2. 定西市安定区畜牧兽医局, 定西 743000
2. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Anding District in Anding City, Dingxi 743000, China
随着畜牧业转型升级核心向“提质、增效、绿色”方向的转变，以及消费者对绿色安全畜产品消费偏好的增强，使得牧草需求量持续增加，带动了草食畜牧业的快速发展[1]。但在草食畜牧养殖过程中，忽略对家畜的科学管理及草地的高效利用，会使生态系统中植物生产层与动物生产层无法系统耦合，从而增加养殖成本。因此，制定合理的饲养管理模式，对推动我国农业生产稳定持续发展具有深远意义。红豆草(Onobrychis viciifolia Scop.)具有适应性强、营养价值丰富、产草量高、适口性好等特性[2]，能够大幅提高草地的生产力，已在我国陇中地区得到了广泛的推广种植[3]。湖羊和小尾寒羊均是我国著名的地方绵羊品种，由于其具有早熟、生长发育快、繁殖性能高、适应性强等特性而深受养殖户喜爱[4]。而随着草食畜牧业的快速发展，如何将优势牧草种植产业与家畜养殖科学结合，目前还缺乏系统的研究。因此，研究陇中地区不同品种绵羊对红豆草草地的响应机制显得尤为重要。对于繁殖母羊而言，其在空怀期的体质健康程度对提高自身繁殖效率和养殖经济效益具有重要意义。有研究表明，通过放牧调控可以在一定程度上提高家畜机体的健康水平[5]。而反刍动物的瘤胃内聚集着大量的微生物群体，对维持动物的营养需要、生理健康和免疫防御等功能起着重要作用，是宿主适应环境的关键[6-7]。影响反刍动物瘤胃微生物区系的因素很多，其中品种对其多样性及功能的影响已被广泛报道[8-9]。因此，本试验以空怀期湖羊和小尾寒羊为研究对象，在红豆草茬地进行划区轮牧，测定其生长性能、瘤胃发酵模式及微生物区系的变化，旨在揭示空怀期放牧湖羊和小尾寒羊对红豆草茬地的响应机制，为人们通过选择合适的养殖品种以适应饲养管理模式的变化提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验地概况试验于2019年8—10月在甘肃省定西市鸿壮农牧有限公司红豆草放牧样地(北纬35°35′、东经103°52′，海拔2 390 m)进行。该地区位于黄土高原丘陵沟壑区，年均降雨量350~600 mm，主要集中在7、8、9月份。年平均气温7.2 ℃，最热的7月份平均气温为19.3 ℃，最冷的1月份平均气温为-6.9 ℃。
红豆草草地建植于2016年，采用条播方式，行距30 cm，播种深度3~4 cm，其中红豆草占比84%，无芒雀麦(Bromus inermis Leyss.)、苜蓿(Medicago sativa L.)、黑麦草(Lolium perenne L.)、针茅(Stipa capillata L.)、白蒿(Herba artimisiae sieversianae)、青蒿(Artemisia carvifolia Buch.)、苦苣菜(Sonchus oleraceus L.)及植物枯落物等占比16%。草地总面积0.87 hm2，根据牧草生产力和再生能力将其划分为4个小区，每个小区面积分别为0.27、0.09、0.26和0.25 hm2。一茬草于7月刈割用于调制干草，再生草高约20 cm，地上生物量达到420.58 g/m2时开始放牧。
1.2 试验设计及样品采集选择年龄一致、体况良好的空怀期湖羊[平均体重(31.95±1.60) kg]和小尾寒羊[平均体重(27.38±2.84) kg]各24只，进行混群放牧。依据当地牧民放牧习惯进行放牧，夜间归牧，试验羊可在圈舍内自由饮水及舔舐营养舔砖。根据绵羊实际采食情况及牧草再生能力在每个小区放牧一定天数后转移羊群至下一个小区开始放牧，遇高温及降雨天气则在圈舍食槽内进行一茬红豆草干草补饲。
在试验开始第1天和第45天出牧前进行称重，记录其体重并计算平均日增重(ADG)和体重增长率。此外，于第45天称重后，每组各挑选4只体重相近的试验羊立即采集瘤胃液。瘤胃液采集使用口腔胃管式负压采集器(A1164K，科立博牧业科技有限公司)，每只羊约采集100 mL左右瘤胃内容物，立即测定pH后用4层纱布过滤，然后将收集的滤液一份立即放入-20 ℃冰箱中保存，用于氨态氮和挥发性脂肪酸(VFA)含量的测定；另一份立即放入-80 ℃冰箱，用于瘤胃微生物DNA的提取。
1.3 瘤胃内环境参数测定瘤胃液pH采用笔式SX620型pH计测定，氨态氮含量采用Rhine等[10]的方法测定。VFA含量采用安捷伦气相色谱仪Agilent 6890A GC System(Hewlett Packard公司，美国)进行检测，配置氢气火焰离子化检测器(FID)，色谱柱为30 mm×0.32 mm×0.33 μm(DB-FFAP，Agilent Technologies公司，美国)，汽化室温度为200 ℃，检测器温度为250 ℃，载气为高纯氮气(20 mL/min)，分流比为50:1，进样器为1.0 μL。
1.4 DNA提取及高通量测序取250 mg瘤胃液样品，使用DNeasy PowerSoil Kit提取样品的总DNA，具体操作步骤参照试剂盒说明书进行。提取样品总DNA后，根据16S全长引物27F(5′-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3′)进行PCR扩增。PCR反应体系为：5 μL KOD FX Neo Buffer，2 μL dNTP(2 mmol/L)，0.3 μL引物(10 μmol/L)，50 ng的模板DNA和0.2 μL的KOD聚合酶。反应参数为：95 ℃预变性5 min，随后95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共循环25次，最后72 ℃延伸7 min，通过0.8X Magnetic DNA Beads对扩增产物进行纯化。纯化后的DNA片段用1.8%的琼脂糖凝胶切胶回收，通过IIIumina HiSeq 2500测序平台(北京百迈客生物科技有限公司)对DNA片段进行高通量测序，获得原始数据后再进行后续生物信息学分析。
1.5 微生物多样性生物信息学分析测序结束后，经过Flash 1.2.11和Trimmomatic 0.33软件对原始数据进行拼接过滤，通过UCHIME 8.1去除嵌合体，得到高质量序列，使用USEARCH 10.0将在相似性为97%水平上序列进行操作分类单元(OTU)聚类，然后挑选出相对丰度最高的序列作为每个OTU的代表性序列。利用RDP Classifier 2.2构建OTU分类信息表。计算每个试验样本的α多样性和β多样性。α多样性由反映群落丰富度的ACE指数、Chao1指数及反映群落多样性的Simpson指数、Shannon指数进行评估。β多样性选择利用加权Unifrac距离计算。利用线性判别分析效应量(LDA effect size，LEfSe)差异分析来计算不同组间的物种差异。使用PICRUSt软件通过比对16S RNA测序数据获得的物种组成信息，预测其功能基因组成，从而分析不同分组之间的功能差异。通过R语言vegan程序包中的CCA模型分析试验样本与瘤胃发酵参数之间的相关性。
1.6 数据统计分析生长性能、瘤胃内环境参数和组间各微生物相对丰度差异均采用SPSS 22.0软件进行独立样本t检验分析，试验数据均采用“平均值±标准差”的形式表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 红豆草茬地放牧对湖羊和小尾寒羊生长性能的影响由表 1可知，湖羊组始重和末重显著高于小尾寒羊组(P < 0.05)，但体重增长率和平均日增重显著低于小尾寒羊组(P < 0.05)。
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表 1 湖羊和小尾寒羊生长性能 Table 1 Growth performance of Hu sheep and small-tailed Han sheep |
由表 2可知，湖羊组和小尾寒羊组之间瘤胃pH和氨态氮、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸含量以及乙酸/丙酸均无显著差异(P>0.05)。小尾寒羊组瘤胃总挥发性脂肪酸(TVFA)含量显著高于湖羊组(P < 0.05)。
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表 2 湖羊和小尾寒羊瘤胃内环境参数 Table 2 Rumen environmental parameters of Hu sheep and small-tailed Han sheep |
为了研究在红豆草茬地放牧条件下湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落的丰富度和多样性，对二者试验样本的α多样性指数进行统计分析。由表 2可知，小尾寒羊组瘤胃微生物的Shannon指数显著高于湖羊组(P < 0.05)，Simpson指数显著低于湖羊组(P < 0.05)。
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表 3 湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物丰富度和多样性指数 Table 3 Rumen microbial richness and diversity indexes of Hu sheep and small-tailed Han sheep |
为了探究红豆草茬地放牧条件下湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落组成的差异性，基于样本的OTU信息，计算样本之间的Weighted Unifrac，并进行主坐标分析(PCoA)和相似性分析(Anosim)，结果如图 1所示。湖羊组和小尾寒羊组分别聚类在不同区域，说明2个品种之间瘤胃微生物群落组成存在明显差异。Anosim结果也表明2个品种之间瘤胃微生物组成存在显著差异(P < 0.05)。
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图 1 湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物主坐标分析(A)和相似性分析(B) Fig. 1 PCoA (A) and Anosim (B) of rumen microbiota of Hu sheep and small-tailed Han sheep |
在不同分类水平上对湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物进行LEfSe差异分析。LEfSe进化分枝图(图 2-A)显示了瘤胃微生物OTU在系统发生方面的关系，由内至外辐射的圆圈代表了由门至属的分类级别，且不同颜色表示各组的优势物种。线性判别分析(LDA)值分布柱状图(图 2-B)显示了各物种的LDA值(仅显示了LDA值大于2的物种)，用来评估组间具有显著差异的物种的影响力。其中，小尾寒羊组共有24个具有显著性差异的物种类群，主要为拟杆菌纲(Bacteroidia)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、拟杆菌目(Bacteroidales)、食物谷菌科(Victivallaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、梭菌目(Clostridiales)、梭菌纲(Clostridia)和弯曲杆菌属(Campylobacter)等。湖羊组差异显著的物种类群达到了5种，主要为变形菌纲(Gammaproteobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、毛螺菌科NK4A136群(Lachnospiraceae_NK4A136_group)和琥珀酸单胞菌属(Succinimonas)。
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Bacteroidia：拟杆菌纲；Firmicutes：厚壁菌门；Bacteroidetes：拟杆菌门；Bacteroidales：拟杆菌目；Clostridiales：梭菌目；Prevotellaceae：普雷沃氏菌科；Clostridia：梭菌纲；Campylobacter：弯曲杆菌科；Brevundimonas：单胞菌；Campylobacteria：弯曲菌纲；Caulobacterales：柄杆菌目；Caulobacteraceae：柄杆菌科；Selenomonas_1：月形单胞菌属_1；Lentisphaerae：黏胶球形菌门；Victivallales：食物古菌目Victivallaceae：食物谷菌科；Anaerocella：厌氧菌属；Succinimonas：琥珀酸单胞菌属；Lachnospiraceae_NK4A136_group毛螺菌科NK4A136群；Proteobacteria：变形菌门；Gammaproteobacteria：变形菌纲。 图 2 湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物LEfSe进化分支图(A)和LDA值分布柱状图(B) Fig. 2 LEfSe evolutionary cladogram (A) and histogram of LDA value distribution (B) of rumen microbiota of Hu sheep and small-tailed Han sheep |
在门分类水平上对湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落中相对丰度排名前10的物种进行统计，由表 4可知，湖羊组和小尾寒羊组瘤胃微生物群落结构组成存在明显差异，其中湖羊组瘤胃中优势菌门为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，分别占微生物总相对丰度的58.81%、17.21%和16.09%；而小尾寒羊组瘤胃中优势菌门为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门和疣微菌门，分别占微生物总相对丰度的36.00%、36.52%、5.97%和3.38%。其中，小尾寒羊组瘤胃中拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度显著高于湖羊组(P < 0.05)，但变形菌门相对丰度显著低于湖羊组(P < 0.05)。
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表 4 瘤胃微生物在门水平上的结构差异 Table 4 Structural differences of rumen microbiota at phylum level |
在属分类水平上对湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落中相对丰度排名前10的物种进行统计，由表 5可知，湖羊组和小尾寒羊组瘤胃微生物群落结构组成存在明显差异，其中湖羊组瘤胃相对丰度较高的菌属为瘤胃杆菌属(Ruminobacter)、普氏菌属_1(Prevotella_1)和解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)，分别占微生物总相对丰度15.63%、8.05%和7.35%；小尾寒羊组相对丰度较高的菌为属普氏菌属_1、解琥珀酸菌属(Succiniclasticum)、奎因氏菌属(Quinella)和理研菌科RC9肠道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)，分别占微生物总相对丰度14.53%、11.40%、10.43%和7.79%。湖羊组和小尾寒羊组之间瘤胃微生物属水平上的相对丰度无显著差异(P>0.05)。
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表 5 瘤胃微生物在属水平上的结构差异 Table 5 Structural differences of rumen microbiota at genus level |
利用PICRUSt软件对已测得的基因数据进行预测，将得到的功能基因信息参考KEGG数据库Level 3层级基因类别进行划分归类(图 3)。湖羊组和小尾寒羊组瘤胃细菌在Level 3层级共包含39种差异基因功能家族，其中湖羊组中核黄素代谢、安莎霉素生物合成、同源重组、硫胺素代谢、百日咳、单酰胺菌素生物合成、上皮细胞细菌侵入通路和癌症通路等功能基因相对丰度显著高于小尾寒羊组(P < 0.05)，而小尾寒羊组中氰基氨基酸代谢、细菌趋化性、丙氨酸代谢、双组分系统、聚酮化合物糖单元生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢、一磷酸腺苷活化蛋白激酶信号通路和蛋白质消化吸收等功能基因相对丰度显著高于湖羊组(P < 0.05)。
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GABAergic synapse：GABA能突触；DNA replication：DNA复制；Sesquiterpenoid and triterpenoid biosynthesis：倍半萜和三萜生物合成；N-glycan biosynthesis：N-聚糖生物合成；Riboflavin metabolism：核黄素代谢；Sulfur relay system：硫中继系统；Synthesis and degradation of ketone bodies：酮体的合成与降解；Glutathione metabolism：谷胱甘肽代谢；Biosynthesis of ansamycins：安莎霉素的生物合成；Bacterial invasion of epithelial cells：上皮细胞细菌侵入通路；Homologous recombination：同源重组；Bacterial chemotaxis：细菌趋化性；Two-component system：双组分系统；Toluene degradation：甲苯降解；Fluorobenzoate degradation：氟苯甲酸盐降解；Thiamine metabolism：硫胺素代谢；Pertussis：百日咳；Monobactam biosynthesis：单酰胺菌素生物合成；Protein processing in endoplasmic reticulum：内质网中的蛋白质加工；Pentose phosphate pathway：磷酸戊糖途径；Tropane, piperidine and pyridine alkaloid biosynthesis：托烷、哌啶和吡啶生物碱的生物合成；Protein export：蛋白质输出；Polyketide sugar unit biosynthesis：聚酮化合物糖单元生物合成；Pathways in cancer：癌症通路；Acarbose and validamycin biosynthesis：阿卡波糖和缬氨霉素的生物合成；Ubiquinone and other terpenoid-quinone biosynthesis：泛醌和其他萜类醌的生物合成；Mismatch repair：错配修复；Phosphatidylinositol signaling system：磷脂酰肌醇信号系统；Histidine metabolism：组氨酸代谢；Prolactin signaling pathway：催乳素信号通路。 图 3 湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物KEGG功能注释图 Fig. 3 KEGG functional annotation plot of rumen microbiota of Hu sheep and small-tailed Han sheep |
在属水平对湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落与其瘤胃内环境参数进行相关性分析(图 4)。湖羊组瘤胃杆菌属相对丰度与pH和丙酸、戊酸、异戊酸和异丁酸含量呈正相关，瘤胃球菌科_UCG-014、普氏菌属_1和解琥珀酸菌属相对丰度与pH和氨态氮、异丁酸、戊酸和TVFA含量呈正相关，奎因氏菌属、新月形单胞菌属和毛螺菌科AC2044群相对丰度与氨态氮、VFA、乙酸和丁酸含量呈正相关。而小尾寒羊组普氏菌属_1、解琥珀酸菌属、瘤胃球菌属_2、奎因氏菌属和毛螺菌科AC2044群相对丰度与pH呈正相关，瘤胃球菌属_2、奎因氏菌属、毛螺菌科AC2044群、理研菌科RC9肠道群、新月形单胞菌属和厌氧原体属相对丰度与乙酸和TVFA含量呈正相关，理研菌科RC9肠道群、新月形单胞菌属、厌氧原体属相对丰度与戊酸、异丁酸、异戊酸和氨态氮含量呈正相关，普氏菌属_1和新月形单胞菌属_1相对丰度与丙酸和丁酸含量呈正相关，解琥珀酸菌属相对丰度与丙酸含量呈正相关。
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NH3-N：氨态氮ammoniacal nitrogen；Acetic acid：乙酸；Propionic acid：丙酸；Valeric acid：戊酸；Butyric acid：丁酸；Isovaleric acid：异戊酸；Isobutyric acid：异丁酸；TVFA：总挥发性脂肪酸；Ruminobacter：瘤胃杆菌属；Prevotella_1：普氏菌属_1；Succiniclasticum：解琥珀酸菌属；Quinella：奎因氏菌属；Selenomonas：新月形单胞菌属；Lachnospiraceae_AC2044_group：毛螺菌科AC2044群；Rikenellaceae_RC9_gut_group：理研菌科RC9肠道群；Erysipelotrichaceae_UCG_004：韦荣球菌科_UCG_004；Anaeroplasma：厌氧原体属。 图 4 属水平瘤胃微生物与其瘤胃内环境参数间相关性分析 Fig. 4 Correlation analysis between rumen microbiota and its rumen environmental parameters |
家畜的生长性能是评价其对饲粮、饲养管理方式及环境等因素适应情况的重要指标[11]。在红豆草茬地混群放牧的饲养管理模式下，湖羊的始重和末重显著高于小尾寒羊，但其体重增长率和平均日增重显著低于小尾寒羊。本试验2个品种绵羊在体重上的差异与郭定恩等[4]在比较1~6月龄小尾寒羊与湖羊生长性能的研究中结果一致。这可能是由于绵羊品种不同，使其生长性能产生了差异[12]。
3.2 红豆草茬地放牧对湖羊和小尾寒羊瘤胃内环境参数的影响在反刍动物瘤胃内环境参数中，pH受饲粮组成、VFA的合成与吸收、唾液分泌以及食糜的排空速率等多种因素影响[13]，被认为是评价瘤胃内部环境的一项综合指标。瘤胃pH适宜范围为6.5~6.8[14]。在本试验中，放牧湖羊和小尾寒羊瘤胃pH分别为7.09和7.21，均高于适宜范围。这可能是由于本饲养管理模式下动物所采食的牧草纤维含量较高，对瘤胃壁产生较大摩擦促进了瘤胃上皮角质化层和死亡上皮细胞的脱落，使瘤胃上皮的吸收面积增加，促进了瘤胃VFA的吸收及pH的升高[15]。并且，在放牧过程中牧草中纤维含量较高，可能使动物的反刍行为受到了影响，其咀嚼和反刍的时间延长，唾液分泌量随之增加，对瘤胃内环境pH起到了缓冲作用[16]。氨态氮是瘤胃微生物合成菌体蛋白的主要原料，适宜范围为8.5~30.0 mg/dL，如果氨态氮含量过低，瘤胃微生物的生产能力将会受到抑制[17]。本试验中，湖羊组和小尾寒羊组瘤胃中氨态氮含量分别为14.88和14.24 mg/dL，均在适宜范围内。瘤胃中VFA是反刍动物生长繁殖的主要能源物质，约占反刍动物机体碳代谢的2/3。本试验中，湖羊组和小尾寒羊组瘤胃中乙酸、丙酸和丁酸含量较高，占TVFA的95%以上，与李文[15]的研究结果相同。已有研究表明，当饲粮中粗饲料所占比例高时，瘤胃内乙酸含量较高；精料所占比例高时，瘤胃内丙酸含量较高[18]。本试验在放牧过程中动物主要采食粗饲料，故2个品种的绵羊瘤胃中乙酸含量都较高。Bensadoun等[19]研究发现，瘤胃中VFA的产生与瘤胃微生物有密切关系，排除其他干扰，当瘤胃微生物由2.2×105 CFU/mL增加到3.13×105 CFU/mL时，TVFA含量则由117.95 mmol/L增加至136.94 mmol/L。杨亮宇等[20]通过在人工瘤胃中添加不同木霉培养液并监测其TVFA产量，发现不同种类和组合的微生物对其瘤胃TVFA产量和组成有显著影响。而在本试验中，小尾寒羊瘤胃TVFA含量显著高于湖羊，究其原因可能是由于不同品种间瘤胃微生物结构和相对丰度差异所导致。
3.3 红豆草茬地放牧对湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物区系的影响瘤胃作为一个微生态系统，其中的微生物能够通过组成结构的动态演替来响应外界条件的变化，使耐受性更高的微生物种类得以保留[21]。而影响瘤胃微生物菌群结构的因素有很多种，例如生理阶段、营养水平、动物品种、季节和饲喂方式等[22]。刘开朗等[23]对不同品种牛瘤胃微生物区系进行分析发现，荷斯坦奶牛与鲁西牛瘤胃细菌16S rDNA文库存在明显差异，表明牛的品种是影响瘤胃微生物的重要因素，且大于饲粮或其他因素。而本试验中，LEfSe差异分析表明在不同分类水平上湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物区系之间也存在明显差异。α多样性主要用于评估单个样品中微生物丰度和多样性，具体衡量指标有Chao1指数、ACE指数、Shannon指数和Simpson指数等。其中Shannon指数越大，Simpson指数越小，说明样品微生物多样性越高[24]。本试验中，小尾寒羊组Shannon指数显著高于湖羊组，而Simpson指数显著低于湖羊组，说明小尾寒羊瘤胃微生物多样性较高。Flint等[25]研究表明，宿主胃肠道微生物多样性越高，则其对宿主健康贡献越大。当瘤胃微生物多样性降低时，致病菌易侵入会对瘤胃常驻菌形造成营养竞争性抑制，从而增加动物患胃肠道疾病的风险[26]。而本试验条件下，小尾寒羊瘤胃微生物多样性高于湖羊，说明在红豆草二茬草地放牧饲养管理方式下，小尾寒羊的患病风险低于湖羊。Liu等[27]和Xue等[28]研究均表明，反刍动物瘤胃微生物在门水平上相对丰度较高的优势菌门依次为拟杆菌门和厚壁菌门，这与本研究中小尾寒羊组试验结果相同，其瘤胃中拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度分别达到36.00%和36.52%。但湖羊组瘤胃中相对丰度最高的为变形菌门(58.81%)，其次为拟杆菌门(17.21%)。已有研究表明，反刍动物瘤胃中拟杆菌门可以分解饲料中碳水化合物和蛋白质等大分子物质，还可协助宿主分解多糖，厚壁菌门中包含许多纤维降解菌可促进反刍动物对纤维物质的消化吸收，从而提高营养物质的利用率[29]。而变形菌门主要为革兰氏阴性菌，此菌门包含多种病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、幽门螺杆菌等，其含量高于19%一般被认为是微生物群落不稳定的主要标志[30-31]。在本研究中，小尾寒羊组瘤胃中拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度均显著高于湖羊组，但变形菌门相对丰度显著低于湖羊。这说明小尾寒羊对牧草的消化吸收能力要优于湖羊，而湖羊组瘤胃中变形菌门相对丰度较高，说明其瘤胃菌群结构不稳定。并且，通过对湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物进行KEGG代谢通路差异分析发现，湖羊组百日咳、上皮细胞细菌侵入通路和癌症通路等功能基因的相对丰度显著高于小尾寒羊组，这可能与该品种对于饲养管理方式的适应性有关。湖羊组安莎霉素生物合成和单酰胺菌素生物合成的功能基因相对丰度显著高于小尾寒羊组。安莎霉素和单酰胺菌素是2种结构独特的抗生素，具有很强的抗细菌、抗真菌、抗癌和抗病毒活性作用[32-33]。湖羊组与抗生素合成相关的功能基因相对丰度较高，这可能是由于其对于红豆草茬地放牧的饲养管理模式适应性较差，从而导致其瘤胃菌群失调，机体需要通过调节抗生素合成通路来抵抗致病菌的侵入，使动物适应环境带来的压力。而小尾寒羊组与氨基酸代谢相关的通路如氰基氨基酸代谢、丙氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、组氨酸代谢以及蛋白质消化吸收等功能基因相对丰度显著高于湖羊组。
在红豆草茬地放牧条件下，湖羊和小尾寒羊瘤胃中优势菌属与其瘤胃内环境参数之间的相关性存在差异。在属分类水平上湖羊瘤胃中相对丰度最高的微生物为瘤胃杆菌属，但在小尾寒羊瘤胃中相对丰度较低。瘤胃杆菌属是一类严格厌氧的革兰氏阴性菌，具有很强的淀粉酶活性[34]。因此，在本试验中瘤胃杆菌属相对丰度与pH和丙酸、戊酸、异戊酸、异丁酸含量均呈正相关，而小尾寒羊组瘤胃球菌属相对丰度较低，且与瘤胃内环境参数相关性较弱。普氏菌属_1是小尾寒羊和湖羊瘤胃中相对丰度均较高的微生物，可能由于其既拥有高活性的半纤维素分解菌，又对植物非纤维多糖和蛋白质的降解发挥重要作用，能够在动物瘤胃中占据不同的生态位所导致[35]。但在湖羊组瘤胃中普氏菌属_1相对丰度分别与pH和氨态氮、异丁酸、戊酸和TVFA含量呈正相关，而在小尾寒羊组中只与丙酸和丁酸含量呈正相关。解琥珀酸菌属是典型的纤维降解菌，能发酵降解纤维素或纤维二糖产生琥珀酸、乙酸和二氧化碳等[36]。琥珀酸可再次被降解为丙酸，并且解琥珀酸菌属还参与蛋白质降解过程，同时产生氨态氮等物质[37]。因此，在本试验中，湖羊组和小尾寒羊组瘤胃中解琥珀酸菌属相对丰度分别与pH、丙酸含量呈正相关，但其与氨态氮含量的相关性在2组中存在差异。新月形单胞菌很多能发酵淀粉，所有菌株都能产生乙酸和丙酸，但丁酸、琥珀酸、乳酸和甲酸的产生因菌株而异[38]。在本试验中，湖羊组新月形单胞菌属相对丰度与乙酸含量呈正相关，而小尾寒羊组新月形单胞菌属相对丰度与丙酸含量呈正相关。造成不同品种放牧绵羊瘤胃中优势菌属与其瘤胃内环境参数之间的相关性差异的原因，可能是由于湖羊和小尾寒羊瘤胃微生物群落结构不同，使同一种微生物在不同的环境中功能发生了改变。
4 结论① 在红豆草茬地放牧条件下，小尾寒羊生长性能优于湖羊，其瘤胃内TVFA含量及瘤胃内微生物多样性均高于湖羊。
② 在红豆草茬地放牧条件下，小尾寒羊和湖羊瘤胃微生物群落结构及相对丰度存在差异，其中小尾寒羊瘤胃中优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门，而湖羊瘤胃中优势菌门为变形菌门；功能预测分析结果显示，湖羊在疾病及抗生素合成通路的功能基因相对丰度显著高于小尾寒羊。
③ 小尾寒羊和湖羊瘤胃中优势菌属与瘤胃内环境参数之间的相关性存在差异。
综上所述，湖羊和小尾寒羊对在红豆草茬地放牧饲养管理方式的响应情况不同，且小尾寒羊的饲养效果优于湖羊。
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