饲养不健康的犊牛会对奶牛的生长性能和福利产生负面影响，增加抗生素的使用量，并可能对未来的产奶量或者生长性能产生长期负面影响[1]。刚出生犊牛的免疫系统未发育成熟，而且犊牛无法从母牛胎盘获得充足的免疫成分如免疫球蛋白[2]。因此，在出生后的第1个月，犊牛对传染病的敏感性相对较高。世界卫生组织在全球范围内禁止饲用抗生素的使用[3]。我国农业农村部自2020年始也退出除中草药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种。在提高畜禽健康和生长性能方面，最有希望的方法之一是使用替代饲料抗生物的生物活性物质，如草药、植物和谷物等的提取物。与饲料中的抗生素相比，代乳粉或者奶中添加植物提取物可以促进幼龄动物的生长性能并减少腹泻发生[4]。酚类化合物是具有生物活性的植物化学物质的主要成分，广泛分布在植物中，表现出抗氧化和抗菌特性，并具有改善健康的作用[5]。没食子酸(gallic acid)是一种天然存在于植物中的含酚有机酸，从植物提纯的没食子酸具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等生物学功能[6]。近年来，没食子酸和含有没食子酸的植物提取物在畜牧生产中的应用研究已取得一定进展。国内外相关研究表明，饲粮中添加没食子酸可促进家禽和生长猪的生长，并改善饲料效率[7-8]。此外，没食子酸具有较强的还原性，因此饲粮中添加没食子酸可清除动物机体过多的氧化自由基，从而提高抗氧化能力，维持机体氧化还原平衡[9]。没食子酸还具有改善动物肠道发育和健康状态的功能。家禽和仔猪饲喂添加没食子酸的饲粮可显著促进肠道绒毛、隐窝以及肠道屏障的发育，从而改善家畜对营养物质的吸收和利用[10]。饲粮中添加没食子酸可改善动物肠道形态并调节微生物多样性，从而调控动物肠道的吸收功能和健康[7]。
目前国内外关于没食子酸在畜禽上的研究主要集中于猪和家禽，而没食子酸对反刍动物的影响鲜有报道。因此，本试验旨在研究没食子酸对断奶前犊牛生长性能及血浆生化、抗氧化和免疫指标的影响，探讨没食子酸在荷斯坦犊牛上的应用效果，并为其在反刍动物生产中的应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计与饲养管理所有动物试验操作均按照东北农业大学动物保护委员会的原则和操作指南进行(编号：NEAU-[2011]-9)。本试验在哈尔滨松花江奶牛场进行，选取12头体重(39.52±1.68) kg、健康状况良好的荷斯坦新生母犊牛，随机分为2组，每组6头。对照组开食料中不添加没食子酸，没食子酸组开食料中添加1 g/kg没食子酸，同时2组每头犊牛均饲喂牛奶6 L/d。试验期56 d。本试验中没食子酸纯度≥900 g/kg，开食料组成及营养水平如表 1所示。
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表 1 开食料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the starter (DM basis) |
每天07:00、12:00和18:00使用奶桶饲喂犊牛，每次饲喂2 L。牛奶(干物质含量13.5%，粗蛋白质含量25.5%，粗脂肪含量35.6%)在饲喂前经过80 ℃的巴氏杀菌并降温至39 ℃方可饲喂。开食料在犊牛出生1周之后开始提供，并保证每天至少有10%的开食料剩余，在整个试验期所有犊牛均在1.4 m×2.0 m的单栏中饲喂，自由饮水和采食。
1.2 生长性能测定每天准确记录犊牛的饲喂量和剩料量，并计算每天开食料采食量。第28天和第56天对犊牛进行称重及体尺(体高、体斜长和胸围)测量，并计算平均日增重和饲料效率。
1.3 饲料样品采集与测定对饲料样品进行每周取样，最终混合成饲料样品分析其营养成分，饲料样品于55 ℃烘干48 h，回潮24 h，粉碎过40目筛。按AOAC(2000)方法测定干物质、粗蛋白质和粗脂肪含量[11]。根据Van Soest等[12]方法用耐热α-淀粉酶测定中性洗涤纤维含量。
1.4 血浆样品采集与分析在试验第1天、第28天和第56天晨饲后3 h于犊牛颈静脉采血，并用负压肝素钠管收集血液，1 960×g离心15 min，将分离的血浆分装于1.5 mL清洁的离心管中，-20 ℃保存，待测。
血浆生化指标：血浆总蛋白(TP)、球蛋白(GLB)含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)活性由北京华英生物技术研究所协助检测，试剂盒购自北京中生北控生物科技股份有限公司，测定仪器型号为迈瑞BS-420全自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)。
血浆抗氧化指标：血浆总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)和丙二醛(MDA)含量使用试剂盒测定，试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。
血浆免疫指标：血浆免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)含量使用试剂盒测定，试剂盒均购自于南京建成生物工程研究所。血浆肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测，试剂盒均购自北京华英生物技术研究所，测定仪器型号为华卫德朗DR-200BS酶标分析仪(无锡华卫德朗仪器有限公司)。
1.5 数据处理和分析试验数据先用Excel 2010进行初步整理，然后使用SAS 9.4软件中的GLM进行数据分析，结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。P≤0.05为差异显著，P≤0.01为差异极显著。
2 结果 2.1 没食子酸对断奶前犊牛生长性能的影响由表 2可知，第1~28天，对照组和没食子酸组之间犊牛开食料采食量、平均日增重和饲料效率无显著差异(P＞0.05)。第29~56天，与对照组相比，没食子酸组开食料采食量和平均日增重显著升高(P＜0.05)，饲料效率无显著差异(P＞0.05)。
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表 2 没食子酸对断奶前犊牛生长性能的影响 Table 2 Effects of gallic acid on growth performance of pre-weaning calves |
由表 3可知，第28天和第56天，对照组和没食子酸组之间犊牛体重、体高、体斜长和胸围无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 没食子酸对断奶前犊牛体重和体尺的影响 Table 3 Effects of gallic acid on body weight and body measurement of pre-weaning calves |
由表 4可知，第28天和第56天，对照组和没食子酸组之间犊牛血浆TP、GLB含量和AST、ALT活性以及AST/ALT无显著差异(P＞0.05)。
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表 4 没食子酸对断奶前犊牛血浆生化指标的影响 Table 4 Effects of gallic acid on plasma biochemical indices of pre-weaning calves |
由表 5可知，第28天，对照组和没食子酸组之间犊牛血浆T-SOD、CAT活性和T-AOC以及MDA含量无显著差异(P＞0.05)。第56天，与对照组相比，没食子酸组血浆CAT活性(P=0.05)和T-AOC(P＜0.05)显著升高，血浆MDA含量显著降低(P=0.05)，血浆T-SOD活性无显著差异(P＞0.05)。
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表 5 没食子酸对断奶前犊牛血浆抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of gallic acid on plasma antioxidant indices of pre-weaning calves |
由表 6可知，第28天，与对照组相比，没食子酸组血浆IgG含量极显著升高(P=0.01)，血浆TNF-α含量显著降低(P＜0.05)，血浆IgA、IgM和IL-6含量无显著差异(P＞0.05)。第56天，与对照组相比，没食子酸组血浆IgA含量显著升高(P＜0.05)，血浆TNF-α含量极显著降低(P＜0.01)，血浆IgG、IgM和IL-6含量无显著差异(P＞0.05)。
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表 6 没食子酸对断奶前犊牛血浆免疫指标的影响 Table 6 Effects of gallic acid on plasma immune indices of pre-weaning calves |
没食子酸为一种新型植物提取物，添加在饲粮中可促进畜禽生长性能提高饲料效率。Samuel等[8]研究报道，饲粮中添加75~100 mg/kg没食子酸可以改善肉仔鸡生长性能、饲料利用率及肌肉率。Salaheen等[13]研究表明，饮水中添加没食子酸可提高肉仔鸡的体重。韩国清等[14]研究表明，断奶仔猪饲粮中分别添加没食子儿茶素没食子酸酯，仔猪的平均日采食量和平均日增重均显著提高。本试验结果表明，饲粮中添加没食子酸可显著提高5~8周犊牛开食料采食量和平均日增重。采食量的提高可能与没食子酸增加了开食料的涩味刺激了犊牛的食欲有关[15]，第1~28天犊牛开食料采食量并未明显增加可能是由于其日龄较小，主要依靠牛奶获取营养物质，开食料摄入较少，同时开食料从出生1周后开始提供，没食子酸摄入时间较短。平均日增重的提高可能是由于没食子酸组的犊牛具有更高的开食料采食量，从而为生长和发育提供更多的营养物质。Cai等[10]研究报道，饲粮中添加没食子酸对仔猪平均日增重和平均日采食量无显著影响，但与对照组相比，400 mg/kg没食子酸组的腹泻发生率明显降低。
3.2 没食子酸对断奶前犊牛体重和体尺的影响犊牛体重和骨骼发育也可直接反映出动物生长性能。培育犊牛的成本占牧场总成本的20%[16]。此外，犊牛早期的生长性能对未来的产奶量也有显著影响。Chester-Jones等[17]研究表明，在犊牛前6周体重每增加1 kg，第1次泌乳时产奶量增加456 kg。Oliveira等[18]研究发现，饲喂石榴提取物(多酚)对犊牛30和70日龄的体重均无显著影响，与本试验结果一致。没食子酸对犊牛体尺的研究较少，本试验结果显示没食子酸对犊牛体重和体尺均无显著影响。
3.3 没食子酸对断奶前犊牛血浆生化指标的影响血浆生化指标反映出营养物质的代谢情况和健康水平。血浆TP含量反映犊牛对饲粮蛋白质的消化和吸收情况，本试验中，饲粮中添加没食子酸可促进犊牛开食料采食量，但是对血浆TP含量无显著影响，说明犊牛可能利用这部分蛋白质来进行肌肉组织的合成，从而改善平均日增重。Samuel等[8]研究报道，饲粮中添加没食子酸在改善肉仔鸡生长性能的情况下不影响血浆TP含量。血浆AST和ALT活性以及AST/ALT是反映机体肝脏功能的重要指标[19]。本试验中，饲粮中添加没食子酸对犊牛血浆AST和ALT活性无显著影响，说明饲粮中添加没食子酸不会对断奶前的肝脏功能产生负面影响。
3.4 没食子酸对断奶前犊牛血浆抗氧化指标的影响血浆抗氧化指标可作为动物维持氧化还原平衡的重要指标[20]。饲喂大鼠葡萄籽原花青素增加了小肠黏膜的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，并降低小肠黏膜MDA含量，可能是由于葡萄籽原花青素富含没食子酸等酚类化合物[21]。Owumi等[22]研究也表明，没食子酸能保护黄曲霉毒素B1诱导的大鼠肾脏和肝脏的氧化应激损伤。没食子酸是一种天然的植物酚类化合物，在脂质系统中是一种强抗氧化剂，没食子酸可清除羟基(-OH)和降低脱氧核糖的氧化损伤[23]。但Cai等[10]研究表明，饲粮中添加没食子酸对脂多糖模型的断奶仔猪血浆T-AOC无显著影响。在断奶前，犊牛容易受到营养、环境和群体带来的各种应激，从而影响犊牛的健康发育，因此，提高断奶前犊牛抗氧化能力是培育健康犊牛的重要手段[24]。本试验中，饲粮中添加没食子酸改善了犊牛第56天的抗氧化能力，有助于保护犊牛免受应激引起的氧化损伤。
3.5 没食子酸对断奶前犊牛血浆免疫指标的影响犊牛体内免疫球蛋白和炎症因子含量是反映机体免疫功能的重要指标[25]。Cai等[10]研究表明，饲粮中添加没食子酸可以提高断奶仔猪回肠黏膜分泌的IgA含量，并降低小肠黏膜TNF-α的表达量。这与本试验中第56天血浆IgA含量显著升高、血浆TNF-α含量极显著降低的结果一致。同时，Jiang等[26]研究表明，饲粮中添加没食子酸可以促进猪的中性粒细胞的IL-6含量和抑制TNF-α含量。此外，没食子酸通过抑制核因子-κB亚基p65(NF-κB p65)和IL-6/磷酸化信号转导和转录活化因子3Y705(p-STAT3Y705)表达也具有潜在的抗炎作用[27]。所以本试验中炎症因子含量的降低可能是由于核因子-κB(NF-κB)抑制蛋白(IκB)的磷酸化水平显著降低，并且抑制了NF-κB的活化，或者通过抑制转导因子p-STAT3Y705与信号转录的激活并减少其在细胞内的积累来防止犊牛的炎症反应。Owumi等[22]研究也表明，没食子酸能通过降低TNF-α和白细胞介素-1β和提高白介素-10的表达保护黄曲霉毒素B1诱导的大鼠肾脏和肝脏的炎症反应。由此推测，没食子酸可以通过调节免疫球蛋白的分泌，改善犊牛炎症反应，从而提高免疫力，抵御外界病原体的入侵。
4 结论① 饲粮中添加没食子酸能够提高第29~56天的犊牛平均日增重和开食料采食量。
② 饲粮中添加没食子酸能够提高犊牛血浆抗氧化酶活性和降低丙二醇含量，从而改善机体抗氧化功能。
③ 饲粮中添加没食子酸能够增加犊牛血浆免疫球蛋白含量，并降低血浆TNF-α含量。
④ 综上所述，饲粮中添加没食子酸有利于促进断奶前犊牛生长和维持健康状态。
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