鸡的种蛋内包含了鸡胚发育所需的全部营养物质和遗传信息，种蛋内环境的改变会影响鸡胚的生长发育过程，进而改变其后续生长发育及对环境的适应能力。姚宏等[1]向种蛋内注射硫酸铜(CuSO4)溶液，种蛋内铜离子(Cu2+)水平上升，增强了肉鸡的抗氧化能力，促进了鸡胚绒毛尿囊膜(chorioallantoie membrane，CAM)血管生成。同时，种蛋外环境的改变也同样可以影响鸡胚的生长发育，例如可通过对孵化期的种蛋进行热处理，降低出雏后肉鸡的体温，进而增强其耐热能力[2-3]。CAM作为鸡胚发育过程中的临时呼吸器官，具有丰富的毛细血管网，促进鸡胚CAM血管生成能提高孵化期鸡胚的氧气交换效率[4]。此外，因为CAM所具有的毛细血管网对促进或抑制血管生成的药物极其敏感，因此在试验中常常被用作评判药物影响血管生成情况的模型[5]。浸泡法源于种蛋入孵前的表面消毒，此法常被学者用来研究种蛋内环境变化对鸡胚生长发育的影响。苏兰利等[6]使用黄芪多糖溶液浸泡种蛋，黄芪多糖进入种蛋后提升了出雏肉鸡的抗氧化性能，促进了肉鸡的生长发育。浸泡法相较于蛋内注射法有着价格低廉、操作简单及在生产中可进行大规模操作的优点[7]。
阿魏酸(ferulic acid，FA)是从中药材中分离提纯得到的一种酚酸，具有增强机体抗氧化性能、促进血管生成、缓解局部炎症和抑制细菌生长等生物学功能，且毒性低[8-9]。目前在禽畜养殖领域中有关阿魏酸的相关研究主要集中在给动物饲喂添加阿魏酸的饲粮并观察其对动物抗氧化性能的影响以及蛋内注射阿魏酸研究其对CAM血管发生的影响等方面。李艳娇等[10]研究发现，饲粮中添加阿魏酸提高了公猪肝脏和肌肉中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，并降低了丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，进而提升公猪的肉品质。Valadez-García等[11]研究发现，饲粮中添加阿魏酸提高了热应激条件下山羊的饲料转化率，降低了山羊机体的蛋白质氧化水平。此外，Lin等[12]在种蛋内注射阿魏酸，发现其促进了鸡胚CAM血管生成，同时上调了CAM中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子2(basic fibroblast growth factor 2，FGF2)的基因表达。以上研究表明，阿魏酸能促进鸡胚CAM血管生成及提高动物机体的抗氧化能力，从而促进机体的生长发育。但是，通过阿魏酸溶液浸泡种蛋的方式来研究其对鸡胚生长发育的影响还未见报道。因此，本试验旨在用不同浓度的阿魏酸溶液浸泡孵化期肉鸡种蛋，探究其对鸡胚CAM血管生成和1日龄肉鸡抗氧化性能的影响，以期为阿魏酸在家禽养殖中的应用提供一定的理论和试验依据。
1 材料与方法 1.1 试验种蛋黄羽肉鸡种蛋132枚，蛋重为(60±3) g，购自富瑞康农业有限公司。
1.2 主要试剂阿魏酸(纯度＞99%)，粉末状，购自上海源叶生物科技有限公司；GSH-Px、SOD、MDA及考马斯亮蓝蛋白试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；RNA提取与反转录试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自北京宝日医生物技术有限公司。
1.3 主要仪器酶标仪(SpectraMax iD5，美谷分子仪器有限公司)、实时荧光定量PCR仪(FQD-96A，杭州博日科技有限公司)、孵化器(KFK微电脑全自动孵化器，科裕孵化设备有限公司)、超微量核酸蛋白测定仪(NanoDrop ONEC，安徽鸿众医疗器械有限公司)、显微镜(DP70，日本olympluas公司)、电泳仪(EPS-600，上海纳识生物科技有限公司)。
1.4 试验设计与方法选择当天生产的肉鸡种蛋200枚，为了消除运输过程中的影响，将种蛋静置1 d，从中选取重量[(60±3) g]相近的种蛋132枚，随机分为对照组、低浓度组和高浓度组，每组44枚。种蛋经消毒后在孵化器内温度37.6~38.2 ℃、相对湿度60%~75%条件下进行孵化，种蛋孵化的前期、中期和后期根据孵化要求调整孵化器的温度和相对湿度。
在避光条件下向体积为4 L的50 ℃纯水中分别加入160和480 mg阿魏酸粉末，用玻璃棒持续搅拌至阿魏酸完全溶解，配制成浓度分别为40和120 mg/L的阿魏酸溶液。孵化至7、8、9胚龄时，低浓度组和高浓度组种蛋每天分别用40和120 mg/L阿魏酸溶液浸泡6 min，对照组种蛋用纯水浸泡相同时间，阿魏酸溶液和纯水温度均为38 ℃，浸泡后晾干并放回孵化器中继续孵化。本试验浸泡时间与方法参考苏兰利等[6]，浸泡浓度参考Lin等[12]。
1.5 样品的采集与制备13胚龄时，每组选取3枚活胚，用镊子在种蛋钝端开孔，并用注射器滴加2 mL甲醇-丙酮(1 ∶ 1)混合液固定鸡胚CAM 2 h时，固定结束后用眼科剪取下鸡胚CAM贴于载玻片上，置于阴凉处保存；14胚龄时，采集对照组和低浓度组鸡胚CAM，经液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱中待用。因在13胚龄进行鸡胚CAM固定的过程中发现高浓度组死胚较多，为保证有足够的种蛋数进行出雏统计，故14胚龄时没有对高浓度组鸡胚CAM进行采集。雏鸡出雏后立刻记录出雏重，出雏结束后统计出雏率；每组随机选取10只1日龄肉鸡，采集血清及各组织、器官并称重，计算器官指数(器官指数=100×器官重/雏鸡重)。采集血清及各组织、器官放入2 mL冻存管经液氮速冻后保存在-80 ℃冰箱中待用。
1.6 鸡胚CAM血管生成及与抗氧化相关指标的测定固定好的鸡胚CAM在显微镜下拍照后，使用ImageJ-win64分析软件对图像进行处理并分析，统计鸡胚CAM的血管相对面积(血管面积/尿囊膜面积)与新生血管数目。每组随机选取6个血清、肝脏和胸肌样本，参照相应试剂盒说明书测定GSH-Px、SOD活性和MDA含量。
1.7 荧光实时定量PCR参照试剂盒说明书每组选取6个样本提取CAM、肝脏和胸肌组织总RNA，经变性电泳检测RNA质量后反转录为cDNA，在NCBI中查询SOD、GSH-Px、VEGF、FGF2和β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA序列并由苏州金唯智生物科技有限公司根据序列设计并合成引物，荧光定量PCR中的引物序列见表 1。按照荧光实时定量PCR仪操作说明进行试验，以β-actin为内参基因，根据2-△△Ct法计算mRNA相对表达量。
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表 1 荧光定量PCR中的引物序列 Table 1 Primer sequences in fluorescence quantitative PCR |
试验数据采用SPSS 26.0统计软件进行单因子方差分析(one-way ANOVA)，然后进行LSD多重比较，结果用平均值±标准误表示，P＞0.05为差异不显著，P＜0.05为差异显著。
2 结果 2.1 阿魏酸溶液浸泡种蛋对种蛋出雏率的影响由表 2可知，与对照组相比，高浓度组种蛋出雏率降低了22%，低浓度组种蛋出雏率与对照组相近。
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表 2 阿魏酸溶液浸泡种蛋对种蛋出雏率的影响 Table 2 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on hatching rate of fertilized eggs |
由表 3和图 1可知，低浓度组鸡胚CAM中血管相对面积和新生血管数目显著高于对照组(P＜0.05)，而高浓度组鸡胚CAM中血管相对面积和新生血管数目显著低于对照组(P＜0.05)。
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表 3 阿魏酸溶液浸泡种蛋对13胚龄鸡胚CAM血管生成的影响 Table 3 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on CAM angiogenesis of chicken embryo at 13 embryonic age |
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图 1 阿魏酸溶液浸泡种蛋对13胚龄鸡胚CAM血管生成的影响 Fig. 1 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on CAM angiogenesis in chicken embryo at 13 embryonic age |
由表 4可知，与对照组相比，低浓度组鸡胚CAM中VEGF和FGF2基因表达均显著上调(P＜0.05)。
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表 4 阿魏酸溶液浸泡种蛋对14胚龄鸡胚CAM中VEGF和FGF2基因表达的影响 Table 4 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on gene expression of VEGF and FGF2 in chicken embryo CAM at 14 embryonic age |
由表 5可知，阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡器官指数及出雏重/蛋重没有显著影响(P＞0.05)。
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表 5 阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡器官指数及出雏重/蛋重的影响 Table 5 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on organ indexes and chick weight/egg weight of one-day-old broiler chickens |
由表 6、表 7、表 8可知，与对照组相比，高浓度组血清SOD和GSH-Px活性显著升高(P＜0.05)，血清MDA含量显著降低(P＜0.05)；低浓度组血清GSH-Px活性显著升高(P＜0.05)，血清SOD活性和MDA含量无显著差异(P＞0.05)。与对照组相比，低浓度组和高浓度组肝脏SOD活性和MDA含量显著降低(P＜0.05)，肝脏GSH-Px活性无显著差异(P＞0.05)。各组之间胸肌SOD、GSH-Px活性和MDA含量无显著差异(P＞0.05)。
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表 6 阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡血清SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响 Table 6 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on serum SOD, GSH-Px activties and MDA content of one-day-old broiler chickens |
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表 7 阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡肝脏SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响 Table 7 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on liver SOD, GSH-Px activities and MDA content of one-day-old broiler chickens |
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表 8 阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡胸肌中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影响 Table 8 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on pectoral muscle SOD, GSH-Px activities and MDA content of one-day-old broiler chickens |
由表 9、表 10可知，与对照组相比，低浓度组和高浓度组肝脏SOD基因表达显著下调(P＜0.05)，而肝脏GSH-Px基因和肌肉SOD、GSH-Px基因表达无显著差异(P＞0.05)。
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表 9 阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡肝脏中SOD和GSH-Px基因表达的影响 Table 9 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on gene expression of SOD and GSH-Px in liver of one-day-old broiler chickens |
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表 10 阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡胸肌中SOD和GSH-Px基因表达的影响 Table 10 Effects of fertilized eggs soaked in ferulic acid solution on gene expression of SOD and GSH-Px in pectoral muscle of one-day-old broiler chickens |
本研究中，低浓度的阿魏酸溶液浸泡种蛋使鸡胚CAM中血管相对面积和新生血管数目显著增加，而高浓度的阿魏酸溶液浸泡种蛋则抑制了鸡胚CAM的血管生成，这与阿魏酸在动物体内的生物学效应具有剂量双向性有关，其使用量存在一个最适值[13]。低浓度的阿魏酸溶液浸泡种蛋通过上调鸡胚CAM中VEGF和FGF2基因表达，促进了鸡胚CAM血管发生，这与Lin等[12]在9胚龄的鸡胚CAM中滴加阿魏酸溶液后，将其正常孵化到11胚龄，发现阿魏酸可以显著上调CAM中的VEGF和FGF2基因表达并增加鸡胚CAM的血管相对面积和新生血管数的研究结果基本一致。
高浓度的阿魏酸溶液浸泡种蛋抑制鸡胚CAM的血管生成的原因可能是阿魏酸具有抑制炎症的生物学功能。有研究表明，机体内的炎症因子有促进血管发生的作用。如孙晓伟[14]通过在烧碱烧伤角膜大鼠的角膜上滴加高浓度的阿魏酸溶液，证实了阿魏酸能通过抑制部分炎症因子如白细胞介素-6的基因表达和蛋白表达水平，进而抑制动物模型的血管生成。
低、高浓度阿魏酸溶液浸泡种蛋对肉鸡出雏重/蛋重以及1日龄器官指数均没有显著影响，这表明进入种蛋的阿魏酸并不直接影响鸡胚组织器官的生长发育，而更多的是作为机体内的一种信号分子实现阿魏酸的生物学功能。Macías-Cruz等[15]在饲粮中添加阿魏酸喂养母羊34 d，结果表明饲粮中添加阿魏酸不影响母羊生长性能及胴体品质。低浓度的阿魏酸溶液浸泡种蛋对种蛋出雏率没有影响，而高浓度的阿魏酸溶液浸泡种蛋通过减少鸡胚CAM中血管相对面积和新生血管数，抑制了鸡胚血管的生成，影响鸡胚与外界的气体交换，导致孵化期死胚较多，从而降低了种蛋出雏率。
3.2 阿魏酸溶液浸泡种蛋对1日龄肉鸡抗氧化性能的影响在本试验中，与对照组相比，高浓度组血清SOD和GSH-Px活性显著升高，血清MDA含量显著降低；低浓度组血清GSH-Px活性显著升高；同时，低浓度组和高浓度组肝脏MDA含量显著降低，这表明阿魏酸溶液浸泡种蛋能提升1日龄肉鸡的抗氧化性能。有研究证明，阿魏酸可以使细胞内核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)与Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(epoxy chloropropane Kelch sample related protein 1，Keap1)解偶联，促进Nrf2的核转位，增加机体SOD和GSH-Px活性，进而增强机体抗氧化性能[16-17]；又因为阿魏酸在动物体内的影响存在着剂量依赖性[8]，所以不同浓度阿魏酸溶液浸泡肉鸡种蛋对1日龄肉鸡抗氧化性能影响不相同。
低浓度组和高浓度组肝脏MDA含量显著降低是由于肝脏是机体中重要的代谢器官，当机体内大量的血液流经肝脏时，其中的高活性SOD或GSH-Px清除了肝脏中的氧自由基，降低了活性氧水平，减少了脂质过氧化的发生，进而降低了MDA含量。肝脏SOD基因显著表达下调及活性显著降低则可能是因为Nrf2代谢较快，其半衰期(T1/2)仅10~30 min，且只有当细胞受到活性氧或其他亲核剂刺激后Keap1才与Nrf2解偶联，活化的Nrf2再转运入胞核，从而增强机体的抗氧化性能[18]。已有研究表明，阿魏酸在动物机体中的代谢效率较高，仅停留5 h左右[11]，这将导致低浓度组和高浓度组肝脏细胞在出生后的1 d天里缺乏阿魏酸与活性氧的刺激，使Nrf2与Keap1重新偶联，SOD基因的表达被巨噬细胞活化因子(Maf)形成的同源二聚体竞争性抑制[19]，因此使肝脏SOD基因表达显著下调，并显著降低了肝脏SOD活性。
此外，阿魏酸溶液浸泡种蛋不影响胸肌SOD和GSH-Px基因表达，对胸肌SOD、GSH-Px活性及MDA含量均无显著影响。这可能是由于流经胸肌的血流较少，对胸肌中的氧自由基含量影响较小，不影响胸肌MDA含量，在出雏后的时间里对Keap1与Nrf2偶联情况影响较小，所以不影响胸肌SOD和GSH-Px基因表达及活性。
4 结论低浓度阿魏酸溶液浸泡种蛋能通过上调鸡胚CAM中VEGF和FGF2基因表达，促进鸡胚CAM血管生成，而高浓度阿魏酸溶液浸泡种蛋会抑制鸡胚CAM血管生成，降低出雏率；低、高浓度阿魏酸溶液浸泡种蛋均能提升1日龄肉鸡的抗氧化性能。
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