反刍动物瘤胃中真菌虽占比少,但其对饲粮中粗饲料的降解作用却至关重要,其主要是利用特有的假根系统附着于粗饲料的木质化组织,通过分泌大量纤维素酶、木质素酶和其他水解酶裂解植物木质化组织,以促进其他瘤胃微生物对粗饲料的附着和降解[1]。有研究证实,在无瘤胃细菌存在的条件下,瘤胃真菌能降解粗纤维饲料中干物质的62%[2]。也有研究显示去除真菌后的瘤胃液可在不影响动物采食量、原虫和细菌的种类和数量的情况下减慢高纤维饲粮干物质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维的降解速率,而在补充真菌后,这些物质的降解速率又有所上升[3-4]。荞麦秸秆由于纤维含量高、适口性差、消化吸收率低等特性,直接饲喂不能有效提高动物的生长性能,导致养殖效益低。因此,在无抗背景下开发荞麦秸秆高效饲用技术对于畜牧业有积极影响。甘露寡糖(MOS)为一种新型饲料添加剂,主要通过富含MOS的酵母细胞壁发酵获得,具有促进有益菌增殖、吸附病原菌、改善肠道微生态、提高动物抵抗力等功能。相比抗生素而言,MOS具有无污染、无残留及无其他副作用等优点。本团队前期研究显示,在荞麦秸秆饲粮中添加不同水平MOS对滩羊瘤胃液pH、氨态氮(NH3-N)浓度无显著影响,滩羊瘤胃液pH和NH3-N浓度均在正常变化范围内,并均可保证滩羊瘤胃内环境正常,添加2%MOS可增加拟杆菌门、厚壁菌门等瘤胃降解菌群的数量,从而加强滩羊对饲粮中纤维物质的降解功能[5]。本研究在上述结果的基础上,结合内部转录间隔区(ITS)测序分析技术,探究不同比例MOS在荞麦秸秆饲粮条件下对滩羊瘤胃真菌菌群结构的影响,从而进一步揭示滩羊瘤胃真菌菌群对纤维物质降解能力。
1 材料与方法 1.1 试验动物与饲粮组成本试验于2019年5—9月在宁夏农垦贺兰山牛羊产业(集团)有限公司开展,试验开始前做好羊舍清洁、消毒等防疫工作。选择健康无病、体重在30.5 kg左右的宁夏断奶滩羊羯羊20只,随机分成4组,每组5只,独笼饲养。基础饲粮配制参考《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004),饲粮精粗比为30 ∶ 70,荞麦秸秆(0.1%纤维素酶、1.0%麸皮与粉碎后的荞麦秸秆混合均匀密闭发酵30 d后使用)与全株玉米青贮以40 ∶ 60均匀混合后作为粗饲料。基础饲粮组成及营养水平见表 1。CK-3组(对照组)饲喂基础饲粮,Y1-3、Y2-3和Y3-3组在基础饲粮基础上分别添加1%、2%和3%的MOS(MOS由湖南某公司提供,纯度>99%,为保证全部被采食,将MOS均匀添加在精料中)。预试期15 d,正试期60 d。每天于07:30和17:30分别饲喂1次,先粗后精,自由饮水。
每组随机选择3只羊,在正试期第60天用瘤胃导管采集瘤胃液50 mL,保存于-80 ℃待测定相关指标。
从瘤胃液样本中提取基因组DNA后,用带有barcode的特异引物扩增ITS rDNA的ITS2区。引物序列为:ITS3_KYO2,5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′;ITS4,5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。切胶回收PCR扩增产物,使用QuantiFluorTM荧光计进行定量测定,制备文库后进行Illumina HiSeq2500模式PE250测序。测序得到raw reads之后,对低质量reads进行过滤,然后进行组装和过滤,以保证利用最有效数据聚类成操作分类单元(OTU)。
1.3 数据整理分析用Excel 2010对试验数据进行简单处理,并在SAS 8.2软件上进行分析,数据用“平均值±标准差“表示。
2 结果与分析 2.1 测序结果分析 2.1.1 OTU数分析由图 1可知,12个样本共产生1 144个OTU。CK-3组有274个OTU,Y1-3组有226个OTU,Y2-3组有303个OTU,Y3-3组有341个OTU。4组共享83个OTU。Y1-3组OTU数相对CK-3组有所减少,而Y2-3组、Y3-3组OTU数相对CK-3组有所增加,且以Y3-3组最多。上述结果说明饲粮中添加MOS会影响滩羊瘤胃真菌总数且在本试验条件下添加3%MOS相对其他添加水平最有益。
Shannon指数可反映所测样品中微生物的多样性。图 2为滩羊瘤胃真菌Shannon稀释曲线,当测序量达到40 000 reads时Shannon稀释曲线已基本保持稳定,说明测序深度已覆盖了样本中大部分真菌种类。图 3为滩羊瘤胃真菌覆盖度曲线,当测序量达到40 000 reads时,覆盖度已超过0.99,说明本试验中测序量及测序深度合理,当前的测序量足够进行真菌菌群多样性分析。
Chao1指数、Ace指数反映物种的丰度,Shannon指数、Simpson指数反映物种的多样性。由表 2可知,Y2-3组、Y3-3组Chao1指数、Ace指数显著大于Y1-3组、CK-3组(P<0.05);4组间Simpson指数、Shannon指数差异显著(P<0.05),3个试验组均高于CK-3组且以Y3-3组最高。总体而言,Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组的菌群丰度及多样性较CK-3组明显提高且Y3-3组影响最大。上述结果说明,本试验条件下,饲粮中添加MOS可明显提高滩羊瘤胃真菌菌群的数量,而3%对于增加瘤胃真菌菌群丰度及多样性为最优添加比例。
在研究微生物分类问题中,根据各样本丰度差异的统计结果,UPGMA分类树可对所测样本进行聚类分析。利用Mothur软件,样本中物种组成越相似的样本越靠近且有越短的共同分支。
由图 4可知,与CK-3组瘤胃真菌菌群组成相比,Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组瘤胃真菌菌群组成靠近,说明添加MOS可改变滩羊瘤胃真菌菌群物种组成,其中3%MOS对其影响最大。
PCoA通过降维方式将复杂样本简化分析主要样本距离,可直观地观察到个体或者群体之间的差异,样本间的距离可反映其物种组成差异的大小,距离越短,差异越小。图 5为基于Unweighted Unifrac距离的PCoA,图中PCo1为第1主成分,表示分离样品20.63%的方差;PCo2为第2主成分,表示分离样品12.70%的方差。与CK-3组相比,Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组间距离更近,其中Y1-3组、Y3-3组相比Y2-3组真菌菌群相似性更高,说明添加MOS可影响瘤胃真菌菌群组成。
将试验得到的有效序列在不同分类水平上进行物种注释及组间秩和检验统计分析。如图 6、表 3所示,在门水平上共注释得到12个菌门,相对丰度都在1%以上。子囊菌门(Ascomycota)、黄藻门(Anthophyta)、担子菌门(Basidiomycota)为4组共有的优势菌门,且上述菌门的相对丰度4组间无显著差异(P>0.05),但在数值上Y1-3组子囊菌门、黄藻门的相对丰度较其他组稍高,CK-3组担子菌门的相对丰度较其他组高。Y3-3绿藻门(Chlorophyta)的相对丰度较其他组高,但4组间无显著差异(P>0.05)。Y1-3组未分类菌门的相对丰度显著高于Y2-3组(P>0.05)。
结合图 7和表 4可知,在属水平上,有11种相对丰度较高的真菌菌属,Y1-3组曲霉属(Aspergillus)的相对丰度显著高于其他3组(P<0.05);Y3-3组未分类菌属的相对丰度显著高于Y1-3组、Y2-3组(P<0.05);其余菌属的相对丰度4组间均差异不显著(P>0.05)。在数值上,CK-3组虫草属(Cordyceps)、红菇属(Russula)、念珠菌属(Candida)、柯达酵母属(Kodamaea)的相对丰度较其他组稍高,Y1-3组Populus的相对丰度较其他组略高,Y2-3组软枣猕猴桃属(Actinidia)、青霉菌属(Penicillium)、Brassica的相对丰度较其他组稍高,Y3-3组圆孢霉属(Staphylotrichum)的相对丰度较其他组高。
采用FUNGuild预测饲粮中添加不同水平MOS的各组滩羊瘤胃真菌菌群的营养型,结果见图 8和表 5。图 8显示各组滩羊瘤胃真菌菌群可鉴定为病原-腐生-共生营养型(0~0.01%)、腐生-病原-共生营养型(0.04%~6.10%)、腐生-共生营养型(0.10%~2.25%)、病原营养型(1.02%~5.62%)、病原-腐生营养型(1.38%~4.94%)、腐生营养型(30.10%~47.69%)、病原-共生营养型(10.15%~23.19%)、共生营养型(1.44%~6.43%)及未分类营养型(30.65%~42.63%),腐生营养型为主要营养类型。由表 5可知,Y1-3组病原营养型、腐生-病原-共生营养型、共生营养型的丰度相对于其他组最少,其中腐生-病原-共生营养型的丰度显著低于Y2-3组(P<0.05),而腐生营养型较其他组最多;Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组共生营养型、病原-共生营养型的丰度相对于CK-3组有所减少;Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组腐生-共生营养型的丰度相对于CK-3组有所增加,其中Y2-3组与CK-3组的差异达到显著水平(P<0.05)。
本研究结果显示Y3-3组OTU数最多,总体测序量及测序深度合理。对于Alpha多样性分析,Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组的真菌菌群丰度及多样性较CK-3组明显提高且Y3-3组影响最大,说明本试验条件下添加MOS可提高滩羊瘤胃真菌菌群的多样性,其中3%MOS对于增加瘤胃真菌菌群丰度及多样性效果最优。由Beta多样性分析可知,与CK-3组瘤胃真菌菌群组成相比,Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组瘤胃真菌菌群组成相近,说明添加MOS可改变滩羊瘤胃真菌菌群物种组成,其中3%MOS对其影响最大。通过PCoA,与CK-3组相比,Y1-3组、Y2-3组、Y3-3组间距离更近,其中Y1-3组、Y3-3组瘤胃真菌菌群相似性相比Y2-3组更高,说明添加MOS可影响瘤胃真菌菌群组成。整个试验期内,瘤胃液真菌数量在各试验组间均一直处于较高水平。总而言之,本试验条件下,饲粮中添加MOS可增加滩羊瘤胃真菌菌群多样性且3%为增加真菌菌群多样性最优添加水平。
3.2 MOS对滩羊瘤胃真菌菌群结构的影响瘤胃真菌对于饲粮中纤维的降解主要是利用厌氧真菌优先附着于植物表面,通过真菌假根对植物细胞壁的降解作用进入植物维管组织内对其进行降解,使植物内部的成分暴露,更加利于其他微生物与植物底物的接触,从而利于植物纤维的降解[6-7]。瘤胃中的真菌可产生纤维素酶,其可降解植物中的果胶和结构碳水化合物等物质,同时具备降解蛋白质和淀粉的能力。本试验结果显示,在门水平上,子囊菌门、黄藻门、担子菌门为4组共有的优势菌门,但它们的相对丰度在4组间差异不显著,Y1-3组、Y3-3组子囊菌门的相对丰度较CK-3组分别增加10.03%、8.26%。有研究者表示超过98%的已知真菌都属于子囊菌门和担子菌门[8]。韩旭峰[9]在陕西绒山羊的研究中发现不同精粗比饲粮组瘤胃真菌中优势菌门均为子囊菌门。子囊菌门是真菌中最大的一类菌群[10],以腐生菌为主,可降解难以降解的纤维素和木质素[11]。这侧面说明本试验添加1%或3%MOS有利于饲粮中纤维的降解。而有研究表示子囊菌门的增加与植物收获前牧草的植物病原体[12]、贮藏过程中可能发生的子囊菌门霉菌(特别是曲霉菌和镰刀菌)污染有关[13],具体原因还需进一步探究。韦玥瑞[14]选择苜蓿青干草、苜蓿青干草加精料、玉米秸秆、玉米秸秆加精料为试验饲粮分析内蒙古绒山羊瘤胃微生物多样性,发现玉米秸秆及其补饲组的次级优势菌门是担子菌门。本试验结果表明,在属水平上,Y1-3组曲霉属的相对丰度显著高于其他3组。有研究发现给山羊饲喂不同饲粮后瘤胃真菌中优势菌属均为曲霉属[14],其对致病菌有一定的抑制作用[15]。CK-3组虫草属、红菇属、念珠菌属、柯达酵母属的相对丰度较其他组稍高。虫草属隶属于子囊菌门,有些可作为重要的食药用真菌[16-17],有些富含虫草素、虫草酸、虫草多糖、麦角甾醇、N6-(2-羟乙基)腺苷和喷司他汀等多种活性成分,具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降血脂及清除自由基等多种药理学功效[18]。王晟楠[19]研究了5种鹿科动物胃内微生物组成差异,发现念珠菌属在梅花鹿胃内的占比最高,为6.09%。Y2-3组软枣猕猴桃属、青霉菌属、Brassica的相对丰度较其他组稍高。青霉属和曲霉菌属参与土壤难溶性磷的溶解,可有效提高植物对磷的获取,是溶磷微生物的重要类群[20]。Y3-3组未分类菌属的相对丰度显著高于Y1-3组和Y2-3组,说明有关真菌菌群具体组成还需要进一步探究。
3.3 饲喂添加不同水平MOS饲粮的滩羊瘤胃真菌菌群功能预测反刍动物的消化过程依靠细菌、古菌、真菌共同作用,真菌在瘤胃内以腐生、共生、寄生等形式将有机物分解成二氧化碳释放。作为腐生生物,真菌产生的多种酶可将氮元素从有机物中分解释放。在反刍动物消化过程中,木质素影响反刍动物采食的适口性,并限制了瘤胃内微生物对纤维素的降解和摄取[21],真菌比细菌具有更强的木质素降解能力[22],反刍动物胃内真菌菌群可降低木质素带来的负面影响。本试验中,饲喂添加不同水平MOS饲粮的滩羊真菌营养型的丰度不同。Y1-3组病原营养型、腐生-病原-共生营养型、共生营养型的丰度相对其他组最少,而腐生营养型的丰度较其他组多,这可能与子囊菌门多为腐生菌有关,从而更利于纤维的降解。病原营养型真菌主要从宿主获取营养来源,易造成植物病害,而共生营养型真菌则对植株生长和品质等产生有益作用[23],说明Y1-3组滩羊的瘤胃真菌菌群功能可能更有利于植物的降解与瘤胃健康的维系。
4 结论本试验条件下,荞麦秸秆饲粮中添加3%MOS相较其他组更有利于增加滩羊瘤胃真菌菌群的多样性;对滩羊瘤胃真菌菌群进行的功能预测显示,添加1%MOS时滩羊瘤胃真菌菌群可能更有利于植物纤维的降解与瘤胃健康的维系。
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