2. 塔里木畜牧科技兵团重点实验室, 阿拉尔 843300
2. Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology, Alar 843300, China
新疆是少数民族聚居区,羊肉是广大群众的刚性需求。南疆农牧民素有养羊的传统,发展肉羊产业是实现脱贫攻坚和乡村振兴战略的重要途径。由于南疆人民饮食习惯所向、旅游产业快速发展、封山禁牧等原因,羊肉呈现出供不应求的局面。南疆生态环境脆弱,土壤沙化严重,种植业结构单一,优质粗饲料资源极度匮乏,严重制约了肉羊产业的发展。因此,饲草料资源的开发和高效利用显得尤其重要。
南疆有大面积葡萄种植农场和数量众多的葡萄酒酿造企业。据统计,2020年新疆酿酒业产生葡萄渣约7.2万t。葡萄籽作为新型饲料资源,在草食动物饲粮中合理添加可缓解饲草资源的不足[1]。葡萄籽中含有2%~8%的单宁,其中主要是缩合单宁(原花青素)。研究表明,葡萄籽中含有高抗氧化能力的多酚,可以降低在集约化养殖环境下对肉鸡造成的氧化应激[2];肉羊饲粮中添加葡萄籽可以提高肉羊的生产性能和营养物质表观消化率[3-4]。葡萄籽原花青素不仅可以促进高精料育肥羔羊的生长[5],还能改善奶牛泌乳早期能量代谢、抗氧化指标、瘤胃发酵模式和降低甲烷排放[6]。Muktiani等[7]发现在奶山羊饲粮中加入葡萄籽油,在乳脂率没有明显变化的情况下降低了采食量。然而,葡萄籽中还含有纤维素、木质素和植酸等抗营养物质,直接饲喂影响其适口性及消化率,不利于动物的消化、吸收和利用,从而影响动物的生长[8]。因此,探究在不同饲养条件下适宜的葡萄籽添加量对畜禽养殖业发展尤为重要。
瘤胃微生物与反刍动物营养有密切的关系,瘤胃中微生物种类、数量和各种微生物的活性和比例不同,最终影响瘤胃内挥发性脂肪酸(VFA)产量及各组分比例[9]。有研究表明瘤胃细菌的种类和丰度与发酵底物存在关联性[10]。反刍动物瘤胃中含有大量的细菌、真菌、古细菌和病毒,其中细菌数量最多,高达1011~1012个/mL[11]。它们在宿主对营养物质的消化吸收过程中起着至关重要的作用。
本试验拟在饲粮中添加不同比例葡萄籽,探究葡萄籽对多浪羊瘤胃内环境和菌群结构的影响,以期为葡萄籽在肉羊养殖中的合理使用和南疆饲草料资源的开发利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验地点本试验于2019年4月8日至2019年5月8日在塔里木大学动物科学与技术学院试验站进行。
1.2 试验饲粮参考NRC(2007)[12]体重30 kg、日增重100 g/d的肉羊营养需要,按照“等能等氮”的原则,设计5种添加不同比例葡萄籽的试验饲粮,葡萄籽添加比例分别为0(D1)、4%(D2)、8%(D3)、12%(D4)、16%(D5),试验饲粮组成及营养水平见表 1。试验所用葡萄籽来自伊犁某葡萄酒厂,自然干燥后葡萄籽含水分9.93%,干物质(DM)中含粗灰分(Ash)3.02%、粗蛋白质(CP)9.24%、粗脂肪(EE)16.25%、中性洗涤纤维(NDF)60.52%、酸性洗涤纤维(ADF)51.77%。葡萄籽自然干燥后用中药粉碎机粉碎(型号:XFB-500),然后与各精料原料在混合机内搅拌混匀备用。
试验选用15只体重在(41.0±1.0) kg、安装有永久瘤胃瘘管的健康多浪羊成年羯羊,在晨饲前空腹称重,按照体重相近原则随机分成5个组,每个组3个重复,每个重复1只羊。5组试验羊分别饲喂葡萄籽添加比例为0(D1组)、4%(D2组)、8%(D3组)、12%(D4组)、16%(D5组)的试验饲粮。试验预试期和正试期各15 d。试验前对代谢笼清洗消毒,试验开始前1个月注射1 mL伊维菌素驱虫。每天09:00和21:00各饲喂1次,按照维持水平1.2倍饲喂,试验羊单笼饲养,自由饮水。
1.4 样品采集与指标测定 1.4.1 瘤胃液pH从正式试验第10天开始,在3 d的采样期内分批次间隔采集瘤胃液,第1天饲喂后0(晨饲前)、3、6、9 h采集,第2天饲喂后2、4、6、8、10 h采集,第3天饲喂后3、5、7、9、11 h采集。采样后用4层纱布过滤瘤胃液,立即使用FiveEasy FE22 pH计测定pH,然后将剩余瘤胃内容物从瘘管送回瘤胃。
1.4.2 瘤胃液氨态氮(NH3-N)浓度瘤胃液采集方式同1.4.1。取10 mL离心后的瘤胃上清液,参照冯宗慈等[14]的比色法测定NH3-N浓度。
1.4.3 瘤胃液微生物蛋白(MCP)浓度在正试期第10天在晨饲前采集瘤胃液,取30 mL瘤胃液,4 ℃、21 000 r/min离心20 min,留沉淀,用15 mL生理盐水洗涤沉淀2次,沉淀用10 mL浓硫酸分3次冲洗到消煮管中测定MCP浓度。
1.4.4 瘤胃液挥发性脂肪酸(VFA)比例在正式试验第10天饲喂后0、1、3和7 h采集瘤胃液,用4层纱布过滤后取滤液50 mL,在39 ℃下1 500 r/min离心15 min。取8 mL离心后的上清液保存于预先加入2 mL偏磷酸的离心管中,上下晃动摇匀,保存于-80 ℃用于测定各VFA浓度,并计算各VFA占总挥发性脂肪酸(TVFA)的比例。各VFA浓度采用GC-2014气相色谱仪进行测定,色谱柱为HP 19091N-213毛细柱,进样0.6 μL,进样口温度220 ℃,氮气(N2)流量2.0 mL/min,分流比40:1。
1.4.5 瘤胃菌群组成在正试期第10天晨饲前(0 h)采集瘤胃食糜,每只羊采集20 mL,分别装于2个10 mL离心管中,保存于-80 ℃。将样品在冰上融化后,充分混匀并离心,取适量样品,按照试剂盒的操作说明抽提瘤胃液中的细菌基因组DNA,以1%琼脂糖凝胶,5 V/cm的电压,电泳20 min,判断提取效果,DNA提取试剂盒为FastDNA SPIN kit for soil (MP Biomedicals,美国)。使用细菌16S rDNA基因V3~V4区引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增。扩增试验采用TransGen AP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase进行,反应体系为20 μL。PCR扩增产物用于高通量测序,测序公司为上海美吉生物医药科技有限责任公司。
用使Use-arch软件平台进行操作分类单元(OTU)聚类,细菌OTU代表序列与SILVA rRNA database数据库(https://www.arb-silva.de/)进行比对。
1.5 统计分析数据采用SAS 9.2软件中的单因素方差分析(one-way ANOVA)程序进行显著性检验,并采用LSD法进行组间差异的多重比较,以P < 0.05为差异显著性判断标准,结果用平均值和均值标准误(SEM)表示。
2 结果与分析 2.1 不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃发酵参数的影响 2.1.1 不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃液pH的影响图 1为不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃液pH的影响。由图可见,瘤胃液pH变化受到饲喂时间和葡萄籽添加比例的影响。羊只采食后pH呈现出先降低后升高的波动变化。在采食后4~5 h,各组pH达到第1个低谷,其中D2组最低,随后D2组在采食后8 h达到第2个低谷,pH为6.04。各组pH在采食后10 h时恢复到正常水平。各时间点各组间瘤胃液pH差异不显著(P>0.05)。
不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃液NH3-N浓度的影响见图 2。由图可知,瘤胃液NH3-N浓度受到采食时间和葡萄籽添加比例的影响。羊只采食后瘤胃液NH3-N浓度呈现先升高再降低的趋势,采食后1~2 h时NH3-N浓度达到最高值,然后逐渐降低,在采食后8~9 h达到最低值,并且在采食后10 h恢复到正常水平。各时间点各组间瘤胃液NH3-N浓度差异不显著(P>0.05)。
由表 2可知,瘤胃液MCP浓度随着饲粮葡萄籽添加比例的增加呈上升趋势,其中D4、D5组显著高于D1组(P<0.05)。
表 3为不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃液VFA比例的影响。由表可知,瘤胃液VFA比例的变化受到采食时间和葡萄籽添加比例的影响。采食后TVFA浓度先升高后降低,D2和D3组在采食后1 h达到最高值,且显著高于D4和D5组(P<0.05),D4和D5组在采食后3 h达到最高值,且显著高于D1组(P<0.05);在采食后7 h时D1组TVFA浓度显著高于其他组(P<0.05);葡萄籽添加比例超过8%后TVFA浓度平均值降低,但各组间差异不显著(P>0.05)。羊只采食后D1、D2组和D5组乙酸比例呈现先升高后降低的变化趋势,D3、D4和D5组在采食后3 h时乙酸比例显著高于D2组(P<0.05);乙酸比例平均值各组间差异不显著(P>0.05)。D4组丙酸比例在采食后1 h显著高于其他组(P<0.05);D4和D5组丙酸比例平均值高于其他组,但差异不显著(P>0.05)。各组丁酸比例在采食后3 h达到最高值,且其他组较D1组显著降低(P<0.05);丁酸比例平均值各组间差异不显著(P>0.05)。各时间点各组间戊酸比例差异不显著(P>0.05)。异戊酸比例平均值随葡萄籽添加比例的增加先降低后升高。D4组乙酸/丙酸在采食后3 h时显著高于D1组(P<0.05),乙酸/丙酸平均值随葡萄籽添加比例的增加先升高后降低,在添加比例为8%时达到最大值;但各组间差异不显著(P>0.05)。
细菌样本测序长度在401~440 bp,分布在421~440 bp的细菌序列数目最多,且序列长度和PCR扩增结果一致。由细菌样本长度(图 3-A)和稀释曲线(图 3-B)来看,样本曲线先陡然升高,然后慢慢趋于平缓,最终所有曲线都到达了平缓期,说明测序数量足够,测序结果可以反映细菌大部分真实信息。
图 4为在OUT水平基于门水平的主坐标分析,主成分1(PC1)和主成分2(PC2)的贡献值分别为80.52%和8.14%。用Bray-Curtis距离算法,不同颜色点代表不同分组的样本,2个样本的点越接近,表明这2个样本的物种组成越相似。由图可知,D2和D5组、D3和D4组样本的点相对接近,同时5组样本的点较为集中,表明各组细菌门水平群落组成相似。
Venn图可以反映样本物种OTU组成的相似性和差异情况。由图 5可知,5个组每组保存2个样本,共计6 947个OTU,其中D1组有1 422个、D2组有1 434个、D3组有1 313个、D4组有1 321个、D5组有1 457个,共有OTU为6 625个,占总OTU的95.36%。D1、D2、D3、D4、D5组特有OTU分别为34、77、25、48和138个。随着葡萄籽添加比例的增加,瘤胃内细菌的种群数量先下降后上升。D3组的OTU和特有OTU数最少,D5组的OTU和特有OTU数最多。
由表 4可知,各组之间Alpha多样性指数差异均不显著(P>0.05)。但从数值上看,D3组Shannon指数最大,为5.04%,说明该组细菌群落多样性最高;D5组Ace指数和Chao1指数最小,分别为1 025.24和1 021.56,说明该组细菌群落丰富度最低。
表 5为不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃细菌门水平相对丰度的影响。由表可知,瘤胃优势菌门为拟杆菌门和厚壁菌门。其中,D5组拟杆菌门相对丰度最高,可达56.98%;D3组厚壁菌门相对丰度最高,达到了43.09%。各组之间拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度差异不显著(P>0.05)。与D1组相比,D2组拟杆菌门相对丰度提高了4.28%,D3、D4组则分别降低了9.79%和8.57%;与D1组相比,D3、D5组厚壁菌门相对丰度分别提高了13.42%和降低了5.58%。D1组变形菌门相对丰度最高,达到4.67%。饲粮中添加葡萄籽抑制了瘤胃变形菌门的生长,其中D2组的抑制作用达到了84.58%。图 6为前10种瘤胃细菌门水平堆积图。
表 6为不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃细菌属水平相对丰度的影响。由表可知,饲粮中添加不同比例葡萄籽对普雷沃氏菌属1有抑制作用,与D1组相比,D3组的抑制作用达到了21.53%。饲粮中添加低比例葡萄籽会抑制未分类柔毛杆菌科的生长,但是添加比例葡萄籽反而会促进其生长。D3组未分类柔毛杆菌科相对丰度最低,为3.10,D5组则最高,为11.45,与D1组相比,D3组的抑制作用达到53.59%,D5组的促进作用达到71.41%。饲粮中添加葡萄籽会促进解琥珀酸菌属的生长,但是添加比例升高会抑制其生长。D3组解琥珀酸菌属相对丰度最高,为7.49%,与D1组相比,D3组的促进作用达到126.97%。饲粮中添加葡萄籽会抑制克里斯滕森菌科R-7群的生长,且抑制作用随着添加比例的升高而增强,D5组克里斯滕森菌科R-7群相对丰度最低,为3.43%,与D1组相比减少了34.42%。前10种瘤胃细菌属水平堆积图如图 7所示。
瘤胃液pH是瘤胃发酵情况的综合体现,受到唾液分泌、VFA组成和饲粮结构等因素的影响[15]。赵旭昌等[16]报道的健康绵羊瘤胃液pH在5.52~7.60。本试验中各组多浪羊瘤胃液pH在5.98~7.07,属正常范围。动物采食后饲粮中碳水化合物发酵产生VFA使得瘤胃液pH降低,随着采食时间逐渐升高呈现波动变化,与王晓佳[17]的研究结果一致。本试验在,各试验饲粮按照“等氮等能”的原则配制,使得各组饲粮组成的差异不足以使各个时间点的瘤胃液pH发生显著变化。但是,因为葡萄籽中的单宁对瘤胃微生物发酵具有抑制作用,通过降低VFA浓度对pH产生了一定影响,与李志威[18]和田华勤[19]的研究结果一致。
3.2 不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃液NH3-N浓度的影响NH3-N是反刍动物利用饲粮中蛋白质和非蛋白氮的产物,参与MCP的合成[20]。瘤胃液NH3-N浓度的高低与微生物对饲粮中蛋白质的降解和利用机制有关[21]。本研究中,各组羊只采食后瘤胃液NH3-N浓度呈现出基本一致的规律性变化,即在采食后1~2 h上升至峰值后下降,在采食后7 h再次小幅度上升随后下降,在采食后10 h后趋于稳定,与黄小乘等[22]的研究结果相似。有研究表明,体外试验条件下在底物中加入缩合单宁或葡萄籽油会降低NH3-N浓度。米热古丽·伊马木等[23]和曹雪等[24]研究均显示,在饲粮中加入葡萄籽后NH3-N浓度平均值较对照组降低。葡萄籽中缩合单宁可以与蛋白质结合,减少瘤胃微生物对蛋白质的降解,从而降低瘤胃液NH3-N浓度,提高饲粮中蛋白质的利用效率。
3.3 不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃液MCP浓度的影响瘤胃微生物利用非蛋白氮合成MCP,MCP是反刍动物小肠可吸收蛋白质的主要来源[25]。丁娜[26]在杜×寒杂交育肥公羔饲粮中分别添加0、10%和20%的酿酒葡萄皮渣后发现,各试验组瘤胃液MCP浓度均显著高于空白对照组,且以添加10%酿酒葡萄皮渣的试验组瘤胃液MCP浓度最高。本试验结果显示,在饲粮中添加葡萄籽后提高了瘤胃液MCP浓度,并且瘤胃液MCP浓度随着葡萄籽添加比例的增加而升高。这可能是因为饲粮中添加适量的葡萄籽后改变了瘤胃微生物尤其是合成MCP的相关细菌、真菌和原虫的类型和数量,进而提高了多浪羊瘤胃液MCP浓度。
3.4 不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃液VFA比例的影响瘤胃内VFA是瘤胃内微生物降解饲粮中碳水化合物后所得产物,包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸等,其中以乙酸、丙酸和丁酸为主,占TVFA的95%左右。本试验结果表明,羊只采食后瘤胃液TVFA浓度平均值降低,随着葡萄籽添加比例的增加,葡萄籽中单宁对微生物活动的抑制作用越强,使得TVFA的产量越低,王敬尧[27]的试验结果与本研究结果一致。本试验中,乙酸比例随着葡萄籽添加比例的增加而降低,这是因为饲粮中纤维降解缓慢,且葡萄籽中单宁的抑制微生物降解作用影响乙酸的生成,从而降低了乙酸比例。肖敏敏等[28]在饲粮中添加0.50%的高粱单宁提取物后显著降低了肉牛体外发酵培养液中乙酸和丁酸的浓度。王婷[29]和赵栋等[30]在饲粮中添加葡萄籽后发现试验羊瘤胃液丙酸摩尔比增加;杨凯[31]在肉牛饲粮中加入单宁酸提高了瘤胃液丙酸浓度。本研究结果与上述研究结果一致,即葡萄籽增加了多浪羊瘤胃液中丙酸比例。瘤胃发酵类型分为丙酸型发酵和乙酸型发酵,根据乙酸、丙酸产生的途径和自身结构可知,丙酮酸转化为乙酸的过程会产生二氧化碳(CO2)和氢气(H2),经过种间氢转移会造成能量的损失。相比于丙酸,乙酸的大量生成会使饲粮的利用效率降低[32]。本试验中,随着葡萄籽添加比例的增加,乙酸比例逐渐降低,使瘤胃发酵类型从乙酸型发酵向丙酸型发酵转变,这主要是因为饲粮中葡萄籽单宁使得瘤胃微生物组成和结构产了变化,这影响了VFA的产量与组成。丙酸型发酵能为机体提供更多的能量,有利于家畜育肥。
3.5 不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃细菌门水平组成的影响反刍动物复杂的瘤胃微生物区系其对饲粮的利用过程中发挥着不可或缺的作用,主要是对纤维素、淀粉、蛋白质和脂肪等营养物质的降解。本试验中D3组瘤胃细菌群落多样性最高,D4组的丰富度最高,说明在饲粮中添加适量的葡萄籽有利于瘤胃细菌的生长。但是D5组的瘤胃细菌群落多样性和丰富度都是最低的,这可能是因为过量的葡萄籽中的缩合单宁抑制了瘤胃细菌的生长,与Min等[33]的研究结果一致。厚壁菌门和拟杆菌门作为瘤胃细菌的优势菌群,可以协助宿主吸收碳水化合物和蛋白质等。变形菌门包含大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌,这些细菌数量的增加有可能引起动物微生物失调以及产生疾病风险[34]。葡萄籽的加入降低了瘤胃变形菌门的相对丰度,有可能减少动物肠道疾病的发生。
3.6 不同比例葡萄籽饲粮对多浪羊瘤胃细菌属水平组成的影响瘤胃中包含降解蛋白质和淀粉等物质的普雷沃氏菌,主要参与纤维降解的瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌[35]。瘤胃微生物的群落变化可以直接影响到动物机体性能。因此,维持瘤胃微生态系统的稳定至关重要。
本试验中,各组在属水平上的优势菌属均为普雷沃氏菌属1,且各组间蛋白质降解菌——普雷沃氏菌属的相对丰度无显著差异,王婷[29]在肉羊基础饲粮中加入葡萄籽后发现肉羊普雷沃氏菌属1的相对丰度有所增,但差异不显著。而赵梦迪[36]在黄牛饲粮中添加低水平的缩合单宁,在采食后3和12 h降低了普雷沃氏菌属1的相对丰度。McSweeney等[37]发现单宁只影响瘤胃纤维降解菌的生长,对蛋白质降解菌的生长无抑制作用。这可能是单宁的结构和相对分子质量存在差异,以及动物品种、添加剂量、饲养条件及饲养周期的不同导致的。本试验在基础饲粮中加入12%和16%的葡萄籽时,瘤胃球菌属1的相对丰度分别增加了136.81%和111.66%。瘤胃球菌属相对丰度的增加促进了宿主对纤维的消化和利用。解琥珀酸菌属能发酵降解纤维产生琥珀酸、乙酸和CO2等,是典型的纤维降解菌。D3组的普雷沃氏菌属1和解琥珀酸菌属相对丰度的变化最大,分别降低了21.53%和增加了126.97%。这说明在12%的葡萄籽添加比例下,动物更偏向于对纤维素的利用。饲粮中葡萄籽的加入使得瘤胃细菌相对丰度发生了改变,但是各组间差异均不显著。蛋白质降解菌和纤维降解菌相对丰度的变化说明动物可以通过调整自身瘤胃菌群结构来适应饲粮的变化,以达到对饲粮的高效利用。
4 结论由本试验结果可知,添加葡萄籽于饲粮中可以提高多浪羊瘤胃液pH和MCP浓度,减少TVFA浓度,降低乙酸/丙酸,促使瘤胃发酵类型向丙酸型转变,但对瘤胃细菌相对丰度无显著影响。经综合评定,多浪羊饲粮中以添加12%的葡萄籽为宜。
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