仔猪出生后肠道发育非常迅速,但由于各种病原菌入侵、饲料发生霉变或氧化等可诱导新生仔猪肠道发生氧化应激(oxidative stress),从而影响仔猪消化吸收、生长发育和抵抗病原菌入侵,并伴随着机体免疫力的下降[1]。研究表明抗氧化剂在保护机体免受氧化应激损伤方面发挥重要作用,可有效地防御氧化应激[2]。大豆异黄酮(soybean isoflavones,SI)是一类从大豆中提取的、具有多酚羟基结构的生物活性物质,主要分为游离型苷元和结合型糖苷两大类。作为一种天然的植物雌激素,大豆异黄酮具有多种生理生化功能,目前被广泛应用于畜禽生产中。研究表明,大豆异黄酮能够提高动物机体的生长性能,例如,泌乳母猪饲粮中添加大豆异黄酮可提高母猪泌乳性能,提高乳蛋白和乳脂含量,显著提高哺乳仔猪生长性能[3];饲粮中添加适量大豆异黄酮可以提高肉鸡的饲料转化率[4],提高蛋鸡种蛋孵化率及蛋品质[5-6]。由于大豆异黄酮可抑制自由基的产生并清除自由基,可诱导增强内源抗氧化酶活性,近年来大豆异黄酮的抗氧化作用已引起国内外学者的广泛关注[7-9]。本课题组前期动物试验研究发现,饲喂氧化鱼油对新生仔猪肠道黏膜产生了氧化应激,肠道绒毛受损,同时肠道的免疫细胞因子[白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-8(IL-8)和白细胞介素-10(IL-10)等]和核因子-κB(NF-κB)含量产生了变化;添加大豆异黄酮提高了机体抗氧化能力,显著缓解了肠道氧化应激造成的损伤,同时降低了肠道黏膜的炎症反应[10]。氧化应激条件下,大豆异黄酮是否参与调控细胞的免疫功能及相关信号通路目前尚无文献报道。因此,为了进一步探讨大豆异黄酮缓解猪肠上皮细胞氧化损伤的作用机理,本研究采用更贴近早期断奶仔猪肠道生理状态的仔猪小肠上皮细胞IPEC-1为研究对象,利用FeSO4/H2O2建立体外氧化应激模型,研究大豆异黄酮对体外氧化应激仔猪肠上皮细胞免疫细胞因子的调节及相关信号通路的影响,为大豆异黄酮的应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料大豆异黄酮为广东省农业科学院动物科学研究所研制,含量为98.5%。仔猪小肠上皮细胞IPEC-1由美国德州农工大学伍国耀教授惠赠。DMEM/F12培养基由Gibco公司提供。MTT试剂盒购自Sigma公司。乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒购于美国R&D公司。诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、NF-κB和抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗以及用于Western Blot试验的二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒、裂解液和化学显色试剂盒均购于碧云天生物技术公司。
1.2 试验分组与设计用DMEM-F12培养基调整IPEC-1细胞浓度至约2×105个/mL,将细胞接种在6孔板上,37 ℃、5%CO2的培养箱中培养,待细胞贴壁后,随机分组并进行如下处理:1)正常对照组,正常DMEM-F12培养基;2)氧化对照组,含400 μmol/L FeSO4/H2O2的DMEM-F12培养基,氧化处理2 h;3)不同浓度大豆异黄酮组,先按照氧化对照组的操作氧化处理2 h后,再分别添加含有不同浓度的大豆异黄酮完全培养基。每组设置6个重复。
1.3 细胞增殖的测定将处于对数生长期且同代的细胞,用胰蛋白酶消化后,调整细胞浓度后接种于96孔培养板,每孔2×105个细胞,37 ℃、5% CO2培养箱中培养48 h后进行后续处理。培养基中加入400 μmol/L FeSO4/H2O2,氧化处理2 h后,更换含0~320 μmol/L大豆异黄酮的完全培养基,继续培养1、3、5 d后,每孔加入MTT染色液(5 g/L)25 μL,于37 ℃、5% CO2条件下孵育4 h后去掉上清,随后加入100 μL Formazan溶解液,37 ℃继续孵育3~4 h。处理完成后在酶标仪上检测490 nm波长吸光度值。
1.4 细胞凋亡的测定采用Annexin V荧光染色和流式细胞仪进行细胞凋亡检测。收集处理后的细胞2×106个,l mL预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1~2次。加入10 μL Annex V-FITC,混匀,避光室温反应15 min,随后加入300 μL Binding Buffer重悬,用于后续流式细胞仪测定和荧光显微镜观察。
1.5 细胞培养液中LDH活性与细胞内抗氧化指标的测定用不同浓度大豆异黄酮处理仔猪肠上皮细胞48 h后,取上清于-20 ℃保存,用于后续LDH活性的检测。同时,用预冷的PBS清洗细胞,将其刮下后转移至EP管内,冰浴条件下超声波破碎细胞,3 000 r/min离心5 min,取上清液-20 ℃冻存,根据南京建成生物工程研究所试剂盒说明,采用比色法测定细胞中MDA、GSH-Px、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、T-SOD、CAT、一氧化氮(NO)和iNOS的含量/活性。
1.6 细胞内免疫细胞因子及免疫和氧化相关信号通路关键蛋白含量的测定细胞收集方法同1.5。采用ELISA试剂盒测定细胞内IL-1β、IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ含量,同时测定免疫和氧化相关信号通路关键蛋白NF-κB、Jun N-末端蛋白激酶(JNK)、激活蛋白-1(AP-1)的含量/活性。
1.7 Western Blot用含不同浓度大豆异黄酮的完全培养基处理细胞48 h后,去掉细胞培养上清,预冷PBS清洗细胞后,加入120 μL细胞裂解缓冲液,14 000×g离心10 min,吸上清液。BCA蛋白定量法定量后,加入等体积上样缓冲液,通过12%十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,分离的蛋白用半干电转移法转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,室温封闭1 h后分别加入1∶1 000稀释的兔抗鼠iNOS和NF-κB p65一抗,4 ℃孵育过夜后用1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgG二抗室温孵育2 h,化学发光法显色,以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参,重复3次。
1.8 数据处理与统计分析试验数据采用SAS v8.2的GLM程序进行方差分析,显著水平为P < 0.05,极显著水平为P < 0.01。数据采用最小均方平均值(LS mean)±标准差(SD)表示。同时对氧化应激条件下大豆异黄酮浓度进行线性和二次回归分析。
2 结果与分析 2.1 大豆异黄酮对氧化应激仔猪肠上皮细胞增殖的影响图 1所示,经过1、3和5 d的培养,氧化对照组细胞活性显著低于正常对照组(P < 0.05),添加10~40 μmol/L大豆异黄酮显著提高了氧化处理后的细胞活性(P < 0.05),但添加160~320 μmol/L的大豆异黄酮无法缓解氧化处理对细胞造成的损伤,结果显示细胞活性较正常对照组显著降低(P < 0.05)。
如图 2所示,正常培养条件下,仔猪肠上皮细胞形态完整,规则的贴壁生长(图 2-A)。经过氧化处理后,仔猪肠上皮细胞严重收缩,大量细胞破裂溶解(图 2-B)。添加不同浓度的大豆异黄酮对氧化应激造成的细胞损伤具有不同程度的缓解作用,通过显微镜观察,经10~40 μmol/L的大豆异黄酮处理后,大部分细胞能够保持完整形态,细胞破裂和收缩均有不同程度的缓解(图 2-C、图 2-D和图 2-E),但随着大豆异黄酮浓度的提高,160和320 μmol/L大豆异黄酮处理后,并未观察到对细胞氧化损伤的缓解作用(图 2-G和图 2-H)。
由表 1可知,与正常对照组相比,氧化处理显著提高了仔猪肠上皮细胞凋亡率和半胱天冬酶(Caspase)-3活性(P < 0.05)。添加10、20、40和80 μmol/L的大豆异黄酮能显著或极显著缓解氧化处理引起的仔猪肠上皮细胞凋亡(P < 0.05或P < 0.01),使其达到与正常对照组相当的水平(P>0.05)。添加不同浓度大豆异黄酮后,观察到促进凋亡的Caspase-3活性均在一定程度上低于氧化对照组(P>0.05)。由此可见,添加大豆异黄酮对氧化应激引起的仔猪肠上皮细胞凋亡具有抑制作用,以10~20 μmol/L大豆异黄酮效果较佳。
由表 2可知,与正常对照组相比,氧化处理仔猪肠上皮细胞后细胞内T-SOD活性显著降低(P < 0.05),添加不同浓度大豆异黄酮后能在一定程度上提高T-SOD活性(P>0.05)。氧化处理后,细胞内MDA含量显著高于正常对照组(P < 0.05),添加10~80 μmol/L大豆异黄酮后MDA含量降低,但与氧化对照组和正常对照组均差异不显著(P>0.05)。细胞内GSH-Px和CAT活性、GSH含量和GSH/GSSG在各组之间差异不显著(P>0.05)。
由表 3可得,氧化处理不会造成仔猪肠上皮细胞培养液中LDH活性的变化(P>0.05),且不同浓度大豆异黄酮处理后也未观察到各组之间的显著差异(P>0.05)。
由表 4可知,与正常对照组相比,氧化处理显著提高了细胞内IL-1β、IL-2和TNF-α的含量(P < 0.05);与氧化对照组相比,添加不同浓度大豆异黄酮后,未观察到细胞内IL-1β、IL-2和IL-4含量的显著变化(P>0.05)。与正常对照组相比,氧化处理显著提高了细胞内TNF-α含量(P < 0.05),10~80 μmol/L大豆异黄酮组细胞内TNF-α含量显著低于氧化对照组(P < 0.05),与正常对照组则无显著差异(P>0.05)。细胞内IFN-γ含量在各组之间差异不显著(P>0.05)。
由表 5可知,仔猪肠上皮细胞经氧化处理后,氧化对照组细胞内NF-κB含量和JNK活性均显著高于正常对照组(P < 0.05),添加10~20 μmol/L大豆异黄酮后NF-κB含量与正常对照组和氧化对照组均差异不显著(P>0.05),而添加40~80 μmol/L大豆异黄酮后NF-κB含量与氧化对照组差异不显著(P>0.05),但显著高于正常对照组(P < 0.05);10~40 μmol/L大豆异黄酮组细胞内JNK活性显著低于氧化对照组(P < 0.05),但80 μmol/L大豆异黄酮组JNK活性与氧化对照组差异不显著(P>0.05)。细胞内AP-1含量在各组之间无显著差异(P>0.05)。
由表 6可得,氧化处理极显著提高了细胞内NO含量(P < 0.01);10~20 μmol/L大豆异黄酮组细胞内NO含量显著低于氧化对照组(P < 0.05),与正常对照组差异不显著(P>0.05)。40~80 μmol/L大豆异黄酮组细胞内NO含量极显著高于正常对照组(P < 0.01),与氧化对照组差异不显著(P>0.05)。氧化对照组细胞内iNOS含量显著高于正常对照组(P < 0.05),10~40 μmol/L大豆异黄酮组细胞内iNOS含量与氧化对照组和正常对照组差异不显著(P>0.05),80 μmol/L大豆异黄酮组细胞内iNOS含量显著高于正常对照组(P < 0.05)。随着大豆异黄酮浓度的增加,细胞内NO含量呈先下降后上升的变化趋势。
由图 3可知,与空白对照组相比,氧化处理显著提高了细胞内NF-κB和iNOS蛋白相对表达量(P < 0.05)。添加不同浓度大豆异黄酮后细胞内NF-κB蛋白表达相对量显著低于氧化对照组(P < 0.05);10~40 μmol/L大豆异黄酮处理均显著降低了氧化处理诱导的iNOS蛋白相对表达量的显著提高(P < 0.05),然而80 μmol/L大豆异黄酮处理则显著提高了该蛋白的相对表达量(P < 0.05)。
H2O2通过形成高活性的羟自由基引发脂质过氧化反应,损伤生物膜的结构和功能,从而造成肠上皮细胞的氧化损伤[10-11]。本试验以Fenton反应(H2O2+Fe2+→Fe3++OH-+OH·)产生活性极强的羟自由基,构建体外仔猪小肠上皮细胞氧化应激模型,结果显示,氧化处理显著降低仔肠上皮细胞增殖率,使细胞内MDA和GSSG含量上升,T-SOD活性降低,说明体外氧化应激模型降低细胞抗氧化能力,对仔猪肠上皮细胞具有损害作用,这与Racz等[12]的报道一致。加入10~40 μmol/L大豆异黄酮后细胞增殖率显著高于氧化对照组,T-SOD活性上升,说明适量的大豆异黄酮能有效缓解Fe2+/H2O2对仔猪肠上皮细胞的损害,提高细胞的抗氧化能力。但高剂量(80~320 μmol/L)大豆异黄酮则表现出对细胞损伤的加重,并且观察细胞形态也可看出,适量的大豆异黄酮能够改善氧化处理后细胞的收缩状态,高剂量大豆异黄酮则无法缓解氧化应激导致的细胞损伤,该结果与Hsu等[13]的报道一致。本试验从细胞水平说明了添加10~40 μmol/L大豆异黄酮对氧化应激仔猪肠上皮细胞具有保护作用,但浓度提高到80~360 μmol/L则对细胞呈抑制作用。
细胞凋亡是生物体发育和组织平衡的重要机制[14]。细胞膜磷脂肽丝氨酸(PS)从细胞膜内转向胞膜外是细胞凋亡的一种早期现象。Annexin V是一种钙依赖磷脂结合蛋白(分子质量35~36 ku),对翻转到细胞膜外的PS有高度的亲和性,所以利用FITC标记的Annexin V染色,结合核酸染料(PI)对细胞进行双染色,能够更早地辩别凋亡细胞。Racz等[12]利用0.1 mol/L H2O2构建鸡内耳细胞的氧化应激模型,利用FITC标记的Annexin V染色检测出氧化应激细胞中细胞凋亡增加,并且细胞中Caspase-3表达水平显著提高。Xu等[15]利用H2O2和高剂量葡萄糖构建人脐静脉原代上皮细胞氧化应激模型,培养基中添加大豆异黄酮后能缓解H2O2引起的脐静脉上皮细胞凋亡。本研究结果显示,氧化处理后细胞凋亡率显著高于正常对照组,添加适量大豆异黄酮后细胞凋亡率显著降低,细胞中Caspase-3的活性变化与细胞凋亡率的改变一致。因此,通过本试验的开展,证实了大豆异黄酮能够保护仔猪肠上皮细胞免受氧化应激引起的细胞凋亡。
氧化应激状态下,肠上皮细胞可以分泌IL-1β、TNF-α等的一系列炎症因子[16]。研究表明,炎症因子的产生可直接造成肠上皮细胞损伤,减少紧密连接蛋白分泌,进而导致肠屏障功能下降[17]。体外TNF-α的添加抑制上皮细胞间紧密连接蛋白之一闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的产生[18]。活性氧簇(ROS)引起氧化损伤细胞中TNF-α表达水平增加[19]。本试验结果显示,与正常对照组相比,氧化处理显著提高了细胞Th1型细胞因子(IL-1β、IL-2和TNF-α)的含量,而Th2型细胞因子(IL-4)的含量显著低于正常对照组,添加适量大豆异黄酮后,Th1型细胞因子的含量显著降低,IL-4的含量则显著升高。本研究通过体外细胞试验发现,氧化应激诱导仔猪肠上皮细胞Th1免疫反应,添加大豆异黄酮能缓解仔猪肠上皮细胞的Th1免疫应答,使细胞Th1/Th2系统趋于平衡。
正常生理状态下,细胞内的NF-κB以复合物的形式存在,当细胞受到自由基的作用后,NF-κB将从复合物中解离并移动进入细胞核,进而激活下游的基因表达,因此,测定NF-κB在细胞中的变化可直接反映细胞受自由基作用的程度[20-21]。本试验结果显示,氧化对照组仔猪肠上皮细胞中NF-κB含量和JNK活性均显著高于正常对照组,添加10~20 μmol/L大豆异黄酮后,NF-κB的表达受到抑制,10~40 μmol/L大豆异黄酮可以抑制JNK的活性,同时检测到细胞内Th1型细胞因子(IL-1β、IL-2和TNF-α)的含量降低,这与Wang等[22]的研究结果一致,结果提示大豆异黄酮的添加可能通过调控NF-κB的表达,从而影响Th1型细胞因子的分泌。此外,细胞内NO对抗氧化和免疫都具有重要的作用。何姜等[23]研究表明,一氧化氮合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)能够显著抑制氧化剂第三丁基过氧化氢(t-BHP)诱导的内皮细胞NO表达上调。大豆异黄酮能够通过下调NO的表达,抑制乳腺癌细胞生长[13]。本试验结果提示,氧化对照组细胞内NO和iNOS含量显著高于正常对照组,添加适量的大豆异黄酮能够降低NO和iNOS含量,但高浓度的大豆异黄酮则促进NO和iNOS的表达,说明氧化应激可引起肠上皮细胞损伤,适量浓度的大豆异黄酮可能通过NF-κB-iNOS-NO途径缓解细胞的氧化损伤,与本课题组前期动物试验[10]结论一致。
4 结论① 10~40 μmol/L大豆异黄酮能减轻氧化应激对仔猪肠上皮细胞的损害,提高细胞的抗氧化能力,显著降低细胞凋亡率。
② 大豆异黄酮可以抑制仔猪肠上皮细胞氧化应激时炎症介质的产生,使肠道黏膜的Th1/Th2系统趋向于Th2型细胞因子分泌,抑制肠黏膜免疫的炎症应答。
③ 大豆异黄酮通过抑制NF-κB和JNK的产生,调控仔猪肠上皮细胞氧化应激信号通路。
④ 10~20 μmol/L大豆异黄酮对氧化应激仔猪肠上皮细胞内NO和iNOS的分泌有抑制作用。
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