2. 南京农业大学动物科技学院, 南京 210095;
3. 福建省畜牧总站, 福州 350003
2. College of Animal Science & Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;
3. Fujian Animal Husbandry Station, Fuzhou 350003, China
现代繁育技术在提高母猪窝产仔数的同时，也导致弱仔猪数量不断增多。由于母猪子宫容积有限，胚胎生长空间及所需养分会随其数量增多而愈发不足，造成胎儿及其器官生长发育受阻，这一现象称为宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR)。在生猪养殖中，低初生重或极低初生重是IUGR仔猪的典型特征，其出生后生长发育缓慢、存活率和抗病力较低，造成母猪繁殖资源和饲料资源的严重浪费[1]。研究表明，IUGR损伤新生仔猪肝脏功能，造成氧化还原稳态失衡、细胞凋亡和组织损伤增多等异常现象[2-3]。当胎儿暴露于营养不良的宫内环境时，机体会优先将有限的养分供给大脑、心脏等器官以维持自身存活，而减少对肝脏等代谢器官的养分供给，造成肝脏生理功能损伤[4]。作为机体重要的代谢、分泌及解毒器官，肝脏损伤是导致IUGR仔猪生长性能和抗病能力下降的一个重要因素[4]。因此，缓解早期肝脏损伤是改善IUGR仔猪生长发育和健康状况的可行途径。
甜菜碱(学名三甲基甘氨酸)是一种广泛存在于动植物及微生物中的季铵型生物碱，化学结构与氨基酸相似，具有提供甲基、维持细胞渗透压、调节蛋白质功能和酶活性以及改善脂质代谢等多种生理功能[5]。在畜禽养殖中，饲粮中添加适宜剂量的甜菜碱既可改善动物生长性能和胴体品质，也能节约胆碱和蛋氨酸的用量以降低饲料成本[6-7]。近年来研究发现，甜菜碱可通过调节肝脏含硫氨基酸代谢，提高抗氧化和解毒能力，改善多种不良因素造成的肝脏损伤[8-11]。然而，目前关于甜菜碱在IUGR仔猪上的应用研究较少。因此，本试验旨在探讨甜菜碱对IUGR仔猪生长性能、肝脏损伤和抗氧化功能的影响，以期为改善IUGR仔猪的生长发育与健康状况提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计从6窝符合正常初生重(NBW)和IUGR选择标准的三元(“杜×长×大”)杂交新生仔猪中，按每窝1头NBW和2头IUGR雄性仔猪的挑选方式，选择6头NBW[(1.51±0.04) kg]和12头IUGR[(0.85±0.05) kg]仔猪。NBW和IUGR的判定标准如下：初生重在群体平均值0.5个标准差之内为NBW仔猪，初生重低于群体平均值的2个标准差为IUGR仔猪[11-12]。所有仔猪自然哺乳至7日龄，随后将每窝的1头NBW和2头IUGR仔猪分至NBW对照组、IUGR对照组和IUGR试验组，每组6个重复，每个重复1头。NBW对照组和IUGR对照组饲喂基础配方乳，IUGR试验组饲喂在基础配方乳中添加1.0 g/kg甜菜碱(以乳粉干物质计)的试验配方乳。基础配方乳参照NRC(2012)断奶仔猪营养需要标准配制，其组成及营养水平见表 1。各组配方乳临喂时按每100 g乳粉加入600 mL 45 ℃温水的比例配制，2~3 h瓶喂1次，每天饲喂8次，试验期15 d。试验期间，受试仔猪采用单栏饲养，舍温保持在27~29 ℃，免疫程序等其他管理按照常规方法进行。准确记录仔猪初体重(IBW)、末体重(FBW)以及采食量，计算7~21日龄的平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
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表 1 基础配方乳组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal formula milk (DM basis) |
试验结束时，于仔猪前腔静脉处采集5 mL血液置于肝素钠抗凝管中，4 ℃条件下3 000 r/min离心10 min收集上层血浆，保存于-20 ℃冰箱中备用。采血完成后，将仔猪电击致晕、放血致死，迅速分离肝脏，在左小叶处收集大约5 g组织置于预冷的Hank’s平衡盐溶液中，用于肝细胞分离，另取1.5 g左右肝脏样本收集至冻存管，液氮速冻后保存于用于-80 ℃超低温冰箱中备用。
1.3 指标测定和方法 1.3.1 血浆转氨酶活性的测定使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定血浆丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性。所有试验步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.3.2 肝细胞活性氧(ROS)水平的检测采用机械剪碎与Ⅰ型胶原酶消化相结合的方法制备肝细胞悬液，具体方法参见Zhang等[12]报道。采用2’, 7’-二氯荧光素双乙酸盐(DCFH-DA)荧光探针测定肝细胞ROS水平。DCFH-DA自身无荧光，可自由穿过细胞膜，并被细胞内酯酶水解生成2’, 7’-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH)。DCFH不能通透细胞膜，故易装载至细胞内。DCFH易被细胞内ROS氧化，产生带有荧光的2’, 7’-二氯荧光素(DCF)。因而，通过测定细胞DCF荧光强度可反映ROS水平。方法如下：在37 ℃条件下，使用工作浓度为10 μmol/L的DCFH-DA对肝细胞避光染色。孵育30 min后，使用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次，4 ℃条件下1 000 r/min离心5 min以弃上清。洗涤完成后，使用600 μL PBS重悬细胞，采用BD FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)在激发波长488 nm、发射波长525 nm条件下测定细胞DCF荧光强度。
1.3.3 肝脏抗氧化酶活性的测定称取300 mg左右肝脏冻存样本，加入9倍重量体积生理盐水，在冰水浴条件下使用玻璃匀浆器制备组织匀浆液。4 ℃条件下4 000 r/min离心15 min，收集上清液用于抗氧化酶活性测定。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶(γ-GCL)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽还原酶(GR)以及过氧化氢酶(CAT)活性。匀浆液蛋白含量采用碧云天生物技术研究所二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定。所有试验步骤均严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.3.4 肝脏氧化还原代谢产物含量的测定制备肝脏组织匀浆液，方法同1.3.3。采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定肝脏丙二醛(MDA)、蛋白羰基(PC)、还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，试验步骤按照试剂盒说明书进行。匀浆液蛋白含量测定方法同1.3.3。
1.3.5 肝脏S-腺苷蛋氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)含量的测定取冻存肝脏组织，加入4倍重量体积0.6 mol/L高氯酸，在冰水浴条件下制备为匀浆液，并在冰上静置1 h。4 ℃条件下14 000 r/min离心20 min，收集上清液，使用孔径为0.22 μm的微孔滤膜进行过滤。使用赛默飞UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国赛默飞)测定溶液中SAM和SAH含量，色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，条件如下：检测波长254 nm，柱温40 ℃，流动相分别为含有50 mmol/L KH2PO4、5 mmol/L庚烷磺酸钠的盐溶液(80%)和甲醇(20%)，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。SAM和SAH标准品购自Sigma-Aldrich(上海)。
1.4 数据统计分析试验数据用平均值±标准误表示，采用SPSS 22.0软件中ANOVA方法进行单因素方差分析，采用Tukey方法进行事后检验和两两比较，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 甜菜碱对IUGR仔猪7~21日龄生长性能的影响由表 2可知，与NBW对照组相比，IUGR显著降低了仔猪IBW、FBW以及7~21日龄ADG和ADFI(P < 0.05)，但对7~21日龄F/G无显著影响(P>0.05)。甜菜碱未显著改变IUGR仔猪21日龄FBW和7~21日龄生长性能(P>0.05)。
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表 2 甜菜碱对IUGR仔猪7~21日龄生长性能的影响 Table 2 Effects of betaine on growth performance of IUGR piglets from 7 to 21 days of age |
由表 3可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪血浆ALT和AST活性显著升高(P < 0.05)。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组仔猪血浆ALT活性较IUGR对照组显著降低(P < 0.05)，而血浆AST活性无显著变化(P>0.05)。
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表 3 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪血浆转氨酶活性的影响 Table 3 Effects of betaine on plasma aminotransferase activity of IUGR piglets at 21 days of age |
由表 4可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝细胞ROS水平及肝脏MDA和PC含量显著提高(P < 0.05)。与IUGR对照组比较，IUGR试验组仔猪肝细胞ROS水平和肝脏PC含量显著降低(P < 0.05)，但肝脏MDA含量无显著差异(P>0.05)。
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表 4 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏氧化应激标志物水平的影响 Table 4 Effects of betaine on oxidative stress marker levels in liver of IUGR piglets at 21 days of age |
由表 5可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝脏γ-GCL和GR活性显著降低(P < 0.05)，而肝脏SOD、GPx和CAT活性无显著差异(P>0.05)。与IUGR对照组相比，IUGR试验组仔猪肝脏γ-GCL活性显著提高(P < 0.05)，但肝脏SOD、GPx、GR和CAT活性均无显著差异(P>0.05)。
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表 5 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏抗氧化酶活性的影响 Table 5 Effects of betaine on antioxidant enzyme activity in liver of IUGR piglets at 21 days of age |
由表 6可知，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝脏总谷胱甘肽(T-GSH)和GSH含量以及GSH/GSSG值显著降低(P < 0.05)，而肝脏GSSG含量显著升高(P < 0.05)。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组仔猪肝脏T-GSH和GSH含量以及GSH/GSSG值均较IUGR对照组显著升高(P < 0.05)，但2组之间肝脏GSSG含量无显著差异(P>0.05)。
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表 6 甜菜碱对21日龄IUGR仔猪肝脏谷胱甘肽代谢物含量的影响 Table 6 Effects of betaine on glutathione metabolite content in liver of IUGR piglets at 21 days of age |
由表 7可知，IUGR对照组仔猪肝脏SAM含量和SAM/SAH值均显著低于NBW对照组(P < 0.05)。与IUGR对照组相比，IUGR试验组仔猪肝脏SAM含量和SAM/SAH值显著提高(P < 0.05)。
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表 7 甜菜碱对21日龄仔猪肝脏SAM和SAH含量的影响 Table 7 Effects of betaine on contents of SAM and SAH in liver of IUGR piglets at 21 days of age |
诸多研究表明，初生重是影响仔猪出生后生长性能的关键因素之一[1, 10-12]。本试验中，IUGR显著降低了仔猪7和21日龄体重以及7~21日龄ADG和ADFI，这与前人研究结果[12-14]基本一致。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组仔猪7~21日龄ADG较IUGR对照组提高了7.2%，但未达到统计学显著水平，说明在7~21日龄阶段补充甜菜碱对IUGR仔猪生长性能无显著改变。因此，对于缓解IUGR仔猪生长阻滞或需较长时期的营养调控方可实现。
3.2 甜菜碱对IUGR仔猪肝脏损伤与氧化应激的影响肝脏作为机体重要的代谢器官和分泌器官，直接影响动物生长潜能的发挥。血浆转氨酶活性是反映肝脏功能的重要指标[15]。正常生理条件下，ALT主要存在于肝细胞，AST主要存在于心肌细胞和肝细胞。当肝脏发生损伤，ALT和AST会因细胞膜破裂而大量释放进入血液，导致血液循环中转氨酶的活性随之升高[15]。本试验中，IUGR显著提高了21日龄仔猪血浆ALT和AST活性，提示IUGR仔猪肝细胞发生损伤。与此相似，IUGR仔猪在断奶后早期阶段依然伴有血浆ALT和AST活性显著升高的现象[16]。临床研究也证实，IUGR导致新生儿肝脏功能受损、代谢效率降低[17]。因此，若得不到及时、有效地缓解，IUGR仔猪肝脏损伤现象或在其出生后较长时期持续存在。饲喂甜菜碱后，IUGR试验组血浆ALT活性较IUGR对照组显著降低，表明甜菜碱一定程度地缓解了IUGR仔猪肝脏损伤的现象。在啮齿动物上的研究也证实，甜菜碱能够减轻酒精、高脂饮食、有毒物质等不良刺激诱导的血液ALT和AST活性异常升高，有效保护动物肝脏功能[18-20]。
氧化应激是导致IUGR动物早期肝脏损伤的重要原因。正常情况下，ROS产生和清除处于动态平衡状态，对细胞及组织功能无负面影响。发生应激时，细胞氧化还原代谢失衡，造成ROS大量积聚以及蛋白质、脂质和核酸氧化损伤，破坏细胞稳态乃至组织功能。本试验结果显示，21日龄IUGR仔猪肝细胞ROS水平较NBW仔猪显著提高，肝脏MDA和PC含量显著升高。MDA是重要的脂质过氧化产物，其含量直接反映细胞脂质过氧化程度[21]。PC含量与蛋白质氧化损伤及酶失活密切相关，也是反映细胞氧化应激的敏感指标[22]。上述结果表明，IUGR仔猪肝脏存在明显的氧化应激现象。本试验还发现，添加甜菜碱可有效缓解IUGR造成的仔猪肝脏氧化应激，显著降低了肝细胞ROS水平以及肝脏PC含量，说明甜菜碱具有保护IUGR仔猪肝脏功能的作用。在大鼠上的研究也证实，饲喂甜菜碱有效改善了大鼠非酒精性肝损伤，肝脏氧化应激和纤维化程度均明显减轻[11]。
3.3 甜菜碱对IUGR仔猪肝脏抗氧化功能和含硫氨基酸代谢的影响抗氧化能力不足是造成IUGR仔猪肝脏氧化应激的关键因素。本试验中，IUGR对照组仔猪肝脏T-GSH含量与GSH/GSSG值较NBW对照组均显著降低。在断奶仔猪上的试验结果也表明，IUGR导致仔猪肝脏GSH含量降低而GSSG含量升高[16]。GSH作为细胞内重要的非酶类抗氧化物，可通过清除自由基、还原过氧化物以及保护蛋白巯基等方式，发挥抗氧化保护作用[23]。发生氧化应激时，大量GSH被氧化，若无法被及时还原会导致GSSG积聚，GSH/GSSG值也随之降低。因此，GSH含量和GSH/GSSG值下降提示此时肝脏伴有剧烈的氧化应激，这也解释了IUGR对照组肝脏MDA和PC含量显著升高的现象。
含硫氨基酸代谢紊乱与IUGR仔猪肝脏T-GSH合成减少密切相关[24]。在动物体内，50%以上摄入的含硫氨基酸在肝脏代谢，主要分为转硫和再甲基化途径。蛋氨酸可在胱硫醚β合酶和γ-GCL的催化下，经转硫途径生成半胱氨酸，后者参与GSH、牛磺酸等生物活性物质的代谢，对维持机体氧化还原稳态具有重要意义[25]。在再甲基化过程中，蛋氨酸经蛋氨酸腺苷转移酶(MAT)作用产生SAM，其携带1个活化的甲基，广泛参与细胞内甲基转移反应。SAM在提供甲基后会转化为SAH，后者经水解产生同型半胱氨酸，并在甜菜碱或N5-甲基四氢叶酸提供甲基后完成再甲基化。本试验中，与NBW对照组相比，IUGR对照组仔猪肝脏γ-GCL活性、SAM含量以及SAM/SAH值均显著降低，说明IUGR仔猪肝脏转硫和再甲基化途径均受抑制，导致GSH从头合成减少。与此相似，Maclennan等[26]研究发现，IUGR新生大鼠肝脏SAH、同型半胱氨酸和蛋氨酸含量增加，而半胱氨酸含量减少，进而阻碍了GSH合成。在仔猪上的研究也表明，IUGR导致肝脏半胱氨酸甲基转移酶和γ-GCL活性降低[24]。此外，本试验发现，IUGR显著降低了21日龄仔猪肝脏GR活性。GR是GSH氧化还原代谢过程中重要的还原酶，借助还原型辅酶Ⅱ(NADPH)将GSSG转化为GSH，以维持细胞GSH水平[27]。GR活性降低表明IUGR也会损伤仔猪肝脏GSH氧化还原代谢，导致肝脏GSH/GSSG值下降。
作为甲基供体，甜菜碱可有效补充蛋氨酸，并可促进MAT和γ-GCL表达，这不仅有助于改善甲基供给水平，也有利于GSH等生物活性物质的合成[5]。本试验中，添加甜菜碱显著提高了21日龄IUGR仔猪肝脏γ-GCL活性、T-GSH和GSH含量以及GSH/GSSG值，有效改善了GSH从头合成和氧化还原的代谢效率，继而增强了IUGR仔猪肝脏抗氧化功能。Jung等[8]也发现甜菜碱可通过促进GSH合成而发挥清除ROS作用。另外，本试验发现，饲喂甜菜碱后IUGR仔猪肝脏SAM含量显著提高，这与甜菜碱供甲基特性有关。除了作为有活性的甲基供体，SAM也具有抗氧化作用，可直接清除部分ROS或通过螯合铁离子而抑制羟自由基产生[28]。同时，SAM能够激活血红素加氧酶-1铁蛋白系统，减少NADPH介导的ROS产生，降低组织氧化应激和炎性反应[29]。此外，SAM可促进抑制素1表达，缓解应激造成的线粒体功能紊乱，减少电子传递链中ROS的生成[30]。综上所述，添加甜菜碱可有效改善IUGR仔猪肝脏含硫氨基酸代谢，促进转硫和再甲基化途径的代谢效率，提高GSH和SAM等生物活性物质含量，从而发挥保护肝脏作用。上述结果也解释了IUGR试验组仔猪饲喂甜菜碱后肝细胞ROS水平、肝脏PC含量以及血浆ALT活性降低的现象。
4 结论① IUGR会损伤21日龄仔猪肝脏含硫氨基酸代谢、谷胱甘肽从头合成及氧化还原循环效率，导致肝脏SAM、T-GSH和GSH等关键代谢物含量减少，抗氧化能力降低，引发肝脏氧化应激和组织损伤。
② 饲喂甜菜碱有助于改善IUGR仔猪肝脏SAM和T-GSH合成受阻的现象，提高肝脏抗氧化功能，降低肝细胞ROS水平、肝脏PC含量及血浆ALT活性，有效缓解IUGR仔猪肝脏氧化应激和组织损伤。
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