产蛋后期种母鸡肠道菌群失调，代谢能力下降，对营养物质的消化吸收能力减弱，导致生产性能降低，严重影响养殖业经济效益[1-2]。目前家禽养殖过程中已禁止使用促生长添加剂，与此同时，微生态制剂作为遵循微生物环境自然循环法则的无公害制剂，因其具有改善机体肠道菌群环境、提高消化吸收的功能而备受关注[3-5]。乳酸菌微生态制剂可定植于肠道中，通过降解碳水化合物产生乳酸及其他有机酸降低肠道环境pH，抑制其他病菌和杂菌的生长繁殖，不仅起到调节菌群、防治疾病和促生长的作用，而且避免了使用抗生素类药物产生的药物残留问题[6-7]。好氧的芽孢杆菌微生态制剂不仅能够消耗肠道多余的氧气利于乳酸菌生长，还可分泌各种消化酶促进肠道对营养物质的消化吸收能力[8-9]。Behnamifar等[10]研究证明，在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加105 CFU/(只·d)乳酸杆菌活菌制剂8周，可显著增加蛋鸡的回肠绒腺比，增强蛋鸡消化吸收能力，提高生产性能。黄晨轩等[11]在产蛋后期蛋鸡饲粮中连续4周添加108 CFU/(只·d)枯草芽孢杆菌微生态制剂，改善了蛋鸡的肠道菌群平衡，增加饲粮中的粗蛋白质表观消化率，从而提高其生产性能。Zhang等[12]在产蛋高峰期蛋鸡饲粮中添加106 CFU/(只·d)枯草芽孢杆菌制剂8周，显著提高其肠道消化吸收能力，改善生产性能。Lei等[13]在产蛋高峰期蛋鸡饲粮中添加107 CFU/(只·d)地衣芽孢杆菌制剂8周，可显著增加空肠绒腺比，增强肠道消化吸收能力，提高蛋鸡产蛋率和合格率。目前，有关副干酪乳杆菌和枯草芽孢杆菌复合微生态制剂对产蛋后期种母鸡生产性能、肠道菌群和消化吸收影响的研究鲜有报道。因此，本试验旨在研究副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌微生态制剂及两者复合使用对产蛋后期种母鸡肠道菌群平衡和消化吸收能力的影响，明确微生态制剂对产蛋后期种母鸡生产性能的作用，为家禽业生产绿色和安全的微生态生物饲料添加剂提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 微生态制剂副干酪乳杆菌KL1(CGMCC No.11533)为本课题组高产胆盐水解酶和胞外多糖的专利菌株[14-15]；枯草芽孢杆菌Liu-c1(CGMCC No.20840)为本课题组高产蛋白酶和淀粉酶的专利菌株，均冻藏保存于中国普通微生物菌种保藏管理中心。将副干酪乳杆菌KL1和枯草芽孢杆菌Liu-c1的-80 ℃甘油保藏菌种经活化扩培、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和真空冷冻干燥等工序分别制备活菌数为8.0×1010 CFU/g的副干酪乳杆菌KL1和枯草芽孢杆菌Liu-c1微生态制剂[16]，将2种微生态制剂分别用麦芽糊精稀释，得到活菌数为8.0×108 CFU/g的复合微生态制剂(副干酪乳杆菌KL1 ∶枯草芽孢杆菌Liu-c1=1 ∶ 1)，储存于-20 ℃条件下备用。
1.2 试验设计与饲养条件选取饲养条件一致且体重接近的54周龄京红1号父母代种母鸡384只(由北京市华都峪口禽业有限责任公司提供)，随机分为4组，每组96只(每组6个重复，每个重复16只)，空白组饲喂基础饲粮，试验组(KL1组、Liu-c1组和复合组)分别在基础饲粮中添加1.0 g/kg的副干酪乳杆菌KL1、枯草芽孢杆菌Liu-c1和复合微生态制剂，使各试验组摄入活菌数量均为8.0×107 CFU/只，试验期为8周，基础饲粮由北京市华都峪口禽业提供，其组成及营养水平见表 1。饲养条件依据峪口禽业饲养管理规定操作：3层A字型阶梯式笼养(47 cm×47 cm)，每笼4只，光照强度10~15 lx，时长恒定15.5 h，温度18~25 ℃，相对湿度40%~70%，按正常免疫程序进行免疫接种，鸡只自由采食、饮水，湿帘降温，风机通风，定期清理粪便，环境，用具皆定期消毒。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验期间，每天统计各组种母鸡的产蛋总重量、产蛋总数、合格种蛋数(破壳蛋、砂壳蛋、软壳蛋、畸形蛋、钢皮蛋、蛋重 < 53 g或>72 g均为不合格种蛋)、日耗料量，计算第8周种母鸡的平均蛋重、产蛋率、种蛋合格率和料蛋比。
1.4 肠道菌群结构测定 1.4.1 肠道菌群多样性测定试验第8周末，每组选取6只接近平均体重的种母鸡进行解剖，立即采集回肠内容物2 g，置于无菌冻存管中，液氮速冻，转移至-80 ℃冰箱保存备检。微生物基因组总DNA提取过程按照DNA抽提试剂盒(E.Z.N.A. ® Soil DNA Kit, Omega Bio-Tek, 美国)说明书进行，经1%的琼脂凝胶电泳检测提取DNA的完整性，NanoDrop2000(Thermo Fisher Scientific, 美国)检测提取DNA的纯度和浓度，采用上游引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和下游引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3~V4可变区进行PCR扩增(PCR仪：GeneAmp ® 9700，ABI，美国)。将PCR产物经2%的琼脂凝胶检测鉴定后，严格按照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences, Axygen, Union City, CA, 美国)试剂盒进行纯化、2%琼脂糖凝胶电泳检测并采用QuantusTM Fluorometer(Promega，美国)进行定量检测。使用NEXTFLEX ® Rapid DNA-Seq Kit进行建库：1)接头链接；2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；4)磁珠回收PCR产物得到最终的文库。利用Illumina MiSeq 2×300 bp平台进行高通量测序(上海美吉生物医药科技有限公司，上海)，根据97%的相似度对扩增产物序列进行操作分类单元(OTU)聚类，分析回肠菌群多样性[17]。
1.4.2 肠道乳酸杆菌和芽孢杆菌数量的测定解剖后，分别准确称取每只种母鸡的回肠内容物1 g，放入装有99 mL含0.1%吐温生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式匀浆器以6 T/S拍打20 min，得到10-2样品稀释液。准确吸取1 mL上述稀释液于9 mL灭菌生理盐水，漩涡振荡30 s，得到10-3样品稀释液，依此重复上述操作，连续稀释得到10-7稀释度的菌液。分别选取10-4、10-5和10-6稀释梯度样品各1 mL于无菌平皿中，倒入溶化并冷却至46 ℃的改良MRS固体培养基、改良PCA固体培养基约15 mL，迅速轻旋平皿使其与稀释液混匀，每个稀释度3个重复；待培养基凝固后，改良MRS固体培养基37 ℃倒置培养(48±2) h、改良PCA固体培养基45 ℃倒置培养(24±2) h，统计平板菌落数量，结果用每克回肠内容物中菌数的对数(lg CFU/g)表示。
1.5 消化吸收能力的测定 1.5.1 十二指肠蛋白酶活性、粗蛋白质表观消化率的测定解剖后，采集十二指肠段2 cm，于液氮速冻状态下研磨，取10 mg加入磷酸盐缓冲液100 μL，严格按照试剂盒的操作步骤检测十二指肠中性蛋白酶和胰蛋白酶活性，试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供。
试验最后3 d，采用全收粪法，将粪盘固定在鸡笼下，每天收集粪便并小心清除其中的饲粮和毛屑等杂物，混合均匀后取100 g加入10 mL 10% H2Cl固氮，再次充分混匀，65 ℃烘干至恒重，回潮过夜，粉碎均匀后过60目筛，采用内源指示剂法(在样品中加入4 mol/L盐酸)测定饲粮和粪便中的粗蛋白质及酸不溶灰分含量，计算粗蛋白质表观消化率。计算公式如下：
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式中：a为粪样中粗蛋白质含量；b为饲粮中粗蛋白质含量；c为饲粮中酸不溶灰分含量；d为粪样中酸不溶灰分含量。
1.5.2 小肠绒毛形态观察和绒腺比的测定解剖后，采集种母鸡的十二指肠和回肠段约2 cm，浸于10%中性福尔马林固定液中1周，经冲水、梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、切片等处理后，进行常规苏木精-伊红(HE)染色，得到十二指肠和回肠的组织切片[18]，以Olympus CX21显微镜观察绒毛形态并测定绒毛高度和隐窝深度，计算绒毛高度与隐窝深度的比值，即为绒腺比。每个样本观察3张非连续切片，每张切片选取5个具有完整组织的视野，每个视野分别测定4组数据，其平均值作为1个测定数据。
1.6 数据处理采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA LSD)，采用Duncan氏法进行多重比较检验。数据用平均值±标准误(X±SD)表示，P < 0.05表示差异显著，P < 0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 微生态制剂对产蛋后期种母鸡生产性能的影响如表 2所示，与空白组相比，KL1组、Liu-c1组和复合组的平均体重和平均蛋重皆无显著性差异(P>0.05)；产蛋率分别增加5.77%、5.37%和8.85%(P < 0.05)；种蛋合格率分别提高12.65%、9.15%和14.43%(P < 0.01)；KL1组料蛋比减少2.27%(P < 0.05)，Liu-c1组和复合组减少4.09%和5.45%(P < 0.01)。这表明2种微生态制剂单独和复合使用皆能不同程度提高产蛋后期种母鸡的产蛋率和种蛋合格率，降低料蛋比，其中复合微生态制剂效果最佳。
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表 2 微生态制剂对产蛋后期种母鸡生产性能的影响 Table 2 Effects of microecologics on performance of breeding hens in late laying period |
利用Illumina MiSeq 2×300 bp平台进行高通量测序，分析不同微生态制剂对回肠微生物多样性的影响。由图 1可知，在门水平上，各组回肠菌群主要为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)，其中厚壁菌门多为优势菌群，如乳酸杆菌和芽孢杆菌，变形菌门多为致病菌和条件致病菌，如沙门氏菌和大肠杆菌。与空白组相比，KL1组和复合组厚壁菌门相对丰度分别增加29.37%和35.68%(P < 0.05)，变形菌门相对丰度分别减少65.33% 和92.02%(P < 0.01)；Liu-c1组厚壁菌门相对丰度增加5.15%(P>0.05)，变形菌门相对丰度减少48.32%(P < 0.05)。由图 2可知，在属水平上，与空白组相比，KL1组、Liu-c1组和复合组的乳杆菌属相对丰度分别增加109.87%、77.86%和111.73%(P < 0.01)，芽孢菌属相对丰度分别增加107.43%、171.43%和300.00%(P < 0.01)；显示2种微生态制剂单独和复合使用皆可促进乳酸杆菌和芽孢杆菌在回肠中定植，增加肠道有益菌相对丰度，调节肠道菌群平衡，其中复合微生态制剂效果最佳。
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Firmicutes：厚壁菌门；Proteobacteria：变形菌门；Actinobacteria：放线菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Others: 其他。 A：空白组blank group；B：KL1组KL1 group；C：Liu-c1组Liu-c1 group；D：复合组compound group。下图同the same as below。 图 1 产蛋后期种母鸡肠道菌群门水平多样性分析 Fig. 1 Analysis diversity on phylum level of intestinal flora of breeding hens in late laying period |
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Lactobacillus: 乳酸菌属；Romboutsia: 罗姆布茨菌；Enterococcus: 肠球菌属；Escherichia-Shigella: 大肠埃希氏菌属-志贺氏菌；Burkholderia-Caballeronia-Burkholderia: 伯克霍尔德菌-卡巴拉氏菌-伯克霍尔德菌；Turicibacter: 苏黎世杆菌属；Clostridium sensu stricto-1:严格厌氧梭状芽胞杆菌-1；Ruminococcus torques-group: 瘤胃球菌属群；Olsenella: 欧陆森氏菌属；Blautia: 布劳特氏菌；Streptococcus: 链球菌属；unclassified-f-Lachnospiraceae: 未分类革兰氏菌-毛螺菌科；Rikenellaceae-RC9-gut-group: 理研菌科-RC9肠道菌群；Gallibacteriu: 加利细菌属；Acinetobacter: 不动杆菌属; norank-f-F082:未分类革兰氏菌属-F082；Ruminococcaceae-UCG-014:瘤胃菌科-UCG-014; Prevotella-1:普氏菌属-1；Collinsella: 柯林斯氏菌属；Peptococcus: 消化球菌；Aeriscardovia: 卡多维亚氏菌属；Bacillus: 芽孢杆菌属；norank-f-norank-o-Saccharimonadales: 未分类革兰氏菌- Saccharimonadales；Eubacterium hallii group: 霍氏真杆菌群；Campylobacter: 弯曲菌属；Bacteroides: 拟杆菌属；Others: 其他。 图 2 产蛋后期种母鸡肠道菌群属水平多样性分析 Fig. 2 Analysis diversity on the genus level of intestinal flora of breeding chickens in late laying period |
如表 3所示，与空白组相比，KL1组、Liu-c1组和复合组乳酸杆菌数量分别增加28.70%、16.90%和34.51%(P < 0.05)；KL1组芽孢杆菌数量增加4.60%(P>0.05)，Liu-c1组和复合组芽孢杆菌数量分别增加13.35%和23.37%(P < 0.05)。显示2种微生态制剂单独和复合使用皆可不同程度增加回肠乳酸杆菌和芽孢杆菌数量，调节肠道菌群平衡，其中复合微生态制剂效果最佳。此结果与回肠高通量测序多样性分析相一致。
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表 3 微生态制剂对产蛋后期种母鸡回肠乳酸杆菌和芽孢杆菌数量的影响 Table 3 Effects of microecologics on Lactobacillus and Bacillus counts in ileum of breeding hens in late laying period |
如表 4所示，与空白组相比，KL1组和复合组十二指肠中性蛋白酶活性分别增加4.20%和13.13%(P>0.05)，胰蛋白酶活性分别增加21.46%和15.98%(P < 0.01)，粗蛋白质表观消化率分别增加44.67%和48.50%(P < 0.01)；Liu-c1组十二指肠中性蛋白酶、胰蛋白酶活性和粗蛋白质表观消化率分别增加31.35%、43.84%和102.44%(P < 0.01)。显示2种微生态制剂单独和复合使用均能提高产蛋后期种母鸡十二指肠蛋白酶活性和粗蛋白质表观消化率，其中Liu-c1组和复合微生态制剂效果最佳。
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表 4 微生态制剂对产蛋后期种母鸡十二指肠蛋白酶活性和粗蛋白质表观消化率的影响 Table 4 Effects of microecologics on activity of duodenal protease and apparent digestibility of crude protein in breeding hens in late laying period |
如表 5所示，与空白组相比，KL1组、Liu-c1组和复合组十二指肠绒毛高度分别增加53.99%、56.47%和58.19%(P < 0.01)，隐窝深度分别减少19.86%、31.91%和36.88%(P < 0.01)，绒腺比分别增加92.13%、129.15%和150.44%(P < 0.01)。与空白组相比，KL1组回肠绒毛高度增加16.41%(P < 0.05)，Liu-c1组和复合组绒毛高度分别增加34.49%和61.58%(P < 0.01)；KL1组、Liu-c1组和复合组的隐窝深度无显著变化(P>0.05)，绒腺比分别增加9.45%、34.40%和51.87%(P < 0.01)。这表明2种微生态制剂单独和复合使用均可增加产蛋后期种母鸡十二指肠和回肠的绒腺比，提高肠道消化吸收能力，其中复合微生态制剂效果最佳。
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表 5 微生态制剂对产蛋后期种母鸡十二指肠和回肠绒毛形态的影响 Table 5 Effects of microecologics on villi morphology of duodenum and ileum of breeding hens in late laying period |
众所周知，随着日龄的增加，产蛋后期种母鸡代谢水平逐渐减缓，肠道功能逐步退化，导致生产性能下降。研究表明，副干酪乳杆菌KL1具有耐受胃肠道逆环境特性，能够定植于雏鸡肠道，改善菌群平衡，提高雏鸡的生长性能[19]，并且具有增加产蛋高峰期蛋鸡产蛋率和合格率，提高生产性能的作用[20]。本试验结果表明，将副干酪乳杆菌KL1与枯草芽孢杆菌Liu-c1复合后，不仅显著提高种母鸡产蛋率，而且极显著提高其种蛋合格率，极显著降低料蛋比，显示复合微生态制剂提高生产性能效果最佳。这是由于枯草芽孢杆菌Liu-c1不仅能够消耗肠道内氧气，利于副干酪乳杆菌KL1的生长，而且能够提高肠道蛋白酶活性，促进肠道对营养物质的吸收利用，有效地提高种母鸡的生产性能。于雷等[21]研究发现，添加107 CFU/(只·d)枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌复合微生态制剂4周，可提高产蛋后期种母鸡的产蛋率和种蛋合格率，降低料蛋比。Abdelqader等[22]研究报道添加107 CFU/(只·d)枯草芽孢杆菌制剂10周能显著提高蛋鸡的产蛋率和合格率，降低料蛋比。胡昌艳[23]研究表明，添加106 CFU/(只·d)乳酸杆菌和芽孢杆菌复合微生态制剂4周显著提高了产蛋后期蛋鸡的产蛋率和合格率等生产性能。以上研究结果和本试验结果皆一致。
3.2 微生态制剂对产蛋后期种母鸡肠道菌群的影响家禽饲粮及原料中普遍存在霉菌毒素，蛋鸡长期摄入含有低剂量霉菌毒素的饲粮，肠道菌群逐渐失调，生产性能受到严重影响[24-26]。副干酪乳杆菌KL1具有耐胃肠道逆环境特性，能够调节肠道菌群平衡，改善肠道微生态环境，且其代谢产生的乳酸可酸化肠内环境，阻止饲料中的霉菌等有害微生物附着肠道黏膜，维持肠道微生态平衡，对动物生长和健康有重要意义[19, 27]。枯草芽孢杆菌通过消耗肠道内的氧气，降低肠道内的氧化还原电势，创造有利于乳酸菌生长的环境，扶植肠道内的优势菌群，使失调的肠道菌群结构恢复到正常状态，起到抗菌防病的作用[28]。本试验结果表明，副干酪乳杆菌KL1和枯草芽孢杆菌Liu-c1复合微生态制剂可显著增加产蛋后期种母鸡回肠乳酸杆菌和芽孢杆菌的相对丰度及数量，调节肠道菌群平衡，改善肠道健康，从而提高生产性能。Abdelqader等[29]在产蛋后期蛋鸡饲粮中添加108 CFU/(只·d)枯草芽孢杆菌制剂12周，回肠乳酸杆菌和芽孢杆菌数量显著增加，肠道菌群平衡得到明显改善，蛋鸡生产性能得到显著提高。Abdelqader等[22]在产蛋后期蛋鸡的饲粮中添加107 CFU/(只·d)枯草芽孢杆菌10周，能够增加乳酸杆菌和双歧杆菌等有益微生物数量，调节盲肠菌群平衡，改善肠道健康并促进肠道消化吸收能力，从而提高生产性能。以上研究结果皆与本试验结果一致。
3.3 微生态制剂对产蛋后期种母鸡小肠消化吸收能力的影响饲粮进入十二指肠后，与肠内分泌的消化酶形成食糜一起进入小肠，在小肠绒毛的作用下进行全面而强烈的消化作用。肠道黏膜结构与消化吸收功能是保证种母鸡健康高效消化吸收营养物质的必要条件。产蛋后期种母鸡的肠道消化酶活性下降，绒腺比降低，营养物质的吸收利用率减少，从而影响其生产性能[30]。研究表明，微生物定植与肠道发育密切相关，这种影响将决定机体的生长性能和健康状况[31-32]。枯草芽孢杆菌在肠内可产生多种消化酶，分解蛋白质，促进肠道内营养物质的消化吸收[33]。本试验结果表明，副干酪乳杆菌KL1和枯草芽孢杆菌Liu-c1复合微生态制剂可显著提高十二指肠中性蛋白酶和鸡胰蛋白酶活性，增加十二指肠绒腺比，促进肠道对饲粮中粗蛋白质的消化吸收，从而提高生产性能。Xing等[34]研究在产蛋后期京粉1号种母鸡饲粮中添加107 CFU/(只·d)凝结芽孢杆菌可显著提高蛋鸡十二指肠黏膜蛋白酶活性，促进营养物质的消化吸收，提高生产性能。Lei等[13]研究发现蛋鸡饲粮中添加108 CFU/(只·d)枯草芽孢杆菌制剂显著增加了十二指肠和回肠的绒毛高度，降低隐窝深度，改善绒毛形态，增强肠道吸收功能，从而提高蛋鸡的生产性能。黄晨轩等[11]在蛋鸡饲粮中添加108 CFU/(只·d)芽孢杆菌微生态制剂显著增加产蛋后期蛋鸡的粗蛋白质表观消化率，提高蛋鸡的生产性能。本试验通过添加复合微生态制剂增加产蛋后期种母鸡的肠内蛋白酶活性，从而显著提高粗蛋白质表观消化率，但其消化率总体偏低，可能原因是产蛋后期种母鸡羽毛易脱落，细小绒毛掺杂在粪便中难以分离，故导致粪样中粗蛋白质含量偏高而使其消化率结果偏低。
4 结论京红1号父母代产蛋后期种母鸡饲粮中添加副干酪乳杆菌KL1、枯草芽孢杆菌Liu-c1和复合微生态制剂皆能增加回肠有益菌的数量，调节肠道菌群平衡，提高十二指肠中性蛋白酶和胰蛋白酶活性，增加十二指肠和回肠绒腺比，提高饲粮中粗蛋白质表观消化率，从而提高种母鸡的产蛋率和种蛋合格率，降低料蛋比，其中以复合微生态制剂效果最佳。
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