我国生猪养殖产业规模庞大，每年会产生大量粪便污染物，其中富含的氮、磷、铜、锌等元素会随着雨水等沉降到地下，对养殖场周边的土地和水体造成污染[1-2]。氮、磷在水体的富集往往造成水华现象，损害水体生态[3]。重金属对土壤及水体的污染，造成重金属在农产品、水产品中的富集，通过食物链最终损害人体健康。2018年我国21个省市猪场粪污重金属含量的调查研究发现，铜、锌的超标率分别高达95.2%和85.7%[4]。因此，降低生猪养殖粪便中氮、磷及重金属元素的排放刻不容缓。由于育肥猪饲养周期长，采食量高，粪污排放量大，因此减少育肥阶段猪的粪便污染物排放是控制猪场整体污染物排放的关键[5-6]。磷、铜、锌等都是猪只生长发育所必须的常量或微量元素，玉米-豆粕型饲粮中大部分的磷都以植酸磷的形式存在，猪只难以利用，铜、锌的含量也非常低，难以满足猪只生长需要，通常需要在饲粮中额外添加无机磷、硫酸铜、硫酸锌等进行补充，但是猪只对无机铜、锌的消化效率较低，因此会有大量的磷、铜、锌会随着粪便排放到土壤及水体中对环境造成污染[7]。过去的研究表明，在降低磷添加量的饲粮中添加植酸酶，可维持有效磷满足猪只生长发育的同时降低饲粮总磷含量，进而降低粪污中磷的排放[8]，同时植酸酶还可以解除植酸对于金属元素的络合作用，从而提高其吸收率[9]。根据NRC(2012)的推荐量，130 kg育肥猪饲粮中铜、锌添加量分别为2.96、50 mg/kg，而目前实际生产中的铜、锌元素添加量通常高于这一要求，且NRC(2012)标准未考虑植酸酶对金属元素吸收率的提高效果，因此在饲粮中添加植酸酶之后，微量元素添加量是否可以进一步降低?本试验在低磷-植酸酶饲粮中降低微量元素添加量来降低粪便重金属含量，同时探究对育肥猪生长性能、肉品质、血清总抗氧化能力、肠道形态、营养物质表观消化率、血清钙、磷含量和粪便重金属含量的影响，以寻找一种高效经济的粪便重金属减排方法。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲粮采取随机区组试验设计，选取60头初始平均体重为(131.45±0.45) kg的杜×长×大育肥猪，根据性别和体重随机分为3组，分别为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组，每组5个重复，每个重复4头猪，公母各占1/2，同1个重复饲养在同一圈栏内。对照组饲喂标准玉米-豆粕型基础饲粮，参照NRC(2012)推荐量配制，总磷含量为0.35%，微量元素添加量为0.06%。试验Ⅰ和Ⅱ组饲喂的低微量元素低磷-植酸酶饲粮是在基础饲粮中减少磷和微量元素的添加，并添加1 000 U/kg植酸酶，试验组低磷饲粮中总磷含量为0.24%，试验Ⅰ组添加0.03%的微量元素，试验Ⅱ组不添加微量元素。试验期28 d。饲粮组成及营养水平见表 1，各组饲粮铜、锌添加量和实测含量见表 2。
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表 1 饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (air-dry basis) |
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表 2 饲粮的微量元素添加量及实测含量(风干基础) Table 2 Additive amount and measured amount of trace elements of diets (air-dry basis) |
本试验在广东省农业科学院白云试验基地展开，试验猪每日09：00和16：00各饲喂1次，整个试验期间试验猪只自由采食、饮水，驱虫、消毒及免疫均按猪场常规饲养管理程序进行。
1.3 检测指标 1.3.1 生长性能以个体为单位逐一称取空腹体重，以重复为单位计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.3.2 肌肉品质试验结束当天，每个重复挑取1头接近平均体重的公猪进行屠宰，称取胴体重量，计算屠宰率。剔取左侧胴体第3肋骨处至尾椎处背最长肌肉样，待测肉品质参数。参照《NY/T 821—2019猪肉品质测定技术规程》测定肉色(45 min、24 h和48 h)，pH(45 min、24 h和48 h)，滴水损失，剪切力，肌内脂肪含量。
1.3.3 肌纤维特性取猪左侧胴体胸腰椎连接部背最长肌样品，固定、切片、苏木精-伊红(HE)染色后测量并计算肌肉纤维直径及密度。分析软件为CaseViewer 2.4.0。每张切片随机挑选至少3个肌纤维横截面清晰的视野，计算得到肌纤维密度(根/mm2)；每张切片随机挑选10根边缘清晰的肌肉纤维，测量肌纤维直径(μm)。以重复测量数据的算数平均值作为最终测量结果。
1.3.4 血清抗氧化活性及钙、磷含量试验结束，耳静脉采集血样5 mL，4 000 r/min 4 ℃离心10 min，分离血清后分装保存于-80 ℃冰箱中，待测血清总抗氧化能力(T-AOC)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)、铜锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、铜蓝蛋白(CP)活性和钙、磷含量，以上指标测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定方法按照说明书要求进行。
1.3.5 肠道形态试验猪屠宰后截取中段空肠、末段回肠约1 cm，经预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗后浸于多聚甲醛溶液中固定保存，样品经由包埋、切片、HE染色后使用CaseViewer 2.4.0软件测量肠道绒毛高度和隐窝深度。每个样品随机选择5根绒毛进行测量后取算数平均值。
1.3.6 营养物质表观消化率试验结束前连续3 d每个重复收集新鲜粪便约300 g，保存于-20 ℃冰箱中。将每个重复3 d的粪便样品均匀混合后在65 ℃烘箱内烘干48 h后粉碎，采用四分法取约100 g样品，用于测定干物质、粗灰分、粗蛋白质和二氧化钛(TiO2)含量，测定方法分别参考《GB/T 6432—2018饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》、《GB/T 6435—2014饲料中水分的测定》、《GB/T 6438—2007饲料中粗灰分的测定》、《GB 5009.246—2016食品中二氧化钛的测定》。使用以下公式计算试验猪对干物质、粗灰分、粗蛋白质的表观消化率：
营养物质表观消化率(%)＝[1-(粪便中该营养
物质含量×饲粮中TiO2含量)/(饲料中该营养
物质含量×粪便中TiO2含量)]×100。
1.3.7 粪便中磷和重金属含量样品采集方法参考1.3.6，取样测定磷、铜、锌含量。磷测定法参照《GB/T 6437—2018饲料中总磷的测定分光光度法》，铜、锌测定方法参照《GB 5009.268—2016食品安全国家标准食品中多元素的测定》。
1.4 数据处理与统计分析试验结果用平均值±标准误表示，其中生长性能数据n=20，其余测定指标数据n=5。采用SPSS 12.0统计软件中的one-way ANOVA进行方差分析，差异显著时使用LSD进行多重比较，以0.05≤P < 0.10表示有变化趋势，以P < 0.05表示差异显著，以P < 0.01表示差异极显著。
2 结果与分析 2.1 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪生长性能的影响由表 3可知，各组之间ADG、ADFI、F/G等均无显著差异(P>0.05)，在低磷-植酸酶饲粮中降低或不添加微量元素对育肥猪上市前的生长性能无显著影响(P>0.05)。
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表 3 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪生长性能的影响 Table 3 Effects of low trace element and low phosphorus phytase diets on growth performance of finishing pigs |
由表 4可知，各组之间背最长肌的屠宰率、肉色、滴水损失、pH、剪切力、肌内脂肪含量均无显著差异(P>0.05)，在低磷-植酸酶饲粮中降低或不添加微量元素对130~150 kg育肥猪肌肉品质无显著影响(P>0.05)。
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表 4 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪肌肉品质的影响 Table 4 Effects of low trace element and low phosphorus phytase diets on meat quality traits of finishing pigs |
由表 5可知，各组之间背最长肌的肌纤维密度、肌纤维直径均无显著差异(P>0.05)，提示在低磷-植酸酶饲粮中降低微量元素添加对育肥猪肌纤维特性无显著影响(P>0.05)。
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表 5 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪肌纤维特性的影响 Table 5 Effects of low trace element and low phosphorus phytase diets on myofiber characteristics of finishing pigs |
由表 6可知，各组之间的血清T-AOC及T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD、CP活性及钙含量均无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，试验Ⅰ组显著提高了血清磷含量(P < 0.05)，约12.87%，而其他各组间不存在显著差异(P>0.05)。
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表 6 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪血清抗氧化及血清钙、磷含量的影响 Table 6 Effects of low trace element and low phosphorus phytase diets on serum antioxidant and calcium and phosphorus contents of finishing pigs |
由表 7可知，与对照组比较，试验Ⅰ和Ⅱ组对育肥猪十二指肠和回肠的绒毛高度、隐窝深度及空肠的隐窝深度均无显著影响(P>0.05)；试验Ⅰ组空肠绒毛高度相比对照组有上升趋势(0.05 < P < 0.10)，而试验Ⅱ组空肠绒毛高度相比对照组显著上升(P < 0.05)。且试验Ⅰ组与试验Ⅱ组之间肠道绒毛高度、隐窝深度、隐绒比均不存在显著差异(P>0.05)。
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表 7 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪肠道形态的影响 Table 7 Effects of low trace element and low phosphorus phytase diets on intestinal morphology of finishing pigs |
由表 8可知，与对照组比较，试验Ⅰ和Ⅱ组粗蛋白质表观消化率有上升的趋势(P=0.074)，但干物质和粗灰分表观分消化率极显著提高(P < 0.01)，干物质表观消化率分别上升了2.88%和2.31%，粗灰分表观消化率分别上升了50.33%和45.33%。
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表 8 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪营养物质表观消化率的影响 Table 8 Effects of low trace element and low phosphorus phytase diets on nutrient apparent digestibility of finishing pigs |
由表 9可知，与对照组比较，试验Ⅰ和Ⅱ组粪便氮元素含量无显著影响(P>0.05)，但粪便粗灰分、磷、铜、锌含量极显著降低(P < 0.01)，其中粗灰分含量分别下降了12.71%和10.46%，磷含量分别下降了27.86%和19.85%，铜含量分别下降了26.08%和53.51%，锌含量分别下降了40.21%和72.58%。与试验Ⅰ组比较，试验Ⅱ组粪便铜、锌的含量显著降低(P < 0.05)。
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表 9 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪粪便污染物含量的影响 Table 9 Effects of low trace element and low phosphorus phytase diets on fecal pollutant content of finishing pigs |
磷是动物生长发育所必需的常量元素，在营养物质代谢、骨骼形成等方面发挥重要作用[10-11]。饲粮中缺少磷会使生长猪的ADG显著降低，在低磷饲粮中添加植酸酶可以消除这一不良影响，将ADG恢复到正常水平[12-13]。研究发现，降低饲粮中磷含量并添加植酸酶不会提高断奶仔猪[14-15]、生长猪[3, 12, 16]、育肥猪[13, 17]的生长性能，降低饲粮中铜、锌添加量并添加植酸酶对育肥猪的生长性能亦无显著影响[18]。而减少磷添加量可以降低饲料成本，提高经济效益[16]。据报道，即使不添加植酸酶，从宰前20[19]或30 d[20]起停止在饲粮中添加矿物元素，对育肥猪的生长性能也没有显著影响。本试验在低磷-植酸酶饲粮中降低微量元素的添加量，并未对育肥猪上市前1个月的生长性能产生显著影响，与前人的研究结果一致。本研究对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组的锌含量实测值分别为76、51、20 mg/kg，NRC(2012)和《猪营养需要量》(GB/T 39235—2020)规定100 kg以上的育肥猪饲粮中锌含量应高于50 mg/kg，可以看出试验Ⅱ组的锌含量低于此标准，但该组的生长性能并未显著下降，与其他研究者[21-24]的结论也与本研究结果一致。
3.2 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪肌肉品质和肌纤维特性的影响猪肉品质由肉色、滴水损失、pH、肌内脂肪、剪切力等指标组成，主要受遗传背景、营养调控、宰前与屠宰过程等影响[25]。矿物元素在肉质调控中具有一定作用，铁是血红蛋白和肌红蛋白的重要组成部分，提高添加量可以使肉色更加鲜红[26]；铜可以促进动物生长，但高剂量时会导致脂肪中不饱和脂肪酸比例上升，容易氧化酸败[26]。同时铁、铜、锌、锰、硒还是多种抗氧化酶的重要组成部分，对于防止猪肉脂肪氧化产生异味、延长保存时间具有重要作用。剪切力对肌肉口感有很大影响，剪切力高的肉难以咀嚼，消费者的接受程度低。一般来说肌纤维直径越高，单位密度内的肌纤维密度越低，切断肌纤维需要更高的剪切力[27]，本试验各组之间的肌纤维直径、密度和剪切力均无显著差异，也验证了这一结果。本试验使用的微量元素制剂主要含铁、铜、锌、锰、硒、碘等，对照组和试验组间肉品质指标无显著差异，下文也会提到各组间血清总抗氧化能力没有显著差异，这2方面的结果可以相互印证。过去也有研究指出在宰前20 d停用矿物微量元素不会使肉品质出现显著差异[19]，在不同类型的低磷饲粮中添加植酸酶均未对肉品质产生显著影响[28]，与本研究的结果一致。
3.3 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪血清抗氧化能力和钙、磷含量的影响微量元素如铁、铜、锌、锰、硒是CAT、CuZn-SOD、Mn-SOD、CP、GSH-Px等多种抗氧化酶的重要组成部分，在提高抗氧化能力中起着重要作用。但据报道，降低铜或锌的添加量不会对CuZn-SOD[23]、CP[18]活性造成影响，与本研究的结果一致。本试验表明，降低饲粮磷含量并添加植酸酶会导致血清磷含量显著上升，对血清T-AOC和钙含量无显著影响。王志恒等[29]在研究不同无机磷水平饲粮添加植酸酶对保育猪血清磷含量的影响发现，以无植酸酶基础饲粮为对照组的无机磷添加量为100%，当植酸酶饲粮无机磷添加量≥75%时，保育猪血清磷含量相比对照组显著上升，此后随着植酸酶饲粮中无机磷添加量的减少线性下降。由此推测，植酸酶可以提高磷元素的吸收率，与本研究结果一致。
3.4 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪肠道形态的影响肠道绒毛高度和隐窝深度是判断肠道发育的重要指标，绒毛高度上升意味着食糜与肠黏膜的接触面积增加，可以更好地吸收饲粮中的营养物质[30]。本试验表明，在低磷-植酸酶饲粮中降低微量元素的添加量，可以显著提高空肠绒毛高度，但对空肠隐窝深度和其他肠段的形态没有显著影响，前文中提到试验组的干物质和粗灰分表观消化率显著上升，推测可能是由于空肠绒毛高度的上升提高了这些营养物质的吸收效率。
3.5 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪营养物质表观消化率的影响植酸酶除了提高磷的利用率之外，还可以释放被植酸螯合的矿物元素、蛋白质和氨基酸等营养物质[7, 31]。本研究表明，在低磷-植酸酶饲粮中降低微量元素的添加量，可以极显著提高干物质和粗灰分表观消化率，但是对粗蛋白质表观消化率无显著影响。任善茂等[18]研究发现在降低育肥猪饲粮中的铜、锌含量并添加植酸酶会使干物质、粗蛋白质、粗灰分表观消化率显著下降；董其国等[17]研究发现降低饲粮中磷水平并添加植酸酶会使育肥猪的干物质、粗蛋白质、粗灰分表观消化率显著上升，本试验和后者的研究结果一致，和前者的结果相反。产生这一结果的原因可能是添加了植酸酶的饲粮中磷元素含量对于营养物质表观消化率的影响要大于微量元素含量的影响，也有可能是这些试验的基础磷、微量元素含量以及试验猪的初始状态有一定差异，具体影响机制有待进一步研究。
3.6 低微量元素低磷-植酸酶饲粮对育肥猪粪便污染物含量的影响氮、磷、微量元素都是猪只生长发育所必须的营养物质，但猪对于饲粮中的这些营养物质并不能完全利用，有相当一部分会随着粪便排出体外，处理不当极易造成环境污染。其中，氮会以氨气的形式挥发进入大气，还可以在土壤中的硝化菌作用下转变成硝酸盐；氮、磷流入水体会造成富营养化，影响水体生态[3]；铜、锌、锰、镍、铅、铬、砷等重金属元素具有难迁移、难降解、易富集以及危害大等特点，对生态环境、农产品安全、人类健康等方面都造成了恶劣影响[32]。特别是猪粪便中的重金属含量远高于牛、鸡、鸭等其他畜禽的粪便，是目前养殖行业重金属污染的最大来源[33]。大量调查显示，我国多个省市自治区的猪场粪便重金属普遍存在超标现象，场址周边的土壤和水体中重金属含量也显著高于其他地区[34-37]。本试验饲粮中铜和锌的主要来自于预混料中添加的微量元素制剂，试验Ⅰ和Ⅱ组的微量元素添加量分别下降了50%和100%，粪便中铜含量分别下降了26.08%和53.51%，锌含量分别下降了40.21%和72.58%，说明粪便和饲粮中的铜、锌含量有明显相关性；磷主要来源于磷酸氢钙，试验组饲粮中磷的含量相比对照组下调了31.43%，因此粪便中的磷含量也有了显著下降；本研究结果表明，在低磷-植酸酶饲粮中降低微量元素的添加可以显著减少育肥猪粪便中磷、铜、锌等元素的含量，对于减轻猪粪造成的环境污染能起到一定的积极作用。
4 结论育肥猪出栏前4周，饲喂降低微量元素添加量的低磷-植酸酶饲粮，可以极显著降低猪粪便中的磷以及铜、锌等重金属元素的含量，提高干物质、粗灰分表观消化率，改善空肠绒毛形态，且对育肥猪的生长性能和肉品质未见负面影响。
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