2. 国家粮食和物资储备局科学研究院 粮食品质营养研究所, 北京 100037
2. Food Quality and Nutrition Institute, Academy of National Food and Strategic Reserves Administration, Beijing 100037, China
棉籽粕作为一种蛋白质含量较高的植物性蛋白质饲料，具有在动物饲料中替代豆粕的潜力。然而，棉籽粕中有诸如游离棉酚等内源毒素的存在，如果将其用作饲料原料，会对养殖动物产生毒性作用，这限制了棉籽粕的利用[1]。我国2017年颁布的《饲料卫生标准》中明确指出，在棉籽加工产品中游离棉酚的含量应低于1 200 mg/kg，而在畜禽、反刍以及水产等养殖动物的配合饲料中游离棉酚的含量最低应不高于60 mg/kg。目前，微生物发酵被认为是脱除棉籽粕中游离棉酚并提高其营养价值的最佳方法[2-3]。Sun等[4]利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)发酵棉籽粕，脱毒率为61.91%，且粗蛋白质含量提高了12.23%。Zhang等[3]利用热带假丝酵母ZD-3于30 ℃发酵棉籽粕48 h后，其游离棉酚含量从549.06 mg/kg降至35.86 mg/kg，脱毒率高达93.47%，粗蛋白质含量提高了8.49%。罗远琴等[5]利用枯草芽孢杆菌和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)1:1复合发酵棉籽粕72 h后，发酵产物的总游离氨基酸、酸溶蛋白及棉籽肽的含量均显著提高。陈生琴等[6]筛选出一株高效降解游离棉酚的菌株，经鉴定为红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)，发酵后棉酚的降解率为72.54%。而徐晶等[7]研究发现，生料棉籽粕经固态发酵脱毒率为50.03%，且混菌发酵效果优于单菌，最佳组合为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)Bl2和产朊假丝酵母(Candida utilis)Cu1。魏炳栋等[8]和亓秀晔等[9]的研究显示，乳酸菌固态发酵对棉籽粕中游离棉酚和植酸的降解能力有限，但能很好地改善棉籽粕的风味，且能提高棉籽粕中有机酸等营养物质的含量。在此基础上，本研究以生料棉籽粕为发酵基质，选用枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和乳酸菌作为发酵菌株，通过检测棉籽粕发酵后的感官状态、发酵菌株活菌数、pH、游离棉酚的降解程度以及酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量的变化，进一步研究不同菌种及发酵条件对棉籽粕生料发酵的影响，以优化最适菌种组合、发酵方式和发酵工艺参数，提升发酵棉籽粕的脱毒效率和营养价值，为固态发酵棉籽粕的规模化生产和应用提供技术支撑。
1 材料与方法 1.1 试验材料棉籽粕购自山东；枯草芽孢杆菌BS15-3、酿酒酵母SC17-1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LP15-1、屎肠球菌(Enterococcus faecium)RS047均由本实验室保藏，并制为固体发酵菌剂，菌剂的活菌数分别为5.0×1010、5.0×1010、5.6×1010和1.7×1010 CFU/g。
LB培养基、MRS培养基和孟加拉红培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 试验方法 1.2.1 菌种活化分别称取枯草芽孢杆菌BS15-3、酿酒酵母SC17-1、植物乳杆菌LP15-1、屎肠球菌RS047菌粉0.2 g，加入到装有100 mL已灭菌的2%糖蜜溶液的250 mL三角瓶中，枯草芽孢杆菌BS15-3和酿酒酵母SC17-1分别于37和30 ℃，180 r/min振荡活化4 h；植物乳杆菌LP15-1和屎肠球菌RS047振荡混匀后，37 ℃静置活化4 h。
1.2.2 单菌固态发酵称取已粉碎并过10目筛的棉籽粕200 g于1 000 mL烧杯中，按照料水比1.0:0.5(质量体积比)加入100 mL活化菌液，充分混匀。
好氧发酵：4层纱布封口，物料蓬松且每12 h搅拌1次。厌氧发酵：4层纱布和1层保鲜膜封口，且将物料压实，静置培养，发酵期间不搅拌。
不同组别的发酵条件如表 1，对照组为加入不接种任何菌株的无菌水并在相应条件下放置的空白物料，每组3个重复。
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表 1 单菌固态发酵条件 Table 1 Single bacteria solid-state fermentation conditions |
物料混合方法、好氧/厌氧发酵方法及对照组处理方法同单菌固态发酵。混菌同步固态发酵不同组别的发酵条件见表 2，不同菌株按等比例接种，每组3个重复。
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表 2 混菌同步固态发酵条件 Table 2 Mixed-bacteria simultaneous solid-state fermentation conditions |
物料混合方法、好氧/厌氧发酵方法及对照组处理方法同单菌固态发酵。混菌分步固态发酵不同组别的发酵条件见表 3，不同菌株按等比例接种，每组3个重复。
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表 3 混菌分步固态发酵条件 Table 3 Mixed-bacteria stepwise solid-state fermentation conditions |
本试验利用SPSS 23.0进行4因素3水平的正交设计(升序排列)，以料水比(A)、发酵时间(B)、发酵温度(C)和接种比例(D，酿酒酵母SC17-1:植物乳杆菌LP15-1:枯草芽孢杆菌BS15-3)作为考察因素，探究其对混菌发酵棉籽粕效果的影响，测定发酵棉籽粕游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量及干物质回收率的变化，试验因素和水平见表 4，正交试验设计见表 5。
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表 4 混菌发酵正交试验因素和水平 Table 4 Factors and levels of orthogonal experiment in mixed-bacteria fermentation |
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表 5 混菌发酵正交试验设计 Table 5 Orthogonal experiment design of mixed-bacteria fermentation |
样品处理：将发酵结束后的样品在55 ℃下烘干24 h，粉碎后，测定游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸的含量。
感官评价：发酵结束后，随机取各组发酵样品参考罗远琴等[5]的方法对其进行感官评价。
活菌数测定：分别取每组的发酵前和发酵结束时的棉籽粕样品10 g于250 mL三角瓶中，加入90 mL无菌水和适量玻璃珠，37或30 ℃，180 r/min，振荡30 min。振荡结束后进行10倍梯度稀释，每种样品做3个平行。枯草芽孢杆菌BS15-3活菌数测定采用稀释涂布法于LB平板37 ℃培养24 h后计数；酿酒酵母SC17-1活菌数测定采用稀释涂布法于孟加拉红平板30 ℃培养48 h后计数；乳酸菌(植物乳杆菌LP15-1和屎肠球菌RS047)活菌数测定采用稀释倾注法于含0.5% CaCO3的MRS固体培养基37 ℃培养48 h后计产生溶钙圈的菌落数。
pH测定：取1 g发酵结束的棉籽粕样品于10 mL离心管中，加入9 mL无菌水，振荡后静置，使用pH计测上清液的pH。
干物质回收率测定：称量发酵前后样品的重量，利用干重法测定发酵前后样品的干物质百分含量。
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游离棉酚含量根据GB/T 13086—2020《饲料中游离棉酚的测定方法》测定。粗蛋白质含量根据GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白的测定凯氏定氮法》测定。酸溶蛋白含量根据NY/T 3801—2020《饲料原料中酸溶蛋白的测定》方法测定：称取2 g发酵样品于50 mL离心管中，加入20%三氯乙酸溶液40 mL，空气摇床150 r/min振荡30 min，静置5 min后，4 000 r/min离心5 min。取10 mL滤液加入消化管中，加入催化片，按照粗蛋白质含量测定方法进行测定。L-乳酸含量测定：称取3 g发酵样品于50 mL离心管中，加入27 mL去离子水，置于25 ℃空气浴摇床振荡2 h，静置5 min后，4 000 r/min离心20 min，取上清液使用SBA-40E型生物传感分析仪测定。
1.3 数据统计与处理数据采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”表示，以P < 0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 单菌发酵棉籽粕的感官评定、pH、活菌数、游离棉酚及营养成分变化由表 6可知，棉籽粕经枯草芽孢杆菌BS15-3发酵后黏度增加，结块严重，且在发酵过程中出现拉丝情况，颜色也由黄褐色变为深褐色，有浓郁的枯草腐败味，pH呈碱性(8.03)；酿酒酵母SC17-1好氧发酵的棉籽粕在发酵过程中有醇香味，但发酵至3 d(72 h)时味道变得不好闻且pH为7.02；酿酒酵母SC17-1厌氧发酵的棉籽粕则质地松散，气味醇香且颜色较浅，pH也略有下降(6.00)；植物乳杆菌LP15-1和屎肠球菌RS047发酵的棉籽粕表面泛白污染霉菌且气味难闻，pH呈碱性(7.87和8.06)。
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表 6 单菌发酵棉籽粕的感官评价及pH Table 6 Sensory evaluation and pH of single-bacteria fermented cottonseed meal |
由表 7可知，经过3 d的发酵，棉籽粕中枯草芽孢杆菌BS15-3活菌数从初始活菌数1.2×107 CFU/g升高至2.5×109 CFU/g，酿酒酵母SC17-1好氧发酵活菌数从8.3×106 CFU/g升高至5.9×107 CFU/g，酿酒酵母SC17-1厌氧发酵活菌数从8.6×106 CFU/g升高至1.7×107 CFU/g，植物乳杆菌LP15-1和屎肠球菌RS047的活菌数分别从1.1×107和8.2×106 CFU/g均降低至低于1.0×104 CFU/g。
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表 7 单菌发酵棉籽粕的活菌数 Table 7 Viable bacteria count in single-bacteria fermented cottonseed meal |
由于2株乳酸菌在棉籽粕中没有生长且棉籽粕发霉，因此没有检测乳酸菌发酵棉籽粕样品的游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量及干物质回收率。由表 8可知，与对照组相比，枯草芽孢杆菌BS15-3和酿酒酵母SC17-1发酵棉籽粕的游离棉酚含量均显著降低(P < 0.05)，其中酿酒酵母SC17-1厌氧发酵棉籽粕的游离棉酚降解率为59.98%，与酿酒酵母SC17-1好氧发酵游离棉酚降解率无显著差异(P>0.05)；枯草芽孢杆菌BS15-3发酵棉籽粕的游离棉酚降解率为36.67%，明显低于酿酒酵母SC17-1。枯草芽孢杆菌BS15-3发酵棉籽粕的酸溶蛋白含量与对照组相比升高了96.23%(P < 0.05)，高于酿酒酵母SC17-1发酵棉籽粕的酸溶蛋白含量，但差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，3个单菌发酵棉籽粕的粗蛋白质含量均显著升高(P < 0.05)，其中酿酒酵母SC17-1好氧发酵棉籽粕的粗蛋白质含量升高了8.58%，酿酒酵母SC17-1厌氧发酵升高了9.65%，枯草芽孢杆菌BS15-3发酵升高了3.85%。与对照组相比，3个单菌发酵棉籽粕的L-乳酸含量也均显著升高(P < 0.05)，其中酿酒酵母SC17-1厌氧发酵棉籽粕的L-乳酸含量最高达到0.36 g/L，是对照组的36倍；枯草芽孢杆菌BS15-3发酵棉籽粕的L-乳酸含量略有升高，为0.05 g/L，是对照组的5倍。与对照组相比，3个单菌发酵棉籽粕的干物质回收率均显著降低(P < 0.05)。
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表 8 单菌发酵棉籽粕的游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量(风干基础)及干物质回收率 Table 8 Contents of free gossypol, acid-soluble protein, crude protein and L-lactic acid (air-dry basis) and dry matter recovery of single-bacteria fermented cottonseed meal (n=3) |
由表 9可知，大多数接种枯草芽孢杆菌BS15-3的混菌发酵棉籽粕的黏度均较大，有结块，颜色较深且有枯草腐败味；混菌发酵样品中凡是接种酿酒酵母SC17-1的发酵棉籽粕质地都比较松散，其中SC17-1+LP15-1组、SC17-1+LP15-1+RS047组发酵棉籽粕的感官是最让人愉悦的，质地松散无结块，颜色较浅，气味酸香，但SC17-1+LP15-1组发酵棉籽粕的pH低于SC17-1+LP15-1+RS047组；LP15-1+RS047组发酵棉籽粕的感官评价最差，表面泛白且有苦味和长霉的气味。
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表 9 混菌同步发酵棉籽粕的感官评价及pH Table 9 Sensory evaluation and pH of mixed-bacteria simultaneously fermented cottonseed meal |
由表 10可知，经过发酵，枯草芽孢杆菌BS15-3的活菌数能升高至1.0×109 CFU/g以上，只有BS15-3+SC17-1+RS047组枯草芽孢杆菌BS15-3的活菌数为8.6×108 CFU/g，但也高于初始活菌数9.3×106 CFU/g；而酿酒酵母SC17-1活菌数虽也有升高，但不如枯草芽孢杆菌BS15-3升高的明显，其中只有BS15-3+SC17-1+LP15-1组的酿酒酵母SC17-1活菌数升高至3.7×108 CFU/g，而BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047组酿酒酵母SC17-1的活菌数最低，为1.1×106 CFU/g，其他组酿酒酵母SC17-1的活菌数均高于初始活菌数；发酵后乳酸菌活菌数能达到1.0×108~1.0×109 CFU/g的发酵组有BS15-3+RS047组、SC17-1+LP15-1组、BS15-3+SC17-1+LP15-1组、BS15-3+SC17-1+RS047组、BS15-3+LP15-1+RS047组和BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047组，SC17-1+RS047组、SC17-1+LP15-1+RS047组的乳酸菌活菌数为1.0×107~1.0×108 CFU/g，BS15-3+LP15-1组的乳酸菌活菌数为5.6×106 CFU/g(略低于接种量)，而LP15-1+RS047组发酵后乳酸菌的活菌数小于1.0×104 CFU/g。
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表 10 混菌同步发酵棉籽粕的活菌数 Table 10 Viable bacteria count in mixed-bacteria simultaneously fermented cottonseed meal |
由于2株乳酸菌混合后在棉籽粕中仍没有生长且棉籽粕发霉，因此没有检测乳酸菌混菌发酵棉籽粕样品的游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量及干物质回收率。由表 11可知，SC17-1+LP15-1组棉籽粕的游离棉酚降解率最高，游离棉酚含量下降至688.50 mg/kg，降解率达到57.96%；其次是BS15-3+SC17-1+LP15-1组，降解率为55.17%；其他混菌组合对游离棉酚均有降解但降解率不高，为20%~50%，其中BS15-3+SC17-1+RS047组游离棉酚降解率最低。除SC17-1+LP15-1组和SC17-1+LP15-1+RS047组之外，混菌发酵后酸溶蛋白含量显著高于对照组(P < 0.05)，且大多数高于单菌发酵，而且凡是接种了枯草芽孢杆菌BS15-3的发酵组酸溶蛋白含量都比较高，其中BS15-3+SC17-1组、BS15-3+LP15-1组、BS15-3+RS047组、BS15-3+SC17-1+RS047组酸溶蛋白含量与对照组相比都显著提高(P < 0.05)，分别提高了250.94%、223.40%、214.34%和273.96%；SC17-1+LP15-1和SC17-1+RS047这2种组合发酵棉籽粕的酸溶蛋白含量也有提升，但不如加入BS15-3的组。混菌发酵后粗蛋白质含量也有不同变化，其中BS15-3+SC17-1组、BS15-3+SC17-1+RS047组、BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047组发酵棉籽粕的粗蛋白质含量分别达到50.61%、51.53%和50.05%，显著高于对照组(P < 0.05)，而BS15-3+SC17-1+LP15-1组的粗蛋白质含量最低，且与对照组差异不显著(P>0.05)。与对照组相比，混菌发酵后棉籽粕的L-乳酸含量均显著升高(P < 0.05)，其中SC17-1+LP15-1组L-乳酸含量显著高于其他各组(P < 0.05)，达到0.69 g/L；BS15-3+SC17-1+LP15-1组L-乳酸含量提高得最少；BS15-3+SC17-1组、BS15-3+LP15-1组、BS15-3+RS047组、BS15-3+ SC17-1+RS047组也略高于对照组，但这4种组合之间差异不显著(P>0.05)；SC17-1+RS047组、SC17-1+LP15-1+RS047组、BS15-3+LP15-1+RS047组、BS15-3+SC17-1+LP15-1+RS047组L-乳酸含量也分别提高至0.18、0.16、0.13和0.12 g/L。棉籽粕经发酵后干物质有一定程度的损失，除BS15-3+SC17-1+LP15-1组外，其他发酵组均显著低于对照组(P < 0.05)，其中BS15-3+SC17-1+RS047组干物质回收率最低，BS15-3+RS047组最高。
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表 11 混菌同步发酵棉籽粕的游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量(风干基础)及干物质回收率 Table 11 Contents of free gossypol, acid-soluble protein, crude protein and L-lactic acid (air-dry basis) and dry matter recovery of mixed-bacteria simultaneously fermented cottonseed meal |
由表 12可知，先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组发酵棉籽粕黏度要比单菌和混菌同步发酵棉籽粕大的多，同时颜色变深，气味刺鼻，pH与棉籽粕相近，而先SC17-1+LP15-1、再BS15-3组棉籽粕质地松散，颜色较浅，气味香甜，pH降低至5.28。同时，由表 13可知，先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组发酵后枯草芽孢杆菌BS15-3的活菌数较高，而先SC17-1+LP15-1、再BS15-3组发酵后酿酒酵母SC17-1和乳酸菌活菌数较高。由表 14可知，先SC17-1+LP15-1、再BS15-3组发酵棉籽粕的游离棉酚含量显著低于对照组和先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组(P < 0.05)，降解率为65.10%，粗蛋白质含量显著高于对照组和先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组(P < 0.05)；先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组发酵棉籽粕的酸溶蛋白含量升高至19.25%，比对照组提高了626.42%(P < 0.05)，先SC17-1+LP15-1、再BS15-3组酸溶蛋白含量与对照组相比也有显著提高(P < 0.05)，但远不如先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组；发酵组L-乳酸含量均显著高于对照组(P < 0.05)，且先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组优于先SC17-1+LP15-1、再BS15-3组(P < 0.05)；先SC17-1+LP15-1、再BS15-3组发酵棉籽粕的干物质回收率显著低于先BS15-3、再SC17-1+LP15-1组和对照组(P < 0.05)。
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表 12 混菌分步发酵棉籽粕的感官评价及pH Table 12 Sensory evaluation and pH of mixed-bacteria stepwise fermented cottonseed meal |
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表 13 混菌分步发酵棉籽粕的活菌数 Table 13 Viable bacteria count in mixed-bacteria stepwise fermented cottonseed meal |
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表 14 混菌分步发酵棉籽粕的游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量(风干基础)及干物质回收率 Table 14 Contents of free gossypol, acid-soluble protein, crude protein and L-lactic acid (air-dry basis) and dry matter recovery of mixed-bacteria stepwise fermented cottonseed meal |
由表 15可知，不同正交组合发酵后棉籽粕的品质均有不同程度的提升，其中组合4的发酵效果要优于其他组合，其棉籽粕脱毒率(游离棉酚降解率)为62.32%，酸溶蛋白含量提高至4.17%，粗蛋白质含量升高至47.07%，L-乳酸含量提高至1.75 g/L，干物质回收率为95.27%。通过对正交组合的极差分析可知，对于游离棉酚而言，考察因素效应大小依次为料水比>接种比例>发酵温度>发酵时间，最优组合为A2D3C3B3；对于酸溶蛋白而言，考察因素效应大小依次为接种比例>发酵时间>发酵温度>料水比，最优组合为D3B3C2A3；对于粗蛋白质而言，考察因素效应大小依次为料水比>发酵时间>接种比例>发酵温度，最优组合为A3B3D2C3；对于L-乳酸而言，考察因素效应大小依次为料水比>发酵时间>发酵温度>接种比例，最优组合A2B3C2D3。
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表 15 正交试验不同组合发酵棉籽粕的游离棉酚、酸溶蛋白、粗蛋白质和L-乳酸含量(风干基础)及干物质回收率 Table 15 Contents of free gossypol, acid-soluble protein, crude protein and L-lactic acid (air-dry basis) and dry matter recovery of different combinations of fermented cottonseed meal by orthogonal experiment |
正交试验方差分析结果见表 16，料水比、发酵温度和接种比例对游离棉酚含量有极显著性影响(P < 0.01)，发酵时间对游离棉酚含量有显著影响(P < 0.05)；接种比例对酸溶蛋白含量有极显著性影响(P < 0.01)，发酵时间对酸溶蛋白含量有显著影响(P < 0.05)；料水比和发酵时间对粗蛋白质含量有极显著影响(P < 0.01)；料水比、发酵时间和发酵温度对L-乳酸含量有极显著影响(P < 0.01)，接种比例对L-乳酸含量有显著影响(P < 0.05)。
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表 16 正交试验方差分析结果 Table 16 Variance analysis results of orthogonal experiment |
综上所述，发酵影响因素效应大小依次为料水比>发酵时间>接种比例>发酵温度，得到发酵参数的最佳工艺组合为A2B3C2D3，即料水比为1.00:0.80，发酵时间为4 d，发酵温度为30 ℃，接种比例为1:1:10(酿酒酵母SC17-1:植物乳杆菌LP15-1:枯草芽孢杆菌BS15-3)。
2.5 正交试验验证结果通过正交试验得到的发酵棉籽粕最佳工艺为：料水比为1.00:0.80，发酵时间为4 d，发酵温度为30 ℃，接种比例为酿酒酵母SC17-1:植物乳杆菌LP15-1:枯草芽孢杆菌BS15-3=1:1:10，即1.0×106 CFU/g:1.0×106 CFU/g:1.0×107 CFU/g，在该条件下发酵，棉籽粕的游离棉酚含量从1 637.61 mg/kg降至552.21 mg/kg，降解率为66.28%，粗蛋白质含量从44.66%升高至47.51%，酸溶蛋白含量从2.65%升高至4.99%，L-乳酸含量从0.01 g/L升高至1.83 g/L，干物质回收率为94.05%，符合试验预期。
3 讨论 3.1 单菌发酵棉籽粕效果比较本试验中，不同菌种对棉籽粕发酵的效果不同，枯草芽孢杆菌BS15-3发酵棉籽粕72 h后，发酵产物黏度增加且有拉丝现象，可能是因为枯草芽孢杆菌BS15-3有较强的产蛋白酶能力，能将大分子蛋白质分解成小肽，因此增加了发酵产物的黏度[7]；而发酵棉籽粕的枯草腐败味且呈弱碱性可能与枯草芽孢杆菌BS15-3发酵过程产生的胺等碱性物质有关，然而巨向红等[10]的研究结果显示，经枯草芽孢杆菌LBD-1发酵的饲料pH随发酵时间的推移而下降，这可能与所用枯草杆菌菌株和发酵底物性质有关，该研究使用的发酵底物不是单一饲料原料而是成品饲料，而且发酵周期达到15 d，导致代谢产生酸性物质；李佳等[11]的研究结果表明，经枯草芽孢杆菌M-9发酵后的棉籽粕呈黄褐色、质地松散、无结块，略带棉籽油味道，无酸败味、腐味、焦味、霉味或其他异味，这可能是由于该株枯草芽孢杆菌发酵棉籽粕过程中没有产生胺类物质。
本试验中，用酿酒酵母SC17-1厌氧发酵的棉籽粕气味醇香，物料松散，这是因为酿酒酵母厌氧发酵代谢产生了醇类和有机酸等风味物质，这种变化提高了发酵棉籽粕的适口性，同时还降低了棉籽粕的pH，这与罗远琴等[5]的结果一致；而酿酒酵母SC17-1好氧发酵棉籽粕的感官和气味稍差，主要原因是酿酒酵母在好氧条件下的代谢途径与厌氧条件不同，产生醇类物质和有机酸等代谢产物较少。
综合感官、活菌数及营养成分变化来看，枯草芽孢杆菌BS15-3和酿酒酵母SC17-1都能利用棉籽粕生长，成长为优势菌群，说明本研究使用的2株菌都可使棉籽粕中游离棉酚含量降低，酸溶蛋白和粗蛋白质含量升高，这与魏莲清等[12]报道的结果趋势一致，但本试验所用枯草芽孢杆菌发酵后棉籽粕的脱毒率为36.67%，这与王晓玲等[13]用枯草芽孢杆菌ST-141生料发酵棉籽粕脱毒率为37%的结果一致，但远低于魏莲清等[12]报道的85.43%。酿酒酵母SC17-1发酵后棉籽粕的脱毒率为59.98%，与舒文秀[14]所报道的酿酒酵母脱毒率为63.53%的结果相近，但低于张文举等[15]报道的热带假丝酵母ZD-3达到的86.18%，这可能是菌种差异所致。许多文献中报道棉籽粕经微生物发酵后脱毒率能达到80%~90%[16]，多数是因为棉籽粕在发酵前经过了高压灭菌[17]或者在发酵过程中添加了发酵辅料[15]的影响，而本试验采用固态生料发酵且不添加任何发酵辅料，可以省去对棉籽粕的高温高压灭菌处理，这样可大大节约生产成本，还可避免棉籽粕因高温高压处理而导致的营养物质的损失[18-19]。枯草芽孢杆菌BS15-3发酵棉籽粕后的酸溶蛋白含量显著升高说明了感官评价中物料黏度增加是因为小肽含量增加的原因，表明枯草芽孢杆菌BS15-3有较强的蛋白质分解能力。根据发酵前后干物质回收率和粗蛋白质含量提高的程度，可以认为发酵棉籽粕粗蛋白质含量增加是由于微生物发酵后干物质损失造成的浓缩效应，这与金红春等[20]和李巧云等[21]的报道一致。酿酒酵母SC17-1厌氧发酵后棉籽粕的L-乳酸含量显著增加说明了感官评价中物料气味醇香是因为产有机酸的原因。使用乳酸菌植物乳杆菌LP15-1或屎肠球菌RS047单菌发酵，从感官评价、pH及活菌数的变化来看，植物乳杆菌LP15-1和屎肠球菌RS047不能在棉籽粕中生长，无法用于棉籽粕的单菌发酵。
由此可见，综合发酵前后感官评价、活菌数和pH变化以及及游离棉酚和营养成分的变化结果，单菌发酵中酿酒酵母SC17-1厌氧发酵棉籽粕后游离棉酚降解率最高，感官评价最好，但是酸溶蛋白和L-乳酸含量较低。
3.2 混菌同步发酵棉籽粕效果比较从感官评价来看，加入酿酒酵母SC17-1后可以改善枯草芽孢杆菌BS15-3发酵导致的物料结块、黏度大的问题，但pH、气味没有明显变化，而酿酒酵母SC17-1与植物乳杆菌LP15-1和屎肠球菌RS047配伍发酵后的棉籽粕都有醇香味或酸香味，这种味道能促进动物的食欲；物料柔软松散，在一定程度上还可提高棉籽粕的适口性；同时棉籽粕的pH降低，可提供酸性环境，使发酵过程不易受杂菌污染。从活菌数来看，混菌组合中乳酸菌与枯草芽孢杆菌BS15-3或酿酒酵母SC17-1协同发酵后活菌数都升高，可能是枯草芽孢杆菌或酿酒酵母在发酵过程中产生了某些可以让乳酸菌利用和生长的物质，或者发酵过程中消耗了过量的氧气，促进了乳酸菌生长。同时，枯草芽孢杆菌BS15-3和酿酒酵母SC17-1分别与植物乳杆菌LP15-1、屎肠球菌RS047及4种菌混合的组合中，枯草芽孢杆菌BS15-3在发酵过程中成长为优势菌群，酿酒酵母SC17-1和乳酸菌虽也有增殖但不能改善枯草芽孢杆菌BS15-3发酵产生的气味和pH，这与感官评价的结果一致。从游离棉酚的降解和营养成分的变化看，混菌发酵对游离棉酚的降解率不如酿酒酵母SC17-1单菌发酵，其中SC17-1+LP15-1组和BS15-3+SC17-1+LP15-1组的游离棉酚降解率结果与其相似，而多数加入屎肠球菌RS047的试验组游离棉酚的降解率明显低于酿酒酵母SC17-1单菌发酵，这说明屎肠球菌RS047与其他菌株可能在降解游离棉酚上存在拮抗作用，因此在后续试验中不考虑屎肠球菌RS047作为发酵菌种。此外，接入枯草芽孢杆菌BS15-3的试验组的酸溶蛋白含量都明显提高，这说明在提高酸溶蛋白方面枯草芽孢杆菌起主要作用，且这几种菌之间无明显的拮抗作用，这与罗远琴等[5]的结果一致。混菌发酵试验组中只有BS15-3+SC17-1+LP15-1组的粗蛋白质含量与对照组没有显著差异，其余组合粗蛋白质含量均显著升高，这说明BS15-3+SC17-1+LP15-1组的微生物对棉籽粕干物质的影响不大。SC17-1+LP15-1组混合发酵后L-乳酸含量显著高于其他组合和单菌发酵，酿酒酵母SC17-1可以促进植物乳杆菌LP15-1的生长，这与SC17-1+LP15-1组的pH结果也是一致的，说明加入植物乳杆菌LP15-1能提高发酵棉籽粕中L-乳酸的含量，提高饲料的营养价值，这与魏炳栋等[8]的结果一致。使用乳酸菌植物乳杆菌LP15-1和屎肠球菌RS047混菌发酵，从感官评价、pH及活菌数的变化来看，2种菌株不能在棉籽粕中生长，无法用于棉籽粕的混菌发酵。
由此可见，综合发酵前后感官评价、活菌数和pH变化以及及游离棉酚和营养成分的变化结果，混菌发酵试验组中，酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1混合厌氧发酵棉籽粕后游离棉酚的降解率最高，与酿酒酵母SC17-1单菌发酵没有明显差异，但是L-乳酸含量显著升高，与其他混菌发酵组合相比效果最好。
3.3 混菌分步发酵棉籽粕效果比较与单菌发酵相比，酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1混合厌氧发酵棉籽粕的L-乳酸含量明显增加，但是酸溶蛋白含量仍较低，而单菌和混菌发酵结果表明，凡是接种枯草芽孢杆菌BS15-3的组合，酸溶蛋白含量均较高，因此，为了提升发酵棉籽粕的酸溶蛋白含量，仍需接种枯草芽孢杆菌BS15-3，但是根据混菌发酵试验结果，直接将其与酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1混合接种，进行好氧发酵，虽然酸溶蛋白含量增加，但是L-乳酸含量极低，然而如果进行厌氧发酵，枯草芽孢杆菌无法生长，无法增加酸溶蛋白含量。于是，考虑采用混菌分步发酵法，先接种枯草芽孢杆菌BS15-3进行好氧发酵，然后接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1进行厌氧发酵；或者先接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1进行厌氧发酵，然后接种枯草芽孢杆菌BS15-3进行好氧发酵，结果表明，先接种枯草芽孢杆菌BS15-3进行好氧发酵，然后接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1进行厌氧发酵的样品，虽然酸溶蛋白和L-乳酸含量较高，但是游离棉酚含量几乎没有变化，而亓秀晔等[9]的研究表明，枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的最优复配发酵方式为先好氧发酵24 h再继续厌氧发酵48 h，在该条件下发酵的棉籽粕pH降至5.27，酸溶蛋白含量达到23.54%，游离棉酚降解率达到61.58%。而先接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1进行厌氧发酵，再接种枯草芽孢杆菌BS15-3进行好氧发酵的效果最好，游离棉酚降解率显著提升，达到65.10%，且酸溶蛋白含量较单菌酿酒酵母SC17-1厌氧发酵和混菌酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1发酵有显著提升，粗蛋白质含量有提升但不显著，L-乳酸含量高于单菌酿酒酵母SC17-1厌氧发酵，但显著低于混菌酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1发酵。
由此可见，采用混菌分步发酵法先接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1进行厌氧发酵，再接种枯草芽孢杆菌BS15-3进行好氧发酵效果较好，虽然L-乳酸含量低于混菌酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1发酵，但是综合评价结果优于单菌发酵和混菌同步发酵。
3.4 发酵工艺优化不同发酵条件对棉籽粕的发酵也有影响，有研究报道，益生菌固态发酵棉籽粕的最佳发酵时间在48~72 h，最佳发酵温度在30~40 ℃，普遍在30 ℃左右，初始含水量在50%左右[22]。Zhang等[23]通过单因素试验获得枯草芽孢杆菌对棉籽粕的最佳发酵条件为：发酵时间72 h，发酵温度39 ℃，初始pH 6.5，初始含水量50%，接种量1.0×107 CFU/g。在该条件下进行发酵将棉籽粕中游离棉酚的含量降至61.25 mg/kg。张晓羊等[24]利用响应面法对嗜酸乳杆菌发酵棉籽粕的条件进行优化，得到理论最佳发酵条件是接种量为5.96 mL，发酵温度为36.99 ℃，发酵时间为48.26 h，在该条件下发酵产物有机酸可达7.50%。本研究的结果显示，在料水比为1.00:0.80(初始含水量为50%)，先接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1厌氧发酵2 d，再接种枯草芽孢杆菌B15-3好氧发酵2 d，接种比例为酿酒酵母SC17-1:植物乳杆菌LP15-1:枯草芽孢杆菌BS15-3=1:1:10，即1.0×106 CFU/g:1.0×106 CFU/g:1.0×107 CFU/g，发酵温度为30 ℃下发酵效果最好，在该条件下棉籽粕进行固态生料发酵脱毒率为66.28%，粗蛋白质含量提高了6.38%，酸溶蛋白含量提高了88.30%，L-乳酸含量从0.01 g/L提高至1.83 g/L。
4 结论① 综合发酵棉籽粕的感官评价、pH、活菌数、游离棉酚降解率、酸溶蛋白和粗蛋白质含量的提升效果以及L-乳酸含量来看，本试验采用两步法发酵棉籽粕，即先接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1进行厌氧发酵，再接种枯草芽孢杆菌BS15-3进行好氧发酵的效果较好。
② 通过正交试验得到的发酵棉籽粕最佳工艺为：料水比为1.00:0.80，先接种酿酒酵母SC17-1和植物乳杆菌LP15-1厌氧发酵2 d，再接种枯草芽孢杆菌B15-3好氧发酵2 d，发酵温度为30 ℃，接种比例为酿酒酵母SC17-1:植物乳杆菌LP15-1:枯草芽孢杆菌BS15-3=1:1:10，在该条件下发酵，棉籽粕脱毒率为66.28%，粗蛋白质含量从44.66%升高至47.51%，酸溶蛋白含量从2.65%升高至4.99%，L-乳酸含量从0.01 g/L升高至1.83 g/L。
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