2. 内蒙古自治区农牧业科学院动物营养与饲料研究所, 呼和浩特 010031;
3. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 中国科学院亚热带 农业生态过程重点实验室, 长沙 410125
2. Institute of Animal Nutrition and Feed Science, Inner Mongolia Academy of Agricultural & Animal Husbandry Sciences, Hohhot 010031, China;
3. Key Laboratory of Agro-Ecological Processes in Subtropical Region, Chinese Academy of Sciences, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
近年来，由于国外产品的冲击和国内生产管理技术的提高，在国家相关政策的推动下，越来越多的人选择调整种植结构，优先种植一些除粮食外的经济作物和牧草。紫花苜蓿作为一种重要的植物蛋白质受到重视，因紫花苜蓿是家畜都喜食的优质牧草，不管是青贮、放牧或制成青干草，都符合家畜的适口性，营养价值高，故有“牧草之王”的美名。但我国北方牧场面积退化等产生的一系列问题，缺乏优质苜蓿的种植，且饲喂种类单一。而我国的农作物秸秆主要有小麦秸秆、玉米秸秆和稻草秸秆等，产量巨大，秸秆所含的粗纤维可刺激反刍动物唾液分泌，进行正常反刍及咀嚼，维持瘤胃正常pH和功能。因此将小麦秸秆与苜蓿草进行组合饲喂，既解决了优质苜蓿草的缺乏，也为呼伦贝尔地区低质粗饲料的开发利用奠定了基础。
粗饲料的不同组合效应可以起相互促进的作用，发挥优质和低质粗饲料的正组合效应[1]，抑制粗饲料负组合效应，有利于在控制生产成本的基础上提高家畜的生产性能，低成本的劣质饲料与部分的优质粗饲料的组合一直以来都是研究的热点。Hadjigeorgiou等[2]研究发现，饲喂羔羊苜蓿干草比饲喂大麦秸秆的生长速度快。Obeidat等[3]通过饲喂小麦秸秆和苜蓿组合饲粮，发现可提高母羊和羔羊的生产性能。Kong等[4]研究结果发现，苜蓿干草和小黑麦秸秆这2种粗饲料组合饲喂可以丰富奶牛瘤胃产甲烷群落的生物多样性。Haddad等[5]通过研究大麦秸秆与苜蓿干草组合饲喂对绵羊瘤胃环境、营养物质采食量和消化率的联合效应时，发现在饲粮中添加150 g的苜蓿干草，可提高大麦秸秆的采食量。吕明等[6]研究在秸秆与精料组合饲粮基础上对羔羊补饲苜蓿干草后发现，添加苜蓿干草组羔羊的干物质平均日采食量显著高于对照组。谢小来等[7]在研究粗饲料的不同组合效果时发现，饲喂苜蓿干草与玉米秸秆组合的断奶羔羊平均日增重显著高于单独饲喂玉米秸秆的断奶羔羊。Ben-Ghedalia等[8]研究发现，新鲜苜蓿与小麦秸秆组合青贮时，可提高绵羊的采食量。由前人研究可知，秸秆与苜蓿的组合饲喂可提高反刍动物的生长性能，但关于小麦秸秆与苜蓿组合影响反刍动物的瘤胃乳头发育、肝脏糖、脂代谢基因情况详细研究鲜见报道。因此，本研究立足于我国北方呼伦贝尔地区小麦秸秆资源现状，以呼伦贝尔羔羊为试验动物。通过比较分析50%和100%苜蓿与小麦秸秆组合对呼伦贝尔羔羊的生长性能、血清生化指标、肝脏糖、脂代谢相关基因表达与瘤胃黏膜形态的影响，探究小麦秸秆与苜蓿1∶1组合的饲喂效果，为呼伦贝尔地区羔羊生产提供科学依据，供生产者参考。
1 材料与方法 1.1 试验设计选取72只健康、体重相近、3月龄左右的呼伦贝尔断奶羔羊，随机将其分为3组，每组3个重复，每个重复8只羔羊。分别为小麦秸秆组(WS组)、50%小麦秸秆+50%苜蓿干草组(AHWS组)、苜蓿干草组(AH组)。
1.2 饲粮与饲养管理预试期开始后对试验羊的采食量进行记录，正试期开始以预试期采食量为基础，饲粮按照精粗比7∶3制成全混合日粮(TMR)，于每日06:00、11:00、17:00进行饲喂，自由饮水，定期清扫羊舍、消毒，保持卫生。预试期6 d, 正试期90 d。试验饲粮营养水平需求均满足《肉羊饲养标准》(2004)[9]。饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) |
饲养结束时采集饲粮装入密封袋中4 ℃保存，用于饲粮营养成分的测定。
瘤胃样品采集：饲养结束后于晨饲前屠宰，从瘤胃腹囊中间剪取2 cm×2 cm的瘤胃组织，保存在浓度为10%的福尔马林溶液的瓶中，用于后续瘤胃黏膜形态检测。
血液样品采集：采用颈静脉收集的方式采集血液样本，所有采集的血液放入含有抗凝血剂的采血管中。采集的血样静置30 min后，然后在4 000 r/min下离心15 min吸取上部血清放入1.5 mL离心管中，再将样品放入-20 ℃冰箱保存，用于后续血清生化指标的分析。
饲养试验结束后，每组随机选取7只进行屠宰试验。取下试验动物肝脏的一部分，将试验动物的肝脏用生理盐水进行冲洗，将其放入采样袋中，然后迅速投入液氮中进行冷冻保存，最后将其余样品放入-80 ℃冰箱保存，用于后期肝脏糖、脂代谢相关基因表达的分析。
1.4 指标检测与方法 1.4.1 生长性能的测定每天饲喂前准确记录投放饲粮重量和收集的剩料量。试验正式开始前对羊只空腹进行称重，记录为初始体重，之后每隔15 d记录阶段重量，试验结束后再对羊只空腹称重，记录为结束体重。最后根据以上数据计算每只羊的平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.4.2 血清生化指标的测定血清样品检测指标：葡萄糖(GLU)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)含量及谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDHI)、碱性磷酸酶(ALP)、淀粉酶(AMS)活性。将收集好的血清样品解冻后，吸取500 μL于上样瓶中，使用CobasC311全自动生化分析仪进行血清生化指标的测定。
1.4.3 肝脏糖、脂代谢相关基因检测指标的测定试验测定肝脏脂肪酸合成酶(FASN)、脂肪醛脱氢酶(ALDH3A2)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6PC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1(PCK1)、丙酮酸羧化酶(PC)基因相对表达量。具体步骤参照艾科瑞生物反转录试剂盒说明书进行操作，所有引物由北京擎科生物科技有限公司合成提供。使用Primer primer 5软件，根据NCBI提供的绵羊参考序列设计引物，参与基因的引物序列如表 2所示。荧光定量PCR使用SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ在荧光定量PCR仪上测定，20 μL反应体系包括: 10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ (2×)、10 μmol/L上游和下游引物各0.8 μL、1.0 μL cDNA和7.4 μL dH2O。以磷酸苷油酸脱氢酶(GADPH)为内参基因。
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表 2 荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences used for fluorescent quantitation PCR |
瘤胃黏膜形态根据祁敏丽[11]观察切片的方法观察瘤胃乳头发育情况，瘤胃黏膜切片由长沙志凡生物科技有限公司制作。
1.5 数据统计分析试验数据用Excel 2019进行初步整理计算，采用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较，结果用平均值和均值标准误表示。最终采用GraphPad Prism软件制作图表。P＜0.05作为差异显著判断的标准。
2 结果与分析 2.1 苜蓿与小麦秸秆组合对呼伦贝尔断奶羔羊生长性能的影响由表 3可知，在饲粮精粗比7∶3情况下，WS组、AHWS组和AH组间初始体重、结束体重及平均日采食量均差异不显著(P＞0.05)。就试验增重及平均日增重来看，AHWS组显著高于AH组(P＜0.05)，平均日采食量WS组与AHWS组和AH组均差异不显著(P＞0.05)。料重比AH组显著高于WS组和AHWS组(P＜0.05)，AHWS组与WS组间无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 苜蓿与小麦秸秆组合对断奶羔羊生长性能的影响 Table 3 Effects of combination of alfalfa and wheat straw on growth performance of weaned lambs |
由表 4可知，血清TP、ALB、UN、GLU、CHO、AMS、LDL、HDL含量及ALT、AST、ALP、LDH活性3组间均差异不显著(P＞0.05)，WS组的血清TG含量显著高于AH组(P＜0.05)，与AHWS组差异不显著(P＞0.05)。
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表 4 苜蓿与小麦秸秆组合对断奶羔羊血清生化指标的影响 Table 4 Effects of combination of alfalfa and wheat straw on serum biochemical indexes of weaned lambs |
由图 1和图 2可知，肝脏糖代谢中G6PC、PC、PCK1基因相对表达量3组间差异不显著(P＞0.05)，脂代谢中ALDH3A2基因相对表达量3组间差异不显著(P＞0.05)，FASN基因相对表达量AH组显著高于WS组和AHWS组(P＜0.05)。
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PC: 丙酮酸羧化酶pyruvic carboxylase; G6PC: 葡萄糖-6-磷酸酶glucose-6-phosphatase; PCK1: 磷酸烯酮酸羧激酶1 phosphoenketonate carboxykinase 1。 数据柱标注无字母或相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。下图同。 Data bars with no letter or the same small letters mean no significant difference (P > 0.05), while with different samll letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 1 苜蓿与小麦秸秆组合对断奶羔羊肝脏中糖代谢相关基因表达的影响 Fig. 1 Effects of combination of alfalfa and wheat straw on expression of genes related to liver glucose metabolism of weaned lambs |
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FASN：脂肪酸合成酶fatty acid synthase；ALDH3A2：脂肪醛脱氢酶fatty aldehyde dehydrogenase。 图 2 苜蓿与小麦秸秆组合对断奶羔羊肝脏中脂代谢相关基因表达的影响 Fig. 2 Effects of combination of alfalfa and wheat straw on expression of genes related to liver lipid metabolism of weaned lambs |
由表 5可知，AHWS组的瘤胃乳头长度显著高于WS组(P＜0.05)，与AH组差异不显著(P＞0.05)。瘤胃乳头宽度及肌层厚度3组间均差异不显著(P＞0.05)，但AHWS组肌层厚度数值最高。瘤胃组织形态如图 3所示。
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表 5 苜蓿与小麦秸秆组合对断奶羔羊瘤胃组织形态的影响 Table 5 Effects of combination of alfalfa and wheat straw on rumen mucosal morphology of weaned lambs |
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图 3 苜蓿与小麦秸秆组合对断奶羔羊瘤胃黏膜形态的影响 Fig. 3 Effects of combination of alfalfa and wheat straw on rumen mucosal morphology of weaned lambs |
关于苜蓿与秸秆的组合效应，前人也进行了一系列的研究在牛羊生长和代谢方面。吕小康[12]研究在20~60日龄的山羊羔羊饲粮精料中添加苜蓿颗粒可提高羔羊瘤胃液中乙酸、丙酸和丁酸的含量，乙酸、丙酸和丁酸促进了羔羊瘤胃腹囊上皮生酮基因的表达，从而提高了瘤胃生酮能力。王富伟等[13]通过研究优质苜蓿替代部分羊草与玉米青贮组合饲喂，结果发现可提高奶牛的生产性能。樊文娜等[14]探究在基础饲粮上分别添加10%、20%、30%、40%的苜蓿草粉等量替代花生秧，结果发现在波尔山羊饲粮中添加40%的苜蓿草粉与花生秧组合饲喂，可显著提高波尔×山羊的平均日增重，降低料重比，且生长效果较好。姜碧薇等[15-16]研究用酶菌混合处理稻秸和苜蓿干草组合饲喂滩羊，结果提高滩羊的平均日增重，降低料重比，提高生长性能。庄涛等[17]研究发现，玉米青贮和苜蓿2∶2组合时，可显著提高波尔徐淮山羊的平均日增重。靳光等[18]的试验通过研究不同粗饲料与玉米青贮的组合效应时，提高了晋南牛的生长性能。张丹丹等[19]的研究发现全株玉米、小麦秸秆和苜蓿青贮以7∶2∶1的比例组合有利于瘤胃的发酵，同时也可提高饲料秸秆的利用率。Theurer等[20]研究发现，与只在饲粮中添加苜蓿干草相比，苜蓿干草与小麦秸秆组合饲喂，可以有效地提高饲料消化率。本试验的研究结果是AHWS组平均日增重显著高于AH组和WS组，AHWS组料重比显著低于AH组。可能是秸秆类低质粗饲料与优质苜蓿草具有优势互补作用，两者组合配制饲粮时组合效应显著，这与刘丽英[21]的研究结果一致。在探究2种粗饲料的组合效应时，低质饲料小麦秸秆中可溶性碳水化合物含量较低，反刍动物瘤胃对其消化利用率也较低[22]，而优质的苜蓿草可为基础饲粮补充理想的氮源，提高小麦秸秆在瘤胃中的消化率，协同维持能氮平衡。结果表明，与其他2组单一饲粮相比，苜蓿与小麦秸秆1∶1组合，可显著提高羔羊的平均日增重。其原因可能是不同粗饲料以适宜的比例组合后，营养成分之间互补，促进了微生物的生长及其营养成分的消化，改善了低质饲料小麦秸秆的消化率。这与韩肖敏[23]研究结果相一致。
3.2 苜蓿与小麦秸秆组合对呼伦贝尔断奶羔羊血清生化指标的影响动物血清生化成分是反映其机体生命活动的物质基础，其含量和变化规律体现了动物体重要的生物学特征。TP具有维持血液正常胶体渗透压和pH，其主要有ALB和GLB这2类物质，可反映动物体内的蛋白质合成情况。GLB又称免疫球蛋白，而血清中免疫球蛋白含量变化可评价动物机体免疫机能的重要标准[24]。姜婉茹等[25]试验结果表明通过饲喂2种饲草，相比麦秸组，血清TP、ALB含量高于苜蓿组，但血清GLB含量低于苜蓿组，说明饲喂粗饲料小麦秸秆能够促进瘤胃微生物蛋白质的合成，有利于促进反刍动物生长，并提高粗饲料的转化率。刘旭蕾等[26]发现25%及以上的紫花苜蓿替代玉米秸秆并与之组合饲喂，发现饲粮中的粗蛋白质水平会增高，用40%的紫花苜蓿替代玉米秸秆对断奶绒山羊的平均日增重明显提高。本试验结果显示，WS组的血清TP含量高于AHWS组和AH组，AHWS组血清ALB和GLB含量高于其他2组，差异不显著。但数值都在正常范围内，说明苜蓿草与小麦秸秆1∶1组合不会对呼伦贝尔羔羊的蛋白质代谢有显著影响，且可提高断奶羔羊的生长发育。
ALT是由丙氨酸及α-酮戊二酸组成的基质，大多存在于细胞质内，而肝细胞内的AST有相当部分存在于线粒体内，ALT和AST是体现动物机体蛋白质代谢的一个重要过程[27]，其上升幅度在一定程度上可反映肝细胞损害的轻重。ALP是一组在pH 9.0~10.5的碱性环境中催化有机磷酸酯水解的酶，血清中的ALP主要来源于肝脏、骨骼等，肾脏也有极少量。AMS是可以催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶，AMS活性的高低情况可反映肝功能的异常情况。陈希等[28]通过研究苜蓿干草和稻秸组合效应的饲喂效果，发现苜蓿干草组湖羊血清中的AST、ALP活性高于湖羊稻秸组。Minuti等[29]研究发现，产后奶牛血清中ALP活性随平均日增重的增加而升高。本试验中，AHWS组的血清ALT和ALP活性高于WS组、AH组，但差异不显著，AH组的血清AMS和AST活性高于其他2组，但都处于正常范围内，说明在高精粗比情况下，用苜蓿替代小麦秸秆没有引起肝功能的异常，且苜蓿与小麦秸秆1∶1组合时可提高呼伦贝尔断奶羔羊的平均日增重。GLU是人体能量的主要来源，可反映动物机体内的营养状况，GLU含量降低，说明动物饲粮中能量水平不足或机体消化不良[30]。UN是动物体蛋白质代谢的主要终末产物，可反映瘤胃氮利用状况。若UN含量升高时，可意味着体内蛋白质代谢增强，而氮沉积减少或肾功能不正常[31]。张颖等[32]研究发现，1年生黑麦草与苜蓿干草组合饲喂效果较好，可降低血液中UN的含量。血脂包括CHOL、TG、HDL、LDL。CHOL是组成细胞膜的重要成分，CHOL不足会导致TG代谢率降低，而TG含量越低，说明对脂肪的利用率越高。杨芳[33]试验发现在饲粮中添加不同浓度苜蓿皂甙可在一定程度上降低血清CHOL及LDL含量。本试验结果发现，血清TG含量随着苜蓿添加量的比例增加呈现下降的趋势，且AH组低于WS组，说明苜蓿可以提高脂肪利用率。通过脂肪利用率和脂肪代谢情况发现AHWS组的效果更明显，并且与上述的平均日增重表现结果一致。这结果说明苜蓿与小麦秸秆1∶1组合可以促进机体脂肪沉积，符合呼伦贝尔断奶羔羊的生长规律并且提高了断奶羔羊的育肥效果。
3.3 苜蓿与小麦秸秆组合对呼伦贝尔断奶羔羊肝脏糖、脂代谢相关基因表达的影响肝脏是反刍动物糖异生和脂质代谢的主要场所。在正常生理条件下，糖代谢和脂类代谢处于平衡状态，但是如果机体处于长期因饥饿严重缺糖或患严重糖尿病，糖不能被利用时，肝脏将动用脂肪产生大量的乙酰辅酶A(CoA)。糖原的降解方式采用磷酸解，产物为1-磷酸葡萄糖(G-1-P)。但糖原磷酸解并不妨碍肝糖原用于维持血糖水平，因为肝细胞含有G6PC，可以将6-磷酸葡萄糖(G-6-P)水解为GLU；PC催化丙酮酸生成草酰乙酸为PCK1提供原料，所以G6PC、PC及PCK1成为参与肝脏糖异生活动的关键酶，其表达量说明了糖异生代谢强弱。PCK1编码622个氨基酸残基，能与GTP催化草酰乙酸(OAA)生成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)并释放GDP和CO2[34]，这个过程是糖异生和甘油生成过程所共有的。对反刍动物来讲, 糖异生活动受到阻碍将导致机体陷入能量负平衡状态，使其身体抵抗力下降，降低动物的生产性能，引起相关健康疾病。因此，高燕等[35]研究发现，在饲粮中添加杜仲叶可提高糖酵解关键酶磷酸果糖激酶(PFKL)基因表达，抑制糖异生相关酶G6PC基因的表达，并降低血糖含量作用。Wang等[36]通过饲喂奶牛稻草，发现瘤胃丙酸浓度不足与肝脏糖异生降低有关，从而导致供乳腺利用的GLU不足。本试验结果表明，AHWS组相比其他2组肝脏PC及PCK1基因相对表达较高，但差异不显著，苜蓿与小麦秸秆1∶1组合没有对断奶羔羊机体糖异生活动产生显著影响。其原因可能是血糖含量随着苜蓿草的添加比例升高而升高，与苜蓿中的可溶性碳水化合物含量有关[37]，但发现这种升高并不是线性的，说明原因并不只有苜蓿一种，除了动物自身的神经-激素调节血糖含量处于相对稳定外，也可能与苜蓿与小麦秸秆的组合效应有关[37]。
FASN、ALDH3A2参与机体的脂肪合成过程。FASN基因编码的蛋白是一个不稳定且具有亲水性的蛋白[38]。绵羊FASN基因位于CHR11、84cM上[39]，FASN用于合成乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的通路中合成16个碳饱和脂肪酸棕榈酸酯[40]，它的活性直接决定肝脏合成脂肪酸的能力，对动物体脂肪的沉积性状起到重要的调节作用[41]。相关研究报道，FASN的活性可被胰岛素、糖皮质激素诱导[42-43]，但会被生长激素抑制[44]。田卫华等[45]通过在饲粮中添加8%的大豆油可显著提高鸡的乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)与FASN基因的表达。ALDH3A2是乙醛脱氢酶3家族成员的A2蛋白，它在脂质中间体代谢中起核心作用，可以将饱和和不饱和的脂肪醛氧化成相应的脂肪酸[46]，进而促进脂肪酸合成脂肪。张雄等[47]通过验证FASN基因调控猪脂质代谢，发现FASN基因可显著影响猪脂肪沉积和脂肪酸合成。在本试验中，ALDH3A2基因作为合成FASN的前体物，其相对表达量并未出现显著变化，但FASN基因在AH组中的相对表达量显著高于AHWS组和WS组，说明脂肪酸合成底物充足，并且根据上述血清中TG的含量说明羔羊脂代谢功能增强，导致肝脏FASN基因上调，因此在以饲粮精粗比7∶3结构条件下，苜蓿与小麦秸秆1∶1可以促进呼伦贝尔断奶羔羊脂肪的合成和积累。
3.4 苜蓿与小麦秸秆组合对呼伦贝尔断奶羔羊瘤胃黏膜形态的影响饲粮是影响羔羊瘤胃乳头形态的最主要因素，包括饲粮的组成、形态和营养水平等[48]。粗饲料降解产生的小分子物质主要通过瘤胃壁尿素循环进入血液，为动物机体提供所需的营养，瘤胃上皮为复层扁平细胞，上皮突起形成瘤胃乳头可增加挥发性脂肪酸、矿物质等的吸收面积[49]。Suárez等[50]通过在饲粮中添加粗饲料是可以促进瘤胃乳头的发育，但不同粗饲料对瘤胃上皮厚度无显著影响。孙若琳等[51]试验结果发现，饲喂麦秸可降低了湖羊瘤胃乳头的高度和面积。Hadjigeorgiou等[52]研究发现，颗粒饲料的长度的比例缩短会降低干物质和纤维的消化率。而Krause等[53]发现苜蓿和玉米秸秆青贮组合进行饲喂，可提高干物质的消化率。王娇等[54]通过研究甜高粱与苜蓿组合比例为40∶60时，结果发现可显著提高卡拉库尔羊消化道内的消化酶活性。李俊等[55]研究发现，在羔羊开食料中添加苜蓿干草的比例为10%时，可提高羔羊瘤胃壁的角质化程度，增加瘤胃壁肌层厚度，进而提高了羔羊后续消化粗纤维的能力。而本试验研究发现，AHWS组的瘤胃乳头长度显著高于WS组，与AH组差异不显著。瘤胃乳头宽度及肌层厚度均差异不显著，但AHWS组最厚, 其原因可能是小麦秸秆中的粗纤维含量高，在瘤胃内降解释放小分子营养物质的速度缓慢[32]，较小的乳头面积就可满足营养物质的吸收。而苜蓿由于粗纤维含量低，粗蛋白质含量高，在瘤胃中易于降解成小分子，需要较大的乳头面积吸收营养物质[56]。因此将这2种粗饲料进行1∶1组合可以起到正组合协同效应的结果, 提高羔羊瘤胃乳头长度。
4 结论在呼伦贝尔断奶羔羊精粗比7∶3的饲粮中，粗料为苜蓿和小麦秸秆1∶1时：
① 与粗料全部为小麦秸秆的饲粮相比，提高了羔羊的生长性能，并促进了羔羊肝脏糖、脂代谢及羔羊瘤胃乳头发育。
② 与粗料全部为苜蓿草的饲粮相比，显著提高了羔羊的平均日增重。
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