2. 农业部华南水产与畜禽饲料重点实验室, 湛江 524088
2. Key Laboratory of Aquatic and Livestock Feed in South China, Ministry of Agriculture, Zhanjiang 524088, China
珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂)是一种石斑鱼杂交品种，母本为褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)，父本为鞍带石斑鱼(Epinephelus lanceolatus)，其肉质细嫩、生长速度快、抗病力强，具有很大的潜在市场价值[1]。近年来，由于水产养殖集约化和水质污染等原因，导致水产病害频发，石斑鱼产业遭受了巨大的经济损失[2]。使用抗生素是水产养殖中防治病害的常用方式，但由于药物残留以及不正当使用等原因，抗生素易导致水产品品质受损，环境被污染，甚至危害人类健康[3]。许多科研人员致力于寻求替代抗生素的物质，推广绿色添加剂已经成为养殖业发展的必然趋势。寡糖类物质被认为是替代抗生素较为理想的产品[4]。
寡糖，又称低聚糖，是一种具有2~20个糖单位的碳水化合物，糖单位间通过糖苷键连接而成。孙青云等[5]研究表明，寡糖能降低动物肠道pH、促进矿物质吸收、促进动物肠道内健康微生物菌群形成和提高动物机体免疫力。而甘露寡糖(mannan-oligosaccharides，MOS)作为一类从酵母细胞壁提取出来的葡萄糖-甘露寡糖蛋白复合物，能参与多种生物功能和多种生理过程，具有吸附病原菌的功能[6]。在家禽[7]和仔猪[8]等动物中已发现，甘露寡糖可通过提高机体肠道的微生态状况，减少胃肠道疾病，从而提高动物免疫功能。甘露寡糖作为绿色添加剂在水产动物研究较为广泛，可以提高水产动物生长性能，优化肠道菌群，促进肠道发育，提高水产动物免疫功能，在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[9]、大黄鱼(Larimichthys crocea)[10]、奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×Oreochromis aureus)[11]、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)[12]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)[13]、欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)[14]等物种的养殖中均有应用。甘露寡糖在水产动物健康养殖中的积极作用已被广泛证实，但是大多从动物生长性能、生理生化和组织形态改变等宏观层面进行考察，利用高通量测序技术从转录组和肠道菌群方面对甘露寡糖功能进行的研究还不多见。
高通量测序已经成为一种常规的试验技术用于生命科学领域，包括转录水平和肠道菌群分析等。转录组测序(RNA-seq)利用高通量测序来全面快速地获得特定细胞或组织在某一状态下几乎所有转录本的序列信息和表达信息，准确地分析基因表达差异、结构变异和分子标记等生命科学的重要问题[15]。基于16S rRNA基因高通量测序已成为动物肠道菌群结构的形成及多样性分析的常用技术[16]。在水产动物中，高通量测序也已经被广泛应用于转录组和肠道菌群分析，用以研究生长、发育、免疫等相关生命活动的作用机制[17-18]。目前，转录组测序和肠道菌群分析已被用于石斑鱼生长调控、免疫调节等相关的作用机制研究。王登东等[19]和张海艳等[20]采用转录组测序分别分析了云龙石斑鱼杂交生长优势形成的机制和β-葡聚糖调节鱼类免疫系统的作用机制。Ye等[21-22]采用16S rRNA高通量测序发现了花生粕和脱酚棉籽蛋白对珍珠龙胆石斑鱼生长和肠道健康的影响作用。
甘露寡糖已被用于石斑鱼养殖中。Ren等[23]从免疫相关酶活性、免疫相关基因表达、肠道切片以及生长性能等方面研究珍珠龙胆石斑鱼幼鱼，结果表明饲料中添加甘露寡糖料不能改善珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的生长性能和饲料利用率，但可以通过改善肠道形态完整性、增强抗氧化能力和非特异性免疫、增加免疫相关基因表达、降低肠道和肝脏中凋亡相关基因的表达来促进肠道健康和维持免疫状态。研究发现，多种鱼类消化道内某些细菌能产生淀粉酶、蛋白质水解酶、脂肪分解酶等胞外酶，用以促进鱼类消化脂肪、蛋白质、淀粉等营养物质的能力，进而提高营养物质的利用率[18]。目前为止，利用高通量测序分析甘露寡糖对石斑鱼影响的研究暂未有报道。基于此，本研究选取珍珠龙胆石斑鱼为研究对象，研究饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、血清免疫指标、转录组及肠道菌群的影响，以探究甘露寡糖调控珍珠龙胆石斑鱼免疫的作用机理，为水产饲料行业寻求替代抗生素的物质提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲料以鱼粉、豆粕、玉米蛋白粉为主要蛋白质源，以鱼油、玉米油为主要脂肪源，配制基础饲料，基础饲料组成及营养水平见表 1。对照组饲喂基础饲料，甘露寡糖组在基础饲料中添加100 mg/kg甘露寡糖。甘露寡糖购自青岛某生物技术有限公司，甘露寡糖添加量参照于朝磊等[9]、Ren等[23]、徐磊等[24]的研究。试验饲料具体制作及营养成分分析方法参照本实验室Ye等[22]、Liu等[25]的研究。
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表 1 基础饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验用鱼来源于湛江市南三岛商业养殖基地，购回后于4.5 m×4.9 m×1.8 m的室外水泥池暂养2周，以适应试验条件。试验在玻璃钢桶(0.5 m3)中进行，挑选240尾初始平均体重为(6.00±0.32) g的体质健壮无病的幼鱼，随机分为2组，每组3个重复，每个重复40尾鱼，养殖8周。养殖过程中，每天分别于08:00和17:00按照鱼体重的3%~5%进行饱食投喂2次(第1颗饲料沉入桶底未被摄食视为饱食)，投喂量依据摄食情况和天气变化调整。具体养殖条件为：水体温度28~30 ℃，盐度21%~24%，溶氧量≥6.8 mg/L。每天按照换养殖水体1/3的水量换水1次。
1.3 样品采集试验用鱼在养殖期结束后禁食24 h。记录存活尾数、体重和体长，以进行生长性能分析。从每个重复中随机取8尾鱼，丁香酚麻醉后采用尾静脉取血法抽取全血，每尾鱼抽取1 mL后混合。按照海水鱼淋巴细胞分离液试剂盒(产品编号：P9980，北京索莱宝科技有限公司始)说明书进行操作，得到血细胞和血清样品，于-80 ℃保存待测。其中，对照组和甘露寡糖组中3个重复的血细胞样品分别混合后用于转录组测序，每组中每个重复的血清样品分别用于免疫指标测定。另外，每个重复随机取4尾鱼，取剥离肠道外脂肪组织的后肠混合成为1个样品，置于液氮后于-80 ℃保存待测，用于肠道菌群测定。
1.4 生长性能分析选用存活率(survival rate，SR)、增重率(weight gain rate，WGR)、特定生长率(specific growth rate，SGR)、肥满度(condition factor，CF)、饲料系数(feed coefficient rate，FCR)作为生长性能指标，参照Ye等[22]和Liu等[25]的研究，分别按以下公式计算：
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选用超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、溶菌酶(lysozyme，LZM)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)作为血清免疫指标进行检测。血清SOD、CAT、ACP、AKP、LZM活性和MDA含量分别采用南京建成生物工程研究所生产的SOD(产品编号：A001-3-2)、CAT(产品编号：A007-1-1)、ACP(产品编号：A060-2-1)、AKP(产品编号：A059-2-2)、LZM(产品编号：A050-1-1)、MDA(产品编号：A003-1-2)试剂盒进行测定。
1.6 血细胞转录组分析采用TRIzol试剂盒(Invitrogen公司，美国)提取样品总RNA后，委托广州基迪奥生物科技有限公司完成文库的构建和测序工作，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM进行测序。去除测序接头和低质量的序列数据过滤原始数据后，采用Trinity Assembly Software软件进行转录本拼接并聚类，取最长转录本为非重复序列基因(Unigene)进行质量评估和统计。所有Unigene分别在6个数据库中进行比对，其中包括Nr、KEGG、Swissprot和KOG数据库。利用错误发现率(false discovery rate，FDR)和log2差异倍数(fold change，FC)来进行筛选，筛选条件为FDR < 0.05且|log2FC|>1。对基因进行定量和差异分析，取差异显著的基因用于KEGG和GO富集分析。
1.7 肠道菌群分析鱼肠道细菌总DNA的提取采用美国HipurtePowerSoil®的DNA Isolation Kit完成。具体操作方法参照本实验室Ye等[21]的研究。获得总DNA后委托广州赛哲生物科技股份有限公司进行具体分析工作，用Hiseq PE250(Illumina公司，美国)测序平台进行建库与测序。采用Hiseq PE250测序策略，过滤数据中的嘈杂序列，并以97%序列相似性阈值进行聚类。基于获得的Clean Tags做操作分类单元(OTU)分析，同时进行物种注释，计算OUT数量、Shannon指数、Simpson指数、Chao1指数和Ace指数等α多样性指数，并进行主坐标分析(PCoA)。
1.8 统计分析采用SPSS 20.0统计软件对数据进行非配对样本t检验分析，试验数据以平均值±标准误(mean±SE)表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响如表 2所示，甘露寡糖组珍珠龙胆石斑鱼的终末体重、WGR、SGR和CF均显著高于对照组(P < 0.05)。甘露寡糖组和对照组之间珍珠龙胆石斑鱼的FCR和SR无显著差异(P>0.05)。
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表 2 饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼生长性能的影响 Table 2 Effects of dietary MOS on growth performance of Epinephelus fuscoguttatus ♀× Epinephelus lanceolatus ♂ (n=3) |
如表 3所示，与对照组相比，甘露寡糖组珍珠龙胆石斑鱼的血清SOD、CAT、LZM和AKP活性均显著升高(P < 0.05)，血清MDA含量显著降低(P < 0.05)。甘露寡糖组和对照组之间珍珠龙胆石斑鱼的血清ACP活性无显著差异(P>0.05)。
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表 3 饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼血清免疫指标的影响 Table 3 Effects of dietary MOS on serum immune indices of Epinephelus fuscoguttatus ♀× Epinephelus lanceolatus ♂ (n=3) |
利用Illumina平台进行测序，如表 4所示，除去衔接子并过滤了低质量序列后留下了高质量碱基(clean bases)合计为14 462 786 068 nt。从原始读长(raw reads)滤过后得到97 715 428个高质量读长(clean reads)。其中，对照组从47 953 578个原始读长中产生了46 493 708个高质量读长，甘露寡糖组从52 713 580个原始读长中产生了51 221 720个高质量读长。
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表 4 转录组测序数据统计 Table 4 Transcriptome sequencing data statistics |
如表 5所示，通过Trinity软件组装获得总长度为74 614 602 nt，Unigene总数为79 291个，Unigene平均长度为941 bp，N50长度为2 141 bp，N90长度为318 bp。
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表 5 转录组组装数据统计 Table 5 Statistics of transcriptome assembly data |
进一步对Unigene做质量评估，作长度分布统计图，如图 1所示，长度小于1 000 bp的Unigene较集中分布在2 700~2 999 nt区间；长度大于1 000 bp的Unigene有63 455个，占总数80.03%。组装结果表明测序质量良好。
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图 1 Unigene序列长度统计 Fig. 1 Unigene sequence length statistics |
如图 2所示，通过对组装的测序结果分析，一共注释到28 811个Unigene，占比36.34%。其中，在Nr、KEGG、Swissprot和KOG数据库中分别注释到28 664、14 866、19 668和16 506个Unigene。将组装获得的Unigene在Nr数据库中进行比对分析，结果显示注释最多的5个物种分别为大黄鱼(Larimichthys crocea)(6 381个，22.26%)、盲曹鱼(Lates calcarifer)(6 335个，22.10%)、斑马鱼(Stegastes partitus)(2 493个，8.70%)、革首南极鱼(Notothenia coriiceps)(1 578个，5.51%)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)(1 128个，3.94%)。
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图 2 转录组中Unigene的注释 Fig. 2 Annotation of Unigene from transcriptome |
如图 3所示，KOG注释结果显示，32 518个Unigene聚类被分为25个功能类别。Unigene在一般功能预测(general function prediction only)、信号转导(singnal transduction)和翻译后药物、蛋白质转换、伴侣(posttranslational medication, protein turnover, chaperones)3个功能类别中富集最多，含有Unigene数目分别为6 347、6 108和3 129个，分别占比19.52%、18.78%和9.62%。其中，富集于细胞运动(cell motility)功能上的Unigene最少，只有88个。
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图 3 KOG聚类分析图 Fig. 3 KOG cluster analysis diagram |
如图 4所示，通过Blast2GO软件得到Unigene的GO注释信息，分别有17 795、7 625和9 745个Unigene注释到参与到生物过程(biological process)、分子功能(molecular function)和细胞组成(cell component)中。在生物过程一类中，Unigene主要注释到细胞过程(cell process)和新陈代谢过程(metabolic process)，分别有4 026和3 557个Unigene。在分子功能一类中，Unigene主要注释到催化活性(catalytic activity)(2 988个Unigene)和结合(binding)，分别有2 988和3 499个Unigene。在细胞组成一类中，Unigene主要注释到细胞(cell)和细胞部分(cell part)，均有2 130个Unigene。
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图 4 Unigene的GO分类 Fig. 4 GO classification of Unigene |
根据KEGG注释信息可知，总共6 912个Unigene注释到5个特定的通路中，包括生物系统(organism system)、环境信息处理(environmental information processing)、遗传信息处理(genetic information processing)、代谢(mentabolism)和细胞过程。
2.3.3 差异表达基因(differentially expressed gene，DEG)分析以FDR < 0.05且|log2FC|>1为条件筛选甘露寡糖组和对照组之间DEG，结果如图 5所示，一共鉴定出9 964个DEG，包含3 801个上调表达基因和6 163个下调表达基因。
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横坐标表示差异倍数对数值，纵坐标表示FDR的负Log10值。 The abscissa represented the logarithm value of difference multiple, and the ordinate represented the negative log10 value of FDR. 图 5 差异表达基因的火山图 Fig. 5 Volcano map of DEG |
DEG的GO功能富集分析结果如图 6所示，分别有5 592、3 131和5 274个Unigene注释到参与的生物过程、细胞组成和分子功能中。在生物过程一类中，富集到细胞过程的DEG数目最多(72.59%显著下调)，其次为新陈代谢过程、单一生物代谢过程。在细胞组成一类中，富集到膜和膜部分中的DEG数目最多，其中膜有53.85%显著下调，膜部分有47.34%显著下调。在分子功能一类中，富集到结合中的DEG数目最多，有66.98%显著下调。
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图 6 差异表达基因的GO功能富集分析 Fig. 6 GO functional enrichment analysis of DEG |
DEG的KEEG富集分析如图 7所示，共有741个DEG被注释到171个通路中，甘露寡糖和对照组之间差异最大的20条KEGG富集通路中，与新陈代谢有关且差异显著的信号通路有11个，分别为烟酸与烟酰胺代谢(nicotinate and nicotinamide metabolism)、精氨酸生物合成(arginine biosynthesis)、微生物在不同环境中的代谢(microbial metabolism in diverse environments)、泛酸与CoA生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)、初级胆汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)、酪氨酸代谢(tyrosine metabolism)、芳香族化合物的降解(degradation of aromatic compounds)、D-谷氨酰胺与D-谷氨酸代谢(D-glutamine and D-glutamate metabolism)、亚油酸代谢(linoleic acid metabolism)、碳代谢(carbon metabolism)、初级胆汁酸生物合成(primary bile acid biosynthesis)。与免疫有关且差异显著的信号通路有4个，分别为吞噬体(phagosome)、细胞黏附分子(cell adhesion molecules)、细胞因子-细胞因子受体相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、免疫球蛋白A产生的肠道免疫网络(intestinal immune network for IgA production)。其中，吞噬体和细胞黏附分子信号通路为显著富集DEG数目最多的2条信号通路，含有DEG数目分别为52和46个。此外，细胞因子-细胞因子受体相互作用信号通路中显著富集的DEG数目有34个，免疫球蛋白A产生的肠道免疫网络信号通路中显著富集的DEG数目有13个。
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图 7 差异表达基因KEGG富集分析 Fig. 7 KEGG enrichment analysis of DEG |
珍珠龙胆石斑鱼肠道菌群α多样性分析如表 6所示，甘露寡糖组珍珠龙胆石斑鱼肠道菌群的OTU数量、Ace指数、Chao1指数和Shannon指数均显著高于对照组(P < 0.05)，甘露寡糖组和对照组之间Simpson指数无显著差异(P＞0.05)。
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表 6 珍珠龙胆石斑鱼肠道菌群α多样性分析 Table 6 Alpha diversity analysis of intestinal microflora of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus (n=3) |
基于加权Bray-Curtis距离进行的PCoA如图 8所示，2个PCoA轴占2组之间变异的80.09%。甘露寡糖组在图的下方，靠近主坐标(PCo1)，占总变化的71.52%。β多样性分析结果表明不同处理可显著影响肠道菌群的组成。
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图 8 主坐标分析 Fig. 8 PCoA |
珍珠龙胆石斑鱼肠道门水平菌群组成如图 9所示，在门水平上，对照组和甘露寡糖组珍珠龙胆石斑鱼肠道中的菌群组成相同，包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)，四者总相对丰度都超过了98%，还有部分未鉴定出及相对丰度极少的门类。不同门类菌群在2组中相对丰度有差异，甘露寡糖组中变形菌门相对丰度小于对照组，而拟杆菌门、蓝藻门、厚壁菌门相对丰度高于对照组，其中，甘露寡糖组拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著高于对照组(P < 0.05)。
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A：单个样品中菌群相对丰度；B：不同组中菌群的平均相对丰度；C：优势菌群相对丰度比较。*代表与对照组差异显著(P < 0.05)。下表同。 A: microflora relative abundance of single sample; B: microflora mean relative abundance of indifferent groups; C: comparison of dominant microflora relative abundance. * mean significant difference compared with the control group (P < 0.05). The same as below. 图 9 珍珠龙胆石斑鱼肠道门水平菌群组成 Fig. 9 Intestinal microflora composition at phylum level of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ |
如图 10所示，在属水平上，对照组和甘露寡糖组珍珠龙胆石斑鱼肠道中菌群组成相同，包括无色杆菌属(Achromobacter)、德沃斯氏菌属(Devosia)、盐单胞菌属(Halomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、发光杆菌属(Photobacterium)、红游动菌属(Rhodoplanes)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。与对照组相比，甘露寡糖组中发光杆菌属相对丰度显著下降(P < 0.05)，而德沃斯氏菌属、盐单胞菌属和甲基杆菌属相对丰度显著升高(P < 0.05)。
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图 10 珍珠龙胆石斑鱼肠道属水平菌群组成 Fig. 10 Intestinal microflora composition at genus level of Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂ |
基于国内外研究，饲料中添加甘露寡糖对畜禽类动物幼体有促进生长的作用[8, 26]。而饲料中添加适宜的甘露寡糖是否能够有效促进水产动物生长性能尚存在较大的争议[23]。Lu等[27]研究发现，饲料中添加不同水平的甘露寡糖可提高草鱼(Ctenopharyngodon idella)幼鱼终末体重和WGR。马志红等[28]研究发现，饲料中添加1 g/kg甘露寡糖添能显著提高鲤鱼(Cyprinus carpio)的WGR，降低FCR。高瞻[29]研究表明，饲料中添加甘露寡糖可以降低花鲈(Lateolabrax japonicas)机体水分含量，同时提高机体粗脂肪和粗蛋白质含量，有效改善鱼肉的品质，提高WGR，降低FCR。本试验中，饲料中添加100 mg/kg甘露寡糖显著提高了珍珠龙胆石斑鱼的终末体重、WGR、SGR和CF，但对SR和FCR无显著影响。但是，Ren等[23]在饲料中添加甘露寡糖的研究表明，添加0.3%~2.0%的甘露寡糖对龙虎斑的生长性能均无显著影响，这可能与甘露寡糖的添加量有直接关系，0.3%~2.0%的甘露寡糖添加量与其他研究相比，明显高出许多。总体而言，上述研究表明，尽管养殖品种有所差异，饲料中添加适量的甘露寡糖可显著提高动物的生长性能。
3.2 饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼血清免疫指标的影响SOD可催化氧自由基对过氧化氢和分子氧的歧化作用，提高吞噬细胞防御功能，在动物机体抗氧化防御系统中起重要作用[30]。LZM是一种水解N-乙酰壁酸和N-乙酰葡糖胺的酶，是生物体内重要的免疫因子之一，已在鱼类组织、血清和黏液中发现，并且大量存在于血细胞中。AKP是一种非特异性磷酸水解酶，可催化磷酸单脂的水解，促进磷酸基团的转移反应，在动物代谢中发挥重要调控作用[31]。CAT可清除细胞内活性氧自由基，是一种保护细胞膜结构完整的酶类[32]。甘露寡糖具有抗原的特性，能够刺激动物机体做出免疫应答反应[30]。本试验中，饲料中添加甘露寡糖显著提高了珍珠龙胆石斑鱼血清中SOD、AKP、LZM和CAT活性。与本试验结果一致的是，饲料中添加甘露寡糖显著提高半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)稚鱼体内SOD、CAT和LZM活性，提高肠道发育和非特异性免疫水平[9]；饲料中添加0.2%~0.3%魔芋甘露寡糖可以显著增强黄颡鱼血清SOD和LZM活性，增加其免疫器官指数[33]；杨敏等[14]在饲料中添加适宜的甘露寡糖，可显著提高欧洲鳗鲡血清SOD、AKP、LZM活性。刘爱君等[11]研究发现，饲料中添加甘露寡糖能显著提高奥尼罗非鱼血清SOD和AKP活性。MDA是一种有害物质，其含量的升高是氧自由基过多产生的一种反应，损害细胞膜的流动性，MDA含量降低表明对机体产生的毒性降低。此外，在本研究中，甘露聚糖组珍珠龙胆石斑鱼血清MDA含量较对照组显著降低，这与Lu等[27]在草鱼中的研究结果一致。上述研究都表明饲料中添加甘露寡糖能在一定程度提高动物机体的免疫相关酶活性，从而提高动物免疫功能。
3.3 饲料中添加甘露聚糖对珍珠龙胆石斑鱼血细胞转录组的影响转录组研究可基于特定条件下基因的表达信息来推测未知基因的功能，进而揭示基因在相应通路中的作用机制。在鱼类中，转录组测序已被广泛应用，主要用途包括检测基因功能、筛选DEG及开发分子标记等。例如张海艳等[20]对β-葡聚糖刺激下斜带石斑鱼转录组进行了分析，获得了DEG以及免疫相关条目，并筛选出部分显著性差异表达的免疫基因。石立冬等[34]研究牛磺酸对红鳍东方鲀的热应激调控的影响，获得了DEG的数据以及DEG注释的具体通路，为研究牛磺酸对红鳍东方鲀的热应激调控的影响和牛磺酸抗应激功能提供参考数据。朱婷芳等[35]对大弹涂鱼单核巨噬细胞低氧胁迫比较转录组学分析，获得了不同时间巨噬细胞转录组数据，并且筛选出了相关DEG。珍珠龙胆石斑鱼作为重要的海水养殖品种，其全基因序列还未公布，从基因水平研究饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫保护机制存在限制。本研究通过转录组测序技术，鉴定出DEG显著影响了鱼体细胞组成、细胞代谢过程和分子功能等方面，这些改变暗示了细胞组织结构与功能可能发生了重大改变。本研究中发现具有最多Unigene的条目是结合、催化活性、细胞过程、代谢过程和细胞组成，这些过程对机体正常生命活动很重要。此外，KEEG通路富集分析发现，DEG被注释到171个通路中，与免疫紧密相关的吞噬体通路、细胞黏附因子通路、细胞因子-细胞因子受体通路以及免疫球蛋白A产生的肠道免疫网络通路差异显著，且显著富集的DEG数目较多，其中吞噬体通路和细胞黏附因子通路是显著富集DEG数目最多的2条信号通路，这些结果提示甘露寡糖的添加对珍珠龙胆石斑鱼的免疫功能产生了显著影响。吞噬体是通过吞噬固有免疫细胞摄取颗粒而形成的高度动态的细胞器，在微生物清除和抗原呈递中发挥关键作用[36]。细胞黏附分子是介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互接触和结合分子的统称，以受体-配体结合的形式发挥作用，参与多种细胞活动，是免疫应答、炎症发生等重要生理病理过程的分子基础[37]。细胞因子是指主要由免疫细胞分泌的小分子多肽，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长等多种功能，其发挥作用是通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部而完成的，在免疫应答过程中发挥重要调节作用[38]。由此可见，饲料中添加甘露寡糖调控珍珠龙胆石斑鱼的免疫功能的可能机制是甘露寡糖的摄入激活鱼体内免疫细胞中吞噬体的产生，进而通过细胞黏附分子信号通路将信号传递，刺激产生细胞因子，起到免疫调节作用。这一机制在单胃动物的研究中已被提出[39]，但在鱼类中还有待进一步证实。
3.4 饲料中添加甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼肠道菌群的影响肠道本身具有重要的功能，肠道微生物的作用也不可忽视，肠道有益菌群具有营养、免疫、抑制病原菌、定植阻抗等作用[40]，而有害菌会使黏膜层渗透性增加，让病原和食物大分子穿过黏膜屏障[41]。肠道微生物对鱼类的健康也发挥重要作用。在斑马鱼(Danio rerio)中，肠道微生物可以调节消化道基因的表达，促进营养代谢和免疫反应[42]。在人类及其他哺乳动物、爬行动物蛇[43]和蜥蜴[44]、青石斑鱼[45]肠道菌群中，厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌群，其中的大部分细菌参与了食物的消化和代谢。本研究中，饲料中添加甘露寡糖后，珍珠龙胆石斑鱼肠道中拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度较对照组显著升高。拟杆菌门和厚壁菌门是人类肠道内的优势有益菌，结合本研究中甘露寡糖对珍珠龙胆石斑鱼免疫的促进作用可知，饲料中添加甘露寡糖可能通过提高珍珠龙胆石斑鱼肠道中有益菌的相对丰度进而使其免疫功能得到提高，这一结果与谭蓉等[46]的研究结果中肠道炎症伴随着拟杆菌门相对丰度的下降相吻合。饲料中添加甘露寡糖后珍珠龙胆石斑鱼肠道菌群在属水平上相对丰度的变化也进一步说明了这一点。与对照组相比，甘露寡糖组石斑鱼肠道中发光杆菌属相对丰度显著下降，而德沃斯氏菌属、盐单胞菌属和甲基杆菌属相对丰度显著升高。发光杆菌属属于弧菌科，由弧菌属细菌引起的疾病是目前水产养殖中危害最大的细菌性疾病[47]。德沃斯氏菌属、盐单胞菌属和甲基杆菌属则是3种已知的益生菌[48]。类似地，王琨等[49]、何远法等[50]和张琴等[51]分别在牙鲆、对虾凡纳滨和刺参中研究发现，饲料中添加甘露寡糖可显著降低肠道弧菌的数量。综合而言，本研究结果表明甘露寡糖可通过调节肠道菌群平衡来提高珍珠龙胆石斑鱼免疫功能，该结果与转录组测序结果相吻合，转录组测序结果表明，免疫球蛋白A产生的肠道免疫网络相关信号通路被显著激活，这也为深入研究甘露寡糖提高鱼类免疫力的作用机制提供了重要参考。
4 结论饲料中添加100 mg/kg甘露寡糖可以改善珍珠龙胆石斑鱼的生长性能和肠道菌群结构，提高机体免疫功能，并在转录组水平产生有利的免疫应答效应。
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CHU K I C, SHALEH S R M, AKAZAWA N, et al. Egg and larval development of a new hybrid orange-spotted grouper Epinephelus coioides×giant grouper E. lanceolatus[J]. Aquaculture Science, 2010, 58(1): 1-10. |
| [2] |
罗鸣, 陈傅晓, 刘龙龙, 等. 我国石斑鱼养殖疾病的研究进展[J]. 水产科学, 2013, 32(9): 549-554. LUO M, CHEN F X, LIU L L, et al. Progress in disease research of grouper aquaculture in China[J]. Fisheries Science, 2013, 32(9): 549-554 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1003-1111.2013.09.010 |
| [3] |
CABELLO F C. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a growing problem for human and animal health and for the environment[J]. Environmental Microbiology, 2006, 8(7): 1137-1144. DOI:10.1111/j.1462-2920.2006.01054.x |
| [4] |
陈勇江, 王金荣, 苏兰利, 等. 甘露寡糖的作用机制及其在动物生产中的应用[J]. 饲料研究, 2019, 42(1): 118-120. CHEN Y J, WANG J R, SU L L, et al. Mechanism of manno-oligosaccharide and its application in animal production[J]. Feed Research, 2019, 42(1): 118-120 (in Chinese). |
| [5] |
孙青云, 赵敏孟, 吕鑫, 等. 功能性寡糖调控动物肠道健康机理的研究进展[J]. 饲料工业, 2021, 42(3): 8-12. SUN Q Y, ZHAO M M, LV X, et al. Advancement on the mechanism of functional oligosaccharides improve animals intestinal health[J]. Feed Industry, 2021, 42(3): 8-12 (in Chinese). |
| [6] |
杨建松, 曾雨雷, 黄鑫. 酵母细胞壁在动物养殖中的应用[J]. 饲料工业, 2015, 36(6): 62-64. YANG J S, ZENG Y L, HUANG X, et al. Application of yeast cell wall in the animal breeding[J]. Feed Industry, 2015, 36(6): 62-64 (in Chinese). |
| [7] |
孟凡生, 朱风华, 陈甫, 等. 霉变饲料中添加酯化葡甘露聚糖对肉鸡肝脏霉菌毒素含量和免疫功能的影响[J]. 中国饲料, 2017(12): 32-36. MENG F S, ZHU F H, CHEN F, et al. Effect of esterified glucomannan added in the moldy feed on the content of mycotoxin in liver and immune function of the broiler chickens[J]. China Feed, 2017(12): 32-36 (in Chinese). |
| [8] |
钟晓霞, 黄健, 刘志云, 等. 甘露寡糖和复合益生菌对断奶仔猪生长性能及肠道形态结构、挥发性脂肪酸含量和菌群结构的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(7): 3099-3108. ZHONG X X, HUANG J, LIU Z Y, et al. Effects of mannan oligosaccharides and complex probiotics on growth performance and intestinal morphology, volatile fatty acid contents and microbial structure of weaned piglets[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(7): 3099-3108 (in Chinese). |
| [9] |
于朝磊, 常青, 吕云云. 甘露寡糖对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)稚鱼生长、肠道发育和非特异性免疫水平的影响[J]. 渔业科学进展, 2014, 35(6): 53-59. YU C L, CHANG Q, LV Y Y, et al. Effects of mannan oligosaccharide on the growth, intestinal development and non-specific immunity of tongue sole (Cynoglossus semilaevis Günther) postlarvae[J]. Progress in Fishery Sciences, 2014, 35(6): 53-59 (in Chinese). |
| [10] |
张炎灼, 张蕉南, 胡兵, 等. 饲料中添加甘露寡糖对大黄鱼幼鱼生长性能的影响[J]. 饲料工业, 2014, 35(18): 30-33. ZHANG Y Z, ZHANG J N, HU B, et al. Effects of dietary mannan-oligosaccharide on growth performance of juvenile large yellow croaker (Pseudosciaena crocea)[J]. Feed Industry, 2014, 35(18): 30-33 (in Chinese). |
| [11] |
刘爱君, 冷向军, 李小勤, 等. 甘露寡糖对奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)生长、肠道结构和非特异性免疫的影响[J]. 浙江大学学报(农业与生命科学版), 2009, 35(3): 329-336. LIU A J, LENG X J, LI X Q, et al. Effect of mannan oligosaccharides on growth performance, intestinal structure and nonspecific immunity of tilapia, Oreochromis niloticus×O. aureus[J]. Journal of Zhejiang University (Agriculture & Life Sciences), 2009, 35(3): 329-336 (in Chinese). |
| [12] |
苏健. 甘露寡糖对泥鳅生产性能、肠道菌群和非特异性免疫功能的影响[D]. 硕士学位论文. 雅安: 四川农业大学, 2013. SU J. Effects of mannose-oligosaccharides on growth performance, intestinal microflora and non-specific immunity function of loach (Misgurnus anguillicadatus)[D]. Master's Thesis. Ya'an: Sichuan Agricultural University, 2013. (in Chinese) |
| [13] |
周露阳, 叶元土, 蔡春芳, 等. 无鱼粉日粮条件下黄颡鱼生长性能和肝胰脏转录组差异表达的研究[J]. 海洋科学, 2019, 43(12): 97-109. ZHOU L Y, YE Y T, CAI C F, et al. Fishmeal-free diet can reduce the growth performance and the hepatopancreas transcriptional significant differential expression of yellow catfish, Pelteobagrus fulvidraco[J]. Marine Sciences, 2019, 43(12): 97-109 (in Chinese). DOI:10.11759/hykx20190517002 |
| [14] |
杨敏, 黎中宝, 卢静, 等. 甘露寡糖对欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)生长、消化酶活性及非特异性免疫的影响[J]. 中国渔业质量与标准, 2016, 6(6): 40-46. YANG M, LI Z B, LU J, et al. Effect of mannan oligosaccharides on growth performance, activities of digestive enzymes and nonspecific immunity response in Anguilla anguilla[J]. Chinese Fishery Quality and Standards, 2016, 6(6): 40-46 (in Chinese). |
| [15] |
LIAO X Z, WANG C G, WANG B, et al. Comparative transcriptome analysis of Litopenaeus vannamei reveals that triosephosphate isomerase-like genes play an important role during decapod iridescent virus 1 infection[J]. Frontiers in Immunology, 2020, 11: 1904. DOI:10.3389/fimmu.2020.01904 |
| [16] |
MURDOCH C C, RAWLS J F. Commensal microbiota regulate vertebrate innate immunity-insights from the zebrafish[J]. Frontiers in Immunology, 2019, 10: 2100. DOI:10.3389/fimmu.2019.02100 |
| [17] |
TARNECKI A M, BURGOS F A, RAY C L, et al. Fish intestinal microbiome: diversity and symbiosis unravelled by metagenomics[J]. Journal of Applied Microbiology, 2017, 123(1): 2-17. DOI:10.1111/jam.13415 |
| [18] |
米海峰, 孙瑞健, 张璐, 等. 鱼类肠道健康研究进展[J]. 中国饲料, 2015(15): 19-22. MI H F, SUN R J, ZHANG L, et al. Review on the intestinal health of fish[J]. China Feed, 2015(15): 19-22 (in Chinese). |
| [19] |
王登东, 杨玉鹏, 郑乐云, 等. 云龙石斑鱼生长优势的转录组研究[J]. 海南热带海洋学院学报, 2019, 26(2): 1-8. WANG D D, YANG Y P, ZHENG L Y, et al. Transcriptomic studies of a novel hybrid "Yunlong grouper" on the growth superiorities[J]. Journal of Hainan Tropical Ocean University, 2019, 26(2): 1-8 (in Chinese). |
| [20] |
张海艳, 鲁义善, 汪志文, 等. β-葡聚糖刺激下的斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)转录组分析[J]. 基因组学与应用生物学, 2018, 37(1): 219-228. ZHANG H Y, LU Y S, WANG Z W, et al. Transcriptional analysis of orange-spotted grouper (Epinephelus coioides) stimulated by β-glucan[J]. Genomics and Applied Biology, 2018, 37(1): 219-228 (in Chinese). |
| [21] |
YE G L, DONG X H, YANG Q H, et al. Dietary replacement of fish meal with peanut meal in juvenile hybrid grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂): growth performance, immune response and intestinal microbiota[J]. Aquaculture Reports, 2020, 17: 100327. DOI:10.1016/j.aqrep.2020.100327 |
| [22] |
YE G L, DONG X H, YANG Q H, et al. Low-gossypol cottonseed protein concentrate used as a replacement of fish meal for juvenile hybrid grouper (Epinephelus fuscoguttatus ♀×Epinephelus lanceolatus ♂): effects on growth performance, immune responses and intestinal microbiota[J]. Aquaculture, 2020, 524: 735309. DOI:10.1016/j.aquaculture.2020.735309 |
| [23] |
REN Z L, WANG S F, CAI Y, et al. Effects of dietary mannan oligosaccharide supplementation on growth performance, antioxidant capacity, non-specific immunity and immune-related gene expression of juvenile hybrid grouper (Epinephelus lanceolatus ♂×Epinephelus fuscoguttatus ♀)[J]. Aquaculture, 2020, 523: 735195. DOI:10.1016/j.aquaculture.2020.735195 |
| [24] |
徐磊, 刘波, 谢骏, 等. 甘露寡糖对异育银鲫生长性能、免疫及HSP70基因表达的影响[J]. 水生生物学报, 2012, 36(4): 656-664. XU L, LIU B, XIE J, et al. Effect on mannose oligosaccharides on growth performance, immunity and HSP70 expression of juvenile crucian carps (Carassius auratas gibelio)[J]. Acta Hydrobiologica Sinica, 2012, 36(4): 656-664 (in Chinese). |
| [25] |
LIU H, DONG X H, TAN B P, et al. Effects of fish meal replacement by low-gossypol cottonseed meal on growth performance, digestive enzyme activity, intestine histology and inflammatory gene expression of silver sillago (Sillago sihama Forsskál) (1775)[J]. Aquaculture Nutrition, 2020, 26(5): 1724-1735. DOI:10.1111/anu.13123 |
| [26] |
HAJIAGHAPOUR M, REZAEIPOUR V. Comparison of two herbal essential oils, probiotic, and mannan-oligosaccharides on egg production, hatchability, serum metabolites, intestinal morphology, and microbiota activity of quail breeders[J]. Livestock Science, 2018, 210: 93-98. DOI:10.1016/j.livsci.2018.02.007 |
| [27] |
LU Z Y, FENG L, JIANG W D, et al. Mannan oligosaccharides improved growth performance and antioxidant capacity in the intestine of on-growing grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Aquaculture Reports, 2020, 17: 100313. DOI:10.1016/j.aqrep.2020.100313 |
| [28] |
马志红, 晋晶, 刘洪梅, 等. 甘露寡糖对鲤鱼生长性能和免疫功能的影响[J]. 安徽农业科学, 2010, 38(3): 1291-1292, 1296. MA Z H, JIN J, LIU H M, et al. Effects of mannose-oligosaccharides on the growth performance and immune function of carps[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2010, 38(3): 1291-1292, 1296 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2010.03.071 |
| [29] |
高瞻. 几种环保型添加剂对花鲈生长、消化及免疫性能的影响[D]. 硕士学位论文. 厦门: 集美大学, 2016. GAO Z. Effect of the environmental friendly additives on the growth performance, digestive enzyme activities and serum non-specific immunity of Lateolabrax japonicus[D]. Master's Thesis. Xiamen: Jimei University, 2016. (in Chinese) |
| [30] |
王铵静, 杨奇慧, 谭北平, 等. 大豆酶解蛋白对凡纳滨对虾幼虾生长性能、血清生化指标、非特异性免疫力和抗病力的影响[J]. 广东海洋大学学报, 2018, 38(1): 14-21. WANG A J, YANG Q H, TAN B P, et al. Effects of enzymolytic soybean meal on growth performance, serum biochemical indices, non-specific immunity and disease resistance of juvenile Litopenaeus vannamei[J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2018, 38(1): 14-21 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1673-9159.2018.01.003 |
| [31] |
张辉, 张海莲. 碱性磷酸酶在水产动物中的作用[J]. 河北渔业, 2003(5): 12-13, 32. ZHANG H, ZHANG H L. Role of alkaline phosphatase in aquatic animals[J]. Hebei Fisheries, 2003(5): 12-13, 32 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2003.05.005 |
| [32] |
蓝蔚青, 杨歆, 王蒙, 等. 壳聚糖对腐生葡萄球菌的作用机制[J]. 广东海洋大学学报, 2021, 41(1): 63-71. LAN W Q, YANG X, WANG M, et al. Mechanism of chitosan against Staphylococcus saprophytic[J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2021, 41(1): 63-71 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1673-9159.2021.01.009 |
| [33] |
于艳梅, 吴志新, 陈孝煊, 等. 魔芋甘露寡糖对黄颡鱼非特异性免疫功能及生长的影响[J]. 华中农业大学学报, 2010, 29(3): 351-355. YU Y M, WU Z X, CHEN X X, et al. Effect of konjac mannan oligosaccharides on non-specific immune function and growth of Pelteobagrus fulvidraco[J]. Journal of Huazhong Agricultural University, 2010, 29(3): 351-355 (in Chinese). |
| [34] |
石立冬, 翟浩杰, 卫力博, 等. 牛磺酸对红鳍东方鲀热应激转录调控机制的影响[J]. 中国水产科学, 2020, 27(10): 1145-1155. SHI L D, ZHAI H J, WEI L B, et al. Transcriptome analysis of the response mechanisms to acute heat stress with dietary taurine supplementation in Takifugu rubripes[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2020, 27(10): 1145-1155 (in Chinese). |
| [35] |
朱婷芳, 管峰, 苗亮, 等. 大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)单核巨噬细胞低氧胁迫比较转录组学分析[J]. 海洋与湖沼, 2020, 51(2): 335-344. ZHU T F, GUAN F, MIAO L, et al. Comparative transcriptome analysis of MO/MΦ in response to low oxygen stress in mudskipper Boleophthalmus pectinirostris[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica, 2020, 51(2): 335-344 (in Chinese). |
| [36] |
DEAN P, HEUNIS T, HÄRTLOVA A, et al. Regulation of phagosome functions by post-translational modifications: a new paradigm[J]. Current Opinion in Chemical Biology, 2019, 48: 73-80. DOI:10.1016/j.cbpa.2018.11.001 |
| [37] |
HARJUNPÄÄ H, LLORT ASENS M, GUENTHER C, et al. Cell adhesion molecules and their roles and regulation in the immune and tumor microenvironment[J]. Frontiers in Immunology, 2019, 10: 1078. DOI:10.3389/fimmu.2019.01078 |
| [38] |
PAN W Y, WANG Q X, CHEN Q M. The cytokine network involved in the host immune response to periodontitis[J]. International Journal of Oral Science, 2019, 11(3): 30. DOI:10.1038/s41368-019-0064-z |
| [39] |
IP W K E, TAKAHASHI K, EZEKOWITZ R A, et al. Mannose-binding lectin and innate immunity[J]. Immunological Reviews, 2009, 230(1): 9-21. DOI:10.1111/j.1600-065X.2009.00789.x |
| [40] |
宋增福, 吴天星. 鱼类肠道正常菌群研究进展[J]. 水产科学, 2007, 26(8): 471-474. SONG Z F, WU T X. Review on intestinal normal microflora in fish[J]. Fisheries Science, 2007, 26(8): 471-474 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1003-1111.2007.08.012 |
| [41] |
LEE D J, DRONGOWSKI R A, CORAN A G, et al. Evaluation of probiotic treatment in a neonatal animal model[J]. Pediatric Surgery International, 2000, 16(4): 237-242. DOI:10.1007/s003830050736 |
| [42] |
RAWLS J F, SAMUEL B S, GORDON J I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2004, 101(13): 4596-4601. DOI:10.1073/pnas.0400706101 |
| [43] |
COSTELLO E K, GORDON J I, SECOR S M, et al. Postprandial remodeling of the gut microbiota in Burmese pythons[J]. The ISME Journal, 2010, 4: 1375-1385. DOI:10.1038/ismej.2010.71 |
| [44] |
HONG P Y, WHEELER E, CANN I K O, et al. Phylogenetic analysis of the fecal microbial community in herbivorous land and marine iguanas of the Galápagos Islands using 16S rRNA-based pyrosequencing[J]. The ISME Journal, 2011, 5(9): 1461-1470. DOI:10.1038/ismej.2011.33 |
| [45] |
ZHOU Z G, LIU Y C, SHI P J, et al. Molecular characterization of the autochthonous microbiota in the gastrointestinal tract of adult yellow grouper (Epinephelus awoara) cultured in cages[J]. Aquaculture, 2009, 286(3/4): 184-189. |
| [46] |
谭蓉, 陈郑珊, 杨栋, 等. 肠道菌群介导高蛋白饮食引起小鼠肠道炎症研究[J]. 解放军预防医学杂志, 2020, 38(10): 81-83. TAN R, CHEN Z S, YANG D, et al. Intestinal flora mediated high protein diet induced intestinal inflammation in mice[J]. Journal of Preventive Medicine of Chinese People's Liberation Army, 2020, 38(10): 81-83 (in Chinese). |
| [47] |
FANG Y J, CHEN A P, DAI H, et al. Vibrio fujianensis sp. nov., isolated from aquaculture water[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2018, 68(4): 1146-1152. DOI:10.1099/ijsem.0.002642 |
| [48] |
KUEBUTORNYE F K A, ABARIKE E D, LU Y S, et al. Mechanisms and the role of probiotic Bacillus in mitigating fish pathogens in aquaculture[J]. Fish Physiology and Biochemistry, 2020, 46(3): 819-841. DOI:10.1007/s10695-019-00754-y |
| [49] |
王琨, 孙云章, 李富东, 等. 饲料中添加两种寡糖和一种芽孢杆菌对牙鲆肠道菌群的影响[J]. 大连海洋大学学报, 2011, 26(4): 299-305. WANG K, SUN Y Z, LI F D, et al. Effect of dietary fructo-and mannan oligosaccharides and Bacillus clausii on the intestinal microflora in Japanese flounder Paralichthys olivaceus[J]. Journal of Dalian Fisheries University, 2011, 26(4): 299-305 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1000-9957.2011.04.003 |
| [50] |
何远法, 迟淑艳, 谭北平, 等. 酵母培养物对凡纳滨对虾肠道菌群结构的影响[J]. 广东海洋大学学报, 2017, 37(4): 21-27. HE Y F, CHI S Y, TAN B P, et al. Effect of yeast culture on intestinal microbiota of Litopenaeus vannamei[J]. Journal of Guangdong Ocean University, 2017, 37(4): 21-27 (in Chinese). DOI:10.3969/j.issn.1673-9159.2017.04.004 |
| [51] |
张琴. 刺参(Apostichopus japonicus Selenka)高效免疫增强剂的筛选与应用[D]. 博士学位论文. 青岛: 中国海洋大学, 2010. ZHANG Q. The selection and application of high-effective immunostimulants for sea cucumber (Apostichopus japonicus Selenka)[D]. Ph. D. Thesis. Qingdao: Ocean University of China, 2010. (in Chinese) |