2. 青海省饲草料技术推广站, 西宁 810016;
3. 青海省高原放牧家畜动物营养与饲料科学重点实验室, 省部共建三江源生态与高原农牧国家重点实验室, 西宁 810016
2. Qinghai Province Forage Technology Extension Station, Xining 810016, China;
3. State Key Laboratory of Three-Rivers Source Ecology and Plateau Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai Province Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science for Plateau Grazing Animals, Xining 810016, China
光谱技术作为一种新技术已经被广泛应用于食品、农业、医药、石油化工等行业的质量控制。其中近红外光谱(near infrared spectroscopy，NIRS)技术主要应用于农产品营养价值的定量与定性[1-4]，该技术的应用基于样本组分对近红外光谱的吸收特性，这种吸收特性取决于植物组织有机物中所含的C-H、O-H及N-H等化学键对特定波长光谱的吸收。当样品接受近红外光扫描时，由于化学键对能量的吸收能力不同，样品分子的振动也不同，从而产生特异的光谱数据。人们通过将测定的光谱数据与实验室实测数据进行比较分析，并建立模型，就能准确预测样品的营养成分含量。
近红外光谱技术应用于牧草营养价值评价具有快速、无损、成本低等优点。目前，国内外采用近红外光谱技术与化学计量学相结合的方法建立预测模型，从而对牧草营养价值进行快速测定的研究越来越广泛。在国外，近红外光谱预测模型的应用起步较早，在20世纪70年代，Norris等[5]就采用近红外光谱技术测定了玉米植株的粗蛋白质(CP)含量，效果理想。在此研究的基础上，近红外光谱技术在牧草CP、粗脂肪(EE)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)等营养价值评定中的应用研究大量展开。利用近红外光谱预测模型针对玉米植株、羊草、光花披碱草、多花黑麦草、臂形草等的营养价值进行预测，效果均比较理想[6-11]。我国近红外光谱技术起步较晚，在牧草上的应用研究开始于20世纪90年代。目前，针对苜蓿、羊草、百里香、针茅、苔草、羊茅、菊苣等牧草营养价值评定的近红外光谱预测模型均已见报道[12-15]。
综上所述，近红外光谱技术主要应用于牧草的CP、NDF和ADF等常规营养成分的预测，且预测效果准确。近红外光谱技术在牧草中的应用研究主要集中在豆科牧草和禾本科牧草等单一牧草营养价值评定上，特别是在苜蓿、黑麦草及玉米植株的研究更为广泛深入，而针对天然草地上的混合牧草的研究鲜有报道。因此，本试验采用近红外光谱技术与化学计量学相结合的手段，探索近红外光谱技术应用于天然混合牧草营养价值评定的可行性，并初步构建三江源东部地区天然混合牧草营养价值的近红外光谱预测模型，一方面为建立起高原快速、准确、无污染的新型牧草品质评价体系奠定基础；另一方面为高原天然混合牧草营养价值数据库增加数据基础。
1 材料与方法 1.1 样品采集与处理天然混合牧草样品采集于青海省三江源东部地区黄南藏族自治州泽库县宁秀乡宁秀村(80份，优势种为披碱草、蓬子菜、小花草玉梅、画眉草)、海南藏族自治州同德县塘古镇塞唐村(30份，优势种为高山嵩草、麻花艽、长毛风毛菊)和秀麻乡木合村(110份，优势种为高山嵩草、金露梅、披碱草、长毛风毛菊)、果洛藏族自治州玛沁县大武镇吾玛村(81份，优势种为高山嵩草、羊草、披碱草、长毛风毛菊)，共计301份。在青草期(2020年7月)，选择未经放牧、无退化情况、牧草长势良好的天然草场，采用1 m×1 m的样方框进行样点的随机抛选，然后用剪刀齐地剪割样方框内的所有牧草。牧草采集完成后，挑出牧草中的有毒牧草、动物粪便、石头等不可食部分，自然风干，粉碎，过1 mm筛，保存备用。
1.2 牧草化学成分测定CP含量参照AOAC(1995)中的凯氏定氮法，采用凯氏定氮仪(Kjeltec2100 Distillation Unit，Foss Tecator公司，丹麦)测定，CP含量=氮含量×6.25[16]；NDF和ADF含量参照Van Soest等[17]的方法，采用全自动纤维分析仪(ANKOM 2000i，ANKOM Technology公司，美国)测定。每个指标测定重复2次，取平均值进行模型拟合。
1.3 近红外光谱扫描牧草近红外光谱值采用近红外光谱仪(DS2500，Foss公司，丹麦)进行光谱扫描。扫描前，近红外光谱仪预热30 min左右，并进行校准。将处理好的样品装入样品杯进行扫描，样品量约为杯容量的3/4，每个样品重复扫描3次，每次均扫描背景，将平均光谱保存为样品的最终光谱，从而消除由装样紧实度以及样品粒度不同所造成的误差。在样品扫描的过程保持周围环境的安静，全程1个人操作，尽最大可能减少误差。近红外光谱扫描条件为：波长400.0~2 498.2 nm，检测器由硅检测器(波长400.0~1 092.8 nm)和硫化铅检测器(波长1 100.0~2 498.2 nm)构成；扫描频率为2次/s；光谱分辨率为0.5 nm；波长准确度＜0.05 nm。光谱值表示为log(1/R)。
1.4 近红外光谱预测模型的构建与验证将301个样品按照7 ∶ 3的比例随机分为定标集(226个)和验证集(75个)。定标集用于模型的构建及交叉验证，验证集用于模型的外部验证。采用WinISI Ⅲ进行定标分析。首先对定标集近红外光谱值进行主成分分析(PCA)，进行异常值剔除，采用的方法为马氏距离法，利用每个样品的得分与所有样品得分平均值(作为中心点)进行比较来计算马氏距离，将马氏距离大于3(标准变异单位的3倍)的近红外光谱值作为异常值剔除。然后分别采用平滑处理(smoothing)、求导处理[一阶求导(1st Deriv)和二阶求导(2st Deriv)]和光散射校正[(多元离散校正(MSC)和标准正态化处理(SNV)]几种单一预处理方法组合成7种复合预处理方法对光谱数据进行数据预处理：二阶求导+平滑处理、标准正态化处理+去散射处理+一阶求导、标准正态化处理+去散射处理+二阶求导、多元离散校正+一阶求导、多元离散校正+二阶求导、标准正态化处理+一阶求导，根据定标及交叉验证的各项参数[交叉验证标准误差(cross-verify standard errors，SECV)最小，交叉验证相关系数(cross-verify correlation coefficients，1-VR)最大)]筛选出最佳数据预处理方法。采用修正偏最小二乘法(modified partial least squares，MPLS)对预处理完成的数据进行回归分析，构建牧草CP、NDF和ADF含量的预测模型，并通过交叉验证及外部验证对构建的模型进行验证和评价。
1.5 数据统计分析采用Excel 2010进行数据简单统计，SAS 9.3软件PROC MEANS程序进行成对数据的t检验，P＜0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 天然混合牧草营养价值测定由表 1可知，验证集样本的CP、NDF和ADF含量均在定标集样本的范围内。所有样本的CP、NDF和ADF含量存在一定差异，定标集和验证集的最大值、最小值、平均值和标准差都比较接近。所有样本的CP、NDF和ADF平均含量为13.74%、44.87%和25.26%。
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表 1 三江源东部地区天然混合牧草的营养成分(风干基础) Table 1 Nutritional composition of natural mixed forage in eastern region of three-rivers source (air-dry basis) |
天然混合牧草原始近红外光谱见图 1，光谱扫描的波长为400.0~2 498.2 nm，每隔0.5 nm得到1个吸光值。在同一波长处，所有样品的吸光度有一定的波动范围，这主要是因为样品来源于三江源东部不同地区的不同草场。牧草吸光度在可见光和近红外光波段的多个波长处存在峰值，特别是在可见光区域的400~700 nm处存在2个明显的吸收峰，这主要是因为牧草样品采集于青草期，此时牧草富含叶绿素，叶绿素对于可见光中的蓝紫光和红光有较强的吸收能力。同样在设定的光谱范围内，对应有多个谷值。光谱中的峰值与牧草中化学键的种类有关，是牧草营养价值预测模型构建的关键。此外，在1 092.8~1 100.0 nm处存在一个很窄的断带，这是因为本研究所用的近红外光谱仪搭载的是双检测器，2个检测器的分界处形成了很小的空隙，是断带形成的根本原因。
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图 1 三江源东部地区天然混合牧草原始近红外光谱 Fig. 1 Original near infrared spectroscopy of natural mixed forage in eastern region of three-rivers source |
由表 2可知，CP预测模型构建中数据预处理的最佳方法为标准正态化处理+去散射处理+二阶导数处理，ADF和NDF预测模型构建中数据预处理的最佳方法均为多元离散校正+二阶导数处理。经过最佳数据预处理后，CP、NDF和ADF预测模型的定标决定系数(Rcal2)分别达到0.945、0.978和0.968。定标标准偏差(SEC)均较小，分别为0.401、1.100和0.642。交叉验证结果表明，CP、NDF和ADF预测模型的交叉验证相关系数(1-VR)均高于0.900，交叉验证标准误差(SECV)和SEC均较低。CP预测模型的交叉验证相对标准差(RPDcal)为3.55，高于评估值3.00，而NDF和ADF预测模型的RPDcal则更高。
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表 2 最佳数据预处理条件下定标及交叉验证的参数 Table 2 Parameters for calibration and cross-validation under optimal data pre-processing conditions |
通过验证集数据对预测模型进行外部验证，评价预测模型的预测效果。由表 3可知，构建的预测模型对天然混合牧草CP、NDF和ADF的模型预测值与化学实测值之间差异均不显著(P＞0.05)。CP、NDF和ADF预测模型的外部验证决定系数(RCV2)分别为0.922、0.956和0.922，均高于0.900。CP、NDF和ADF预测模型的外部验证相对标准差(RPDCV)分别为3.58、4.67和3.59，均高于评估值3.00。
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表 3 定标模型的外部验证参数 Table 3 External validation parameters of calibration model |
由图 2、图 3和图 4可知，将验证集样品CP、NDF和ADF的化学实测值与模型预测值做回归分析发现，拟合度较好，决定系数(R2)均高于0.900 0。
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图 2 CP含量的化学实测值与模型预测值的回归分析 Fig. 2 Regression analysis of chemical measured value and model prediction value of CP content |
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图 3 NDF含量的化学实测值与模型预测值的回归分析 Fig. 3 Regression analysis of chemical measured value and model prediction value of NDF content |
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图 4 ADF含量的化学实测值与模型预测值的回归分析 Fig. 4 Regression analysis of chemical measured value and model prediction value of ADF content |
近红外光谱技术在牧草营养价值评定上的研究历史不足50年，但针对各类单一牧草的CP、EE、NDF和ADF等营养价值评定的近红外光谱预测模型已经纷纷建立，由于具有快速、无损及成本低等特点，目前被广泛引用于实际生产。本研究在此基础上以三江源东部地区青草期天然混合牧草为对象，拟构建天然混合牧草营养价值的近红外光谱预测模型。
本研究中采集的天然混合牧草样品CP、NDF和ADF的平均含量分别为13.74%、44.87%和25.26%。所采集的牧草样品营养成分存在一定差异，这与天然混合牧草样品采集的地点不同有关，也与牧草组成种类有关，这种差异也为预测模型的构建提供了保障。近红外光谱分析发现对应存在若干峰值和谷值，这些差异为预测模型的构建提供了保障。在近红外光谱分析中发现了一条很窄的断带，经分析这是2个检测器的分界处形成的空隙，对于预测模型的构建无任何影响。
在构建预测模型时对近红外光谱值进行了7种预处理，结果发现，经过预处理的数据构建的预测模型要优于未经处理的数据。本研究中，CP预测模型构建中数据预处理的最佳方法为标准正态化处理+去散射处理+二阶求导。这与刘哲等[18]构建锡林郭勒盟草原天然混合牧草CP预测模型时的最佳数据预处理方法一致；杨天辉等[15]研究也发现标准正态化处理+去散射处理+二阶求导是构建除豆科、禾本科之外牧草CP预测模型的最佳数据预处理方法。本研究中，NDF和ADF预测模型构建中数据预处理的最佳方法均为多元离散校正+二阶求导，这与以往牧草营养价值预测模型构建中的数据预处理方法不同，但在本研究中预测模型构建效果最佳。
本研究中，天然混合牧草CP预测模型的Rcal2、SEC、ECV及1-VR分别为0.945、0.401、0.481和0.921，而薛祝林等[19]对苜蓿草捆CP进行近红外光谱预测模型构建时的Rcal2、SEC、ECV及1-VR分别为0.91、0.42、0.67和0.91，这表明本研究的天然混合牧草CP预测模型构建效果要优于苜蓿草捆。同样，本研究中构建的天然混合牧草NDF和ADF预测模型也优于苜蓿草捆。虽然天然混合牧草的营养价值模型构建难度理论上要高于单一牧草，但本研究中样本数量较大，各个样点的地理跨度大，这是本研究定标较为成功的关键因素。相反，本研究中天然混合牧草CP、NDF和ADF预测模型构建效果不如杜雪燕等[20]在高寒草甸及姚喜喜等[21]在高寒草原天然混合牧草上的研究，主要是因为杜雪燕等[20]的研究采集的样品为全年四季的牧草样品，随着生长季节的不同，牧草的营养成分含量差异较大；而姚喜喜等[21]的研究中样品量达到1 280份，更是连续4年采集牧草样品，这些因素为模型更精准的构建提供了有力保障。CP、NDF和ADF预测模型的外部验证结果显示，模型预测值与化学实测值之间无显著差异，且3种营养成分预测模型的RCV2分别达到0.922、0.956和0.922，明显高于李洁等[14]、王勇生等[22]、高燕丽等[23]的研究结果。这表明本研究构建的天然混合牧草营养价值预测模型的预测效果良好。此外，RPDcal和RPDCV是判断模型优劣的关键指标。一般认为RPD≥3.00表明定标效果好，定标模型可用于实际检测，相反则说明定标模型预测精度有限，难以进行实际的定量分析[24]。本研究中，CP、NDF和ADF的RPDcal和RPDCV均大于3.00，这进一步表明本研究中构建的天然混合牧草营养价值预测模型比较理想；同时，CP、NDF和ADF的回归方程的R2分别为0.922 2、0.954 9、0.921 6，均高于0.900 0，拟合程度较高，可应用于实际生产。
4 结论CP预测模型构建中数据预处理的最佳方法为标准正态化处理+去散射处理+二阶求导，NDF和ADF预测模型构建中数据预处理的最佳方法为多元离散校正+二阶求导。经数据预处理，本试验构建出了较为理想的三江源东部地区天然混合牧草的CP、NDF和ADF预测模型，交叉验证和外部验证表明，试验构建的预测模型的预测效果较好，可应用于实际生产。
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