组的YRC22相对丰度最高,而普雷沃氏菌(Prevotella)、乳酸菌、链球菌、粪球菌(Coprococcus)和Phascolarctobacterium的相对丰度最低,表明投喂频率会影响盲肠微生物菌群的丰度和结构组成。因此,有必要进行进一步研究饲粮投喂频率和投喂量,以了解马盲肠微生物菌群变化相关的代谢和健康影响。Thorringer等[67]使用干草和加工谷物配制饲粮:微粉大麦(MB)、烘烤大麦(TB)、微粉玉米(MM)和烘烤玉米(TM),探讨不同加工方法(烘烤和微粉)对马盲肠淀粉消化代谢的影响,研究发现,与MB、TB和TM相比MM干物质消失率和淀粉消失率最高,大麦的血浆葡萄糖含量峰值出现的比玉米早,饲喂后总VFA含量增加,其中大麦的总VFA含量高于玉米,表明微粉化更能有效提高盲肠淀粉消化率,因此,大麦和玉米的优选加工方法都是微粉化。为了探讨马属动物对饲粮营养物质充分的利用,合理选择饲粮投喂顺序、投喂频率和加工方法对维持马属动物盲肠稳态极其重要。
3.2 环境条件和年龄对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数的影响周围环境条件对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数的影响因素较多,如季节、禁食和运动等。肠道微生物种群的变化与季节性变化相一致,Koike等[68]报道在夏季和冬季对马粪便微生物菌群数量进行了评估,研究发现冬季粪样中细菌总数有所减少,冬季粪样中的革兰氏阴性球菌、革兰氏阳性杆菌和革兰氏阳性球菌的数量及比例低于夏季,表明夏季的细菌丰度比冬季高。Kobayashi等[69]同样比较马粪便微生物与发酵参数随季节变化,研究显示粪便细菌丰度出现季节性差异,其中以夏季细菌丰度最高,而冬季以革兰氏阴性菌丰度最高,原虫丰度和VFA含量也在夏季高于冬季,另外冬季粪便VFA中的乙酸含量增加,丙酸含量减少。因此,季节会影响马体内肠道微生物丰度。Schoster等[70]研究禁食、运输和麻醉对健康成年马粪便微生物菌群的影响,发现在禁食、运输和麻醉后,粪便微生物菌群相对丰度发生明显变化。Górniak等[71]探讨剧烈运动对纯种赛马粪便厚壁菌门和拟杆菌门数量的影响,研究发现剧烈运动后马粪便厚壁菌门和拟杆菌门数量均有显著提高,而乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)数量在运动后有下降的趋势。Morrison等[72]以干草为基础饲粮向高淀粉饲粮过渡时,研究年龄对小马粪便菌群的影响,利用16S rRNA扩增V1~V2高变区测序确定细菌群落,研究显示年龄对细菌影响很小,饲粮的转变增加了厚壁菌门的丰度,降低了纤维杆菌门的丰度,此外还改变了粪便pH和VFA含量。上述研究都是基于马属动物粪便微生物菌群的影响,然而对盲肠微生物菌群的影响尚未报道,另外年龄对马属动物肠道微生物菌群影响存在着争议。
3.3 抗生素、益生菌和益生元对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数的影响马属动物肠道疾病抗生素的使用对微生物菌群有不利影响,而益生菌和益生元已被广泛应用于动物肠道疾病治疗和预防,因此临床上将三者结合使用治疗马属动物肠道疾病效果显著[47]。
3.3.1 抗生素类药物对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数的影响尽管抗生素类药物是马属动物肠道疾病治疗最有效的方法之一,但在马属动物肠道微生物菌群变化的所有外部因素中,抗生素类药物的使用产生最为深远的影响。如Arnold等[73]使用抗生素甲硝唑探讨给药前后对马盲肠和粪便微生物菌群影响,研究发现甲硝唑可显著降低盲肠和粪便样本微生物菌群丰度和均匀度指数,在粪便样本中,放线菌门(Actinobacteria)、螺旋体门、黏胶球形菌门(Lentisphaerae)和疣微菌门的数量在给药第3天发生显著变化,此外甲硝唑显著影响粪便微生物代谢物,但不影响盲肠微生物代谢物,表明甲硝唑给药会改变马盲肠和粪便中的细菌组成,以及粪便样本微生物代谢。Harlow等[74]为了评估普通抗生素对健康马粪便中纤维素降解细菌、乳酸杆菌和抗生素相关性腹泻(AAD)病原体的影响,发现在给药期间,纤维素降解细菌减少了99%,停药后仍少于对照组,在抗生素给药期结束时,使用头孢噻呋的马粪样中的乳酸杆菌比对照组少75%,此外抗生素组的沙门氏菌(Salmonella)的数量比对照组多,艰难梭菌(Clostridium difficile)数量可增加至约104 CFU/g,并且在停药后1周仍可检测到,表明抗生素会促进沙门氏菌的和艰难梭菌增殖,破坏胃肠道微生物菌群平衡。因此,抗生素类药物对马盲肠微生物菌群及发酵参数造成不利的影响。
3.3.2 益生菌对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数的影响益生菌是有益的活性微生物,具有调节动物肠道内菌群平衡,促进营养吸收,保持动物肠道健康等作用,因此被广泛运用于饲料添加剂中。益生菌已成功应用于马属动物,如酵母菌(Saccharomyces)、乳酸杆菌和大肠杆菌等,使用这些有益菌可以有效提高含淀粉和纤维的饲粮消化率,此外浓缩精料饲粮中添加益生菌有利于维持盲肠pH,降低乳酸含量,提高纤维素降解细菌的丰度[47]。Grimm等[75-76]报道马的饲粮干草突然更换会增加马患肠道绞痛疾病机率,添加酵母菌能有效预防该病的发生,通过采集马盲肠发酵液,评估盲肠微生物及其发酵参数,研究表明在添加酵母菌后,马盲肠的厚壁菌门菌群、VFA和盲肠果胶分解菌数量有显著增加的趋势。另外又通过投喂高纤维和高淀粉饲粮中添加酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)和Aurantiochytrium limacinum探讨对马盲肠、结肠和粪便微生物菌群的影响,研究发现无论饲粮类型如何,投喂益生菌都可以增加盲肠和粪便中梭菌属(Clostridiales)的丰度,此外,在高淀粉饲粮组中投喂马益生菌后,发现马结肠和粪便中韦荣氏菌科(Veillonellaceae)的丰度更高,表明无论饲粮类型如何,投喂益生菌可以增加马肠道微生物菌群丰度。然而,由于微生物种类、剂量和基础饲粮的选择不同,很难比较数据,益生菌虽然成功使用在马属动物上但仍有许多未解的问题。
3.3.3 益生元对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数的影响益生元指的是一些不被宿主消化吸收却能够选择性地促进体内益生菌代谢和增殖的有机物质,从而可以修复马属动物盲肠微生态系统、增加盲肠微生物丰度和抵制有害病菌的增加。如在高纤维饲粮中添加含低聚果糖(FOS)或甘露寡糖(MOS)的益生元制剂可以提高马属动物干物质(DM)、粗蛋白质(CP)和中性洗涤纤维的消化率[50, 52]。Glatter等[77]通过添加天然益生元对马盲肠微生物菌群的影响,研究发现,在添加燕麦和菊苣粕益生元后,马盲肠的乳酸杆菌丰度增加,但进一步降低纤维素降解细菌的丰度,尤其是毛螺菌科(Lachnospiraceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae),表明投喂天然益生元会影响马盲肠微生物菌群丰度。由于有关益生元对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数影响的研究文献较少,且大部分集中在对粪便的影响,因此还需进一步探讨饲粮中添加益生元对马属动物盲肠微生物菌群及发酵参数的影响。
4 小结了解马属动物肠道微生态系统,特别是盲肠微生态中饲粮降解机制过程,对提供正确喂养方法和预防疾病至关重要。关于马属动物盲肠微生物菌群的研究主要集中在细菌方面,而真菌、原生动物和古细菌的研究较少,且三者在纤维降解的过程中的意义和作用存在着争议。饲粮是影响马属动物盲肠微生物最主要的因素,摄食含大量谷物、高淀粉和浓缩精料的饲粮会破坏盲肠微生物菌群平衡,致使盲肠内发酵参数失调。另外,抗生素类药物对盲肠微生物菌群有不利影响,而益生菌和益生元可改善盲肠内环境,增加微生物的数量和丰度等,但需要考虑其添加剂量、投喂频率、是否需要抑制胃酸,以及对其作用的持久性仍存有争议。而改善马属动物的消化可以通过多种方法进行,如饲粮选择、饲粮质量、饲养管理和消化辅助物等,这些均已用于提高马属动物饲粮的消化率、维持盲肠微生物菌群平衡、预防和治疗疾病。目前国内对马属动物盲肠微生物菌群的调控仍在探索阶段,盲肠微生物菌群结构复杂,其功能和相互作用尚不完善,因此,如何合理的调控盲肠微生物菌群,广泛应用至马属动物的实际生产实践中,仍需进一步深入研究。
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