2. 宁夏草牧业工程技术研究中心, 银川 750021;
3. 四川农业大学动物科技学院, 成都 611130
2. Ningxia Grassland and Animal Husbandry Engineering Technology Research Center, Yinchuan 750021, China;
3. College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)是一类广泛种植于干旱和半干旱地区的防风固沙类豆科灌木，由于大量人工种植的柠条锦鸡儿与其他植物竞争土壤养分，从而导致植物物种多样性降低[1-2]。截止2018年，宁夏盐池县柠条面积达1.73万hm2，生物贮量为59.7万t[3]。不及时平茬更新使柠条锦鸡儿老化和退化现象严重[4]，造成大量资源浪费。因此，合理有效利用柠条锦鸡儿可减少物种竞争，提高生态系统稳定性。
柠条锦鸡儿富含蛋白质、矿物质、维生素和动物生长所需氨基酸[5]，是良好的非常规饲料资源。木质化程度高是制约柠条锦鸡儿作为饲料资源开发的重要因素，适宜的加工方式有利于降低其纤维含量。研究表明，花期收获的柠条锦鸡儿营养价值较高，采用揉碎的加工方式可提高其适口性[5-6]。此外，青贮能有效保存柠条锦鸡儿营养成分，软化托叶刺[7]，是保存灌木饲料和缓解干旱地区饲料短缺的贮存方法之一。豆科植物发酵品质不佳主要原因为附着乳酸菌数量少、可溶性碳水化合物含量低和缓冲能值高等自身特性[8]。因此，添加乳酸菌制剂和富含可溶性碳水化合物的农副产物是解决灌木青贮饲料发酵不良的有效途径之一。
通常情况下，优质青贮饲料要求饲草表面附着乳酸菌数量达到或超过105 CFU/g(鲜重)，外源性添加乳酸菌制剂能满足豆科饲草青贮初期发酵所需乳酸菌数量。目前，外源性添加乳酸菌制剂已成为改善发酵品质方法之一[9]。Yan等[10]从我国南方高水分玉米青贮饲料中分离得到植物乳杆菌LP694，该菌株抗逆性强，产乳酸效率高，可降低意大利黑麦草青贮饲料纤维含量。米糠(rice bran，RB)是稻谷加工副产品，年产量约为2 000万t，其中约70%用作动物饲料[11-12]。有研究表明，米糠作为碳源可促进乳酸菌生长，提高青贮饲料乳酸含量[13-14]。基于此，我们推测米糠通过促进乳酸菌生长繁殖从而抑制青贮饲料中不良微生物活动来提高青贮质量。因此，本试验以花期刈割的揉丝柠条锦鸡儿为原料，以米糠、商业植物乳杆菌和植物乳杆菌LP694为青贮饲料添加剂，旨在比较米糠和不同乳酸菌制剂对柠条锦鸡儿青贮的发酵品质及微生物多样性的影响，以期为开发非常规饲料资源柠条锦鸡儿提供数据参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料选取种植年限为5年的柠条锦鸡儿，2019年5月4日盛花期收获于宁夏盐池人工柠条林，立即揉丝，运回实验室备用。同时，采取300 g柠条锦鸡儿样品装入液氮罐以备测定其营养成分及微生物多样性。米糠购于宁夏某科技实业有限公司，商业植物乳杆菌制剂购于天津某有限公司，植物乳杆菌LP694(保藏编号为CGMCC No.15073)由四川农业大学提供。柠条锦鸡儿和米糠的营养成分如表 1所示。
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表 1 柠条锦鸡儿和米糠的营养成分(干物质基础) Table 1 Nutrient composition of Caragana korshinskii and rice bran (DM basis) |
以花期柠条锦鸡儿为青贮原料，共设4个处理，分别为无添加(对照组)、添加5%米糠(RB组)、添加5%米糠+105 CFU/g商业植物乳杆菌(RB+LP组)和添加5%米糠+105 CFU/g植物乳杆菌LP694(RB+LP694组)。
柠条锦鸡儿水分含量采用Aurora型手持式近红外光谱仪测定，通过添加水将其水分含量调制为60%左右时按照上述进行处理。通过平板计数法测定商业乳杆菌和植物乳杆菌LP694活菌数量，将2种乳酸菌制剂稀释至105 CFU/g。每组4个重复，每个重复称取500 g左右调制好的样品装入青贮袋(30 cm×20 cm)中，真空封口机封口，置于室温贮存60 d。青贮60 d后测定营养成分、发酵特性及微生物多样性。
1.3 指标测定 1.3.1 营养成分和发酵特性测定取200 g柠条锦鸡儿原料及其青贮饲料样品于105 ℃杀青30 min，65 ℃烘箱烘48 h至恒重，测定干物质(dry matter，DM)含量，粉碎后过2 mm筛进行化学分析。中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)、酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)、粗蛋白质(crude protein，CP)和总氮(total nitrogen，TN)含量测定参照张丽英[15]，可溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate，WSC)含量测定参照李富国[16]。
取10 g柠条锦鸡儿青贮样品于90 mL蒸馏水中匀浆1 min，经4层纱布和双层滤纸过滤后获得青贮饲料浸提液，-20 ℃保存。分别用pH计(雷磁PHS-3G，上海仪电科学仪器股份有限公司)、苯酚-次氯酸钠比色法[17]、乳酸测试盒(A019-2-1型，乳酸脱氢酶法，南京建成生物工程研究所)和气相色谱仪(GC-2010，日本岛津公司)测定pH及氨态氮(NH3-N)、乳酸、乙酸含量。
1.3.2 微生物多样性测定使用FastDNAⓇ Spin Kit for Soil(MP Biomedicals公司，美国)试剂盒提取样品中细菌总DNA。选用细菌16S rRNA的V3~V4可变区338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)引物对所提取的DNA模板进行PCR扩增。使用Illumina MiSeq测序平台(Illumina公司，美国)进行测序，由上海美吉生物医药科技有限公司完成。
1.4 数据处理采用JMP软件通过拟合最小二乘法进行方差分析，组间差异利用Tukey HSD法进行多重比较，数据用平均值和均值标准误(SEM)表示，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。使用Uparse软件对有效序列进行操作分类单元(OTU)聚类(相似度97%以上)，利用RDP classifier比对Silva数据库(SSU132)对每条序列进行物种分类注释，设置比对阈值为70%。采用Mothur软件平台进行Alpha多样性分析。
2 结果与分析 2.1 柠条锦鸡儿青贮营养成分及发酵特性分析如表 2所示，与对照组相比，RB、RB+LP和RB+LP694组青贮饲料中NDF和ADF含量均显著降低(P<0.05)，RB和RB+LP694组青贮饲料中pH显著降低(P<0.05)，RB+LP694组青贮饲料中NH3-N/TN显著降低(P<0.05)，RB、RB+LP和RB+LP694组青贮饲料中乳酸含量及乳酸/乙酸均显著提高(P<0.05)，RB和RB+LP694组青贮饲料中乙酸含量显著降低(P<0.05)，RB和RB+LP组青贮饲料中丙酸含量显著提高(P<0.05)。各组之间青贮饲料中干物质和粗蛋白质含量无显著差异(P>0.05)。
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表 2 柠条锦鸡儿青贮营养成分及发酵特性(干物质基础) Table 2 Nutrient composition and fermentation characteristic of Caragana korshinskii silage (DM basis) |
如表 3所示，各组Coverage指数均在0.99以上，表明测序结果足以反映样本中绝大部分微生物物种信息。RB+LP组Shannon指数和Chao1指数显著高于对照、RB和RB+LP694组(P<0.05)，而RB+LP694组Chao1指数显著低于RB组(P<0.05)。上述结果说明不同添加剂处理影响了柠条锦鸡儿青贮微生物群落多样性。
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表 3 Alpha多样性指数 Table 3 Alpha diversity indexes |
柠条锦鸡儿青贮主坐标分析(PCoA)如图 1所示，柠条锦鸡儿原料及其青贮饲料在图中有明显分离，不同添加剂处理的青贮饲料之间亦有明显分离，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)解释度分别占总方差的64.13%和16.76%。
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FM：柠条锦鸡儿原料Caragana korshinskii raw material；Con：对照组control group；RB：RB组RB group；RB+LP：RB+LP组RB+LP group；RB+LP694：RB+LP694组RB+LP694 group。图 2同the same as Fig. 2。 图 1 柠条锦鸡儿青贮微生物群落的PCoA Fig. 1 Bacteria community PCoA of Caragana korshinskii silage |
基于门水平下柠条锦鸡儿青贮前后微生物组成如图 2-A所示，柠条锦鸡儿青贮原料中优势菌门为变形菌门(Proteobacteria，54.50%)、放线菌门(Actinobacteria，30.06%)、拟杆菌门(Bacteroidetes，9.57%)和厚壁菌门(Firmicutes，3.26%)。青贮60 d后，各组青贮饲料中优势菌门均为厚壁菌门，其次为变形菌门。对照、RB、RB+LP和RB+LP694组厚壁菌门相对丰度分别为73.02%、94.80%、68.81%和98.99%，变形菌门相对丰度分别为26.90%、4.82%、28.74%和0.96%。其中，RB+LP组中还含有相对丰度分别为1.45%和0.66%的放线菌门和拟杆菌门。
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图 2 基于门水平(A)和属水平(B)的柠条锦鸡儿青贮微生物相对丰度 Fig. 2 Microbial relative abundance based on phylum level (A) and genus level (B) of Caragana korshinskii silage |
基于属水平下柠条锦鸡儿青贮前后微生物组成如图 2-B所示，柠条锦鸡儿青贮原料中优势菌属为红球菌属(Rhodococcus，13.73%)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，12.70%)、泛菌属(Pantoea，7.09%)、薄层菌属(Hymenobacter，7.06%)、伯克氏菌属(Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia，2.37%)和大量其他菌属(56.23%)。青贮60 d后，各组青贮饲料中优势菌属均为乳杆菌属(Lactobacillus)。对照组中相对丰度较高的菌属为乳杆菌属(71.85%)、肠杆菌属(Enteobacter，19.62%)及未分类肠杆菌科(unclassfied_f_Enterobacteriaceae，6.98%)；RB组中相对丰度较高的菌属为乳杆菌属(91.81%)、醋杆菌属(Acetobacter，1.84%)、伯克氏菌属(1.18%)及片球菌属(Pediococcus，1.23%)；RB+LP组中微生物种类较多，乳杆菌属相对丰度仅占38.61%；RB+LP694组中乳杆菌相对丰度高达98.88%。
2.5 柠条锦鸡儿青贮微生物群落与发酵品质之间的相关性分析如图 3所示，醋杆菌属相对丰度与中性洗涤纤维(r=-0.68)和酸性洗涤纤维含量(r=-0.73)呈显著负相关(P<0.05)，伯克氏菌属相对丰度与中性洗涤纤维(r=-0.66)和酸性洗涤纤维相对丰度(r=-0.66)也呈显著负相关(P<0.05)。pH与乳杆菌属相对丰度呈极显著负相关(r=-0.75，P<0.01)，与肠球菌属(Enterococcus，r=0.78)、肠杆菌属(r=0.85)和未分类肠杆菌科相对丰度(r=0.80)呈极显著正相关(P<0.01)。乙酸含量与肠杆菌属(r=0.65)和未分类肠杆菌科相对丰度(r=0.68)呈显著正相关(P<0.05)。
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LA：乳酸lactic acid；PA：丙酸propionic acid；NDF：中性洗涤纤维neutral detergent fiber；ADF：酸性洗涤纤维acid detergent fiber；AA：乙酸acetic acid；NH3-N：氨态氮ammonia nitrogen。 *代表 0.01<P≤0.05，**代表 0.001<P≤0.010，***代表P≤0.001。右侧图例不同的颜色区间代表不同相关系数。 * represents 0.01<P≤0.05, ** represent 0.001<P≤0.010, and *** represents P≤0.001. Different color ranges represent different correlation coefficients in the right legend. 图 3 柠条锦鸡儿青贮微生物群落(属水平)与发酵品质之间的Spearman相关热图 Fig. 3 Spearman's correlation heatmap between bacterial community (genus level) and fermentation quality of Caragana korshinskii silage |
青贮原料特性是影响青贮发酵质量的重要因素。因柠条锦鸡儿为豆科灌木，具有WSC含量低、CP含量和缓冲能高的特性，因而单独青贮较难成功。本试验中，与对照组相比，RB、RB+LP和RB+LP694组青贮饲料中NDF和ADF含量均显著降低。RB+LP和RB+LP694组中纤维含量较低的原因可能是青贮发酵过程中微生物产生纤维溶解酶所致[10]。低pH有利于抑制青贮饲料中蛋白酶活性，从而降低NH3-N含量和蛋白质分解程度[18]。本试验中，CON和RB+LP组青贮饲料中pH较高，故NH3-N含量较高。而RB和RB+LP694组青贮饲料中pH较低，抑制了青贮饲料在发酵过程中的蛋白质降解，故NH3-N含量较低。乳酸/乙酸能反映青贮同型发酵程度，同型发酵程度越高越有利于降低青贮饲料pH。RB和RB+LP694组青贮饲料中乙酸含量低，乳酸含量和乳酸/乙酸高，同型发酵程度较高。张增欣等[19]通过研究丙酸对多花黑麦草青贮动态发酵影响得出，丙酸会通过抑制青贮初期某些不耐酸的乳酸菌来促进某些耐酸性的乳酸菌生长。本试验中，RB+LP组青贮饲料中丙酸含量较高，表明丙酸对该组中添加的商业植物乳杆菌具有抑制作用，从而导致青贮pH较高。综合营养成分和发酵特性来看，RB+LP694组青贮饲料具有较好的发酵品质。
3.2 不同添加剂处理对柠条锦鸡儿青贮微生物多样性的影响Shannon指数和Chao1指数分别反映样品微生物多样性和丰富度[10]。Shannon指数越大表明微生物多样性越高，Chao指数越大表明微生物丰富度越高。本试验结果表明，添加米糠可降低柠条锦鸡儿青贮微生物多样性，并增加乳杆菌属相对丰度。这是因为米糠具有相对丰富的WSC含量，促进乳酸发酵，抑制不良微生物增殖[20]。RB+LP694组柠条锦鸡儿青贮微生物多样性和丰富度降低是因为外源性添加的植物乳杆菌LP694成为优势菌属，抑制了其他微生物生长繁殖。RB+LP组柠条锦鸡儿青贮微生物多样性和丰富度提高，可能是因为商业乳杆菌未能在青贮初期快速降低青贮饲料pH，较高pH环境下适宜大量微生物生长繁殖。通过PCoA可知，柠条锦鸡儿原料及其青贮饲料之间微生物群落具有差异性，不同添加剂使得微生物群落发生了变化。
3.3 柠条锦鸡儿青贮微生物群落与发酵品质之间的相关性有研究表明，厌氧环境导致青贮微生物群落由变形菌门演替为厚壁菌门[21]。本试验结果表明，变形菌门是柠条锦鸡儿原料微生物群落的优势菌门，而青贮后微生物群落的优势菌门为厚壁菌门。变形菌门微生物为革兰氏阴性菌，与乳酸菌竞争利用WSC，导致青贮饲料中NH3-N含量增加[22]。厚壁菌门是革兰氏阳性菌，可以降解淀粉、蛋白质和纤维素等许多大分子化合物[23]。青贮发酵后变形菌门相对丰度的减少和厚壁菌门相对丰度的增加可能是导致RB和RB+LP694组青贮饲料中NDF、ADF和NH3-N含量减少的原因。
醋杆菌属微生物产乙酸，能够引发青贮有氧劣化[24]。醋酸菌(Acetobacter aceti)适宜生长于pH约为7.0的环境条件下，抑制乳酸菌生长后主导青贮发酵，从而形成富含醋酸菌的青贮饲料[25]，这可能是导致RB+LP组pH较高的原因之一。然而，Wang[26]等认为醋杆菌属微生物并不会影响青贮饲料pH，可能与微生物种类有关。因此，关注种水平下醋杆菌尤为重要。众所周知，乳杆菌属微生物在青贮过程中占主导地位，对青贮饲料pH的降低起着重要作用[27]。乳杆菌属是柠条锦鸡儿青贮中优势菌属，RB+LP694和RB组中的乳杆菌属相对丰度较高，其中，RB+LP694组中乳杆菌属为柠条锦鸡儿青贮中占绝对优势菌属。这表明米糠可为柠条锦鸡儿青贮中乳酸菌繁殖提供发酵基质，使外源添加的植物乳杆菌LP694更适宜在柠条锦鸡儿青贮中生长。然而，RB+LP组中乳杆菌属相对丰度较低，且含有醋杆菌属和未分类肠杆菌科，表明商业乳杆菌不适宜做柠条锦鸡儿青贮添加剂。对于青贮饲料而言，原料中附生微生物不仅在青贮饲料自然发酵中发挥重要作用，而且由于微生物生态系统中营养物质的竞争或相互作用，将影响外源接种剂的有效性。
通过Spearman相关性分析可知，肠杆菌属及未分类肠杆菌科相对丰度与pH和乙酸含量呈正相关。本试验中，对照组中含有较高相对丰度的肠杆菌属和未分类肠杆菌科，RB+LP组中含有较高相对丰度的未分类肠杆菌科，因而二者发酵品质不佳。这是因为不良微生物肠杆菌在青贮饲料中虽然是非致病菌，但其在发酵初期与乳酸菌竞争WSC，青贮pH降低缓慢，产生NH3-N和乙酸等产物[28-29]。本研究结果表明，乳杆菌属相对丰度与pH呈负相关，这与赵嫚等[30]研究结果一致。RB+LP694组中乳杆菌属占绝对主导地位，因而青贮pH最低，发酵品质相对更好。此外，醋杆菌属、伯克氏菌属相对丰度与中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量呈负相关，说明这2种菌属的微生物在柠条锦鸡儿青贮发酵过程中在降低纤维含量方面可能发挥了重要的作用，在后续研究中应予以重视。
4 结论① 从发酵品质来看，添加5%米糠+105 CFU/g植物乳杆菌LP694比添加5%米糠在降低柠条锦鸡儿青贮的pH和NH3-N含量、提高乳酸含量和乳酸/乙酸方面效果更佳，添加5%米糠+105 CFU/g商业植物乳杆菌对发酵品质改善效果较差。
② 不同添加剂改变了柠条锦鸡儿青贮的微生物组成，添加5%米糠和5%米糠+105 CFU/g植物乳杆菌LP694增加了厚壁菌门和乳杆菌属相对丰度，并降低了变形菌门和肠杆菌属相对丰度，而添加5%米糠+105 CFU/g商业植物乳杆菌则降低了乳杆菌属相对丰度。
③ 本试验中，综合发酵品质和微生物组成，柠条锦鸡儿青贮时添加5%米糠+105 CFU/g植物乳杆菌LP694效果最好。
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