反刍动物可以将其他动物难以利用的粗纤维降解为自身生长所需的营养物质，从而为人类提供优质的蛋白质，如牛、羊等肉制品和奶制品。反刍动物之所以具有独特的利用各种饲料的能力，这主要归功于反刍动物瘤胃中栖息着复杂、多样、非致病的各种微生物，包括细菌、真菌、原虫和古菌。这些微生物通过分泌不同种类的分解酶来降解饲料中的纤维素、半纤维素、木质素并产生挥发性脂肪酸(VFAs)，VFAs能够提供反刍动物所需要能量的70%以上。另外，瘤胃中的微生物还能合成B族维生素以及必需氨基酸供反刍动物利用[1]。由于新生反刍动物通过食管沟反射的方式将进食的母乳直接送入到皱胃，以单胃动物的消化方式进行消化吸收，所以新生反刍动物的瘤胃是不具备发酵功能的。新生反刍动物瘤胃发酵功能由未建立到完善的阶段被称作瘤胃发育过程，之前的研究已经证明瘤胃发育过程分为3个阶段：非反刍阶段(0~3周龄)、过渡阶段(3~8周龄)和反刍阶段(8周龄以后)[2]。在新生反刍动物的瘤胃发育过程中，各种微生物相继在瘤胃中定植，复杂的微生物区系逐渐建立，从而使反刍动物瘤胃具备发酵粗纤维的能力。然而，目前人们对于反刍动物瘤胃发育过程中各种微生物的定植以及群落结构演变规律知之甚少。此外，人们还希望在瘤胃微生物完全建立之前通过调控新生反刍动物的饲粮结构和饲养管理等，达到促进瘤胃内不同微生物群落的定植并产生持久影响的效果，进而达到改善瘤胃发酵功能、减少甲烷排放和提高反刍动物生长性能的目的。
已有研究报道，成年反刍动物瘤胃微生物群落具有较强的稳定性[3-4]，一些调控措施对于成熟瘤胃中微生物群落的调控只能产生短暂的影响，一旦停止调控瘤胃微生物群落组成和发酵将会恢复到处理之前的状态[5]。Yáñez-Ruiz等[5]认为，瘤胃微生物群落完全建立之前，是瘤胃微生物群落早期调控的理想窗口期。Abecia等[6]报道，早期饲粮调控可以改变瘤胃中古菌菌群的定植，从而影响羔羊甲烷的排放。而深入了解早期瘤胃微生物的定植过程是科学精准调控瘤胃功能的基础。因此，本研究首先综述了新生反刍动物瘤胃发育过程中各种微生物的定植过程，然后报道了幼龄反刍动物瘤胃微生物早期调控的最新研究成果，以期为反刍动物瘤胃发育过程中早期调控提供理论依据。
1 瘤胃微生物定植过程 1.1 细菌群落的建立过程最早研究者认为大部分刚出生的反刍动物的胃肠道是无菌的，然后来自母体和周围环境中的微生物在瘤胃中迅速定植[7]，一般在出生数分钟内细菌的数量约为1.9×108拷贝数/g瘤胃内容物[8]。Guzman等[9]研究发现，在出生0~20 min的犊牛瘤胃中发现甲烷菌和纤维降解菌的存在，表明瘤胃微生物的定植可能在分娩之前或者分娩过程中就已经发生。最新的研究通过使用多组学方法发现动物在出生前肠道中已经定植了有活性的微生物组。研究人员以足月无菌剖宫产的羔羊为试验对象，无菌采集羔羊的脐带血和盲肠食糜样品，检测盲肠食糜中的微生物组与脐带血和盲肠食糜中的微生物代谢产物后发现，胎儿肠道中存在低多样性和低生物量的微生物组，以变形菌门、放线菌门和厚壁菌门的细菌组成为主，其中大肠杆菌是丰度最多的微生物。在盲肠食糜中检测到了多种微生物代谢产物，确定了这些微生物具有代谢活性。但是遗憾的是该研究并没有报道胎儿瘤胃中是否存在微生物组[10]。大量的研究发现，在反刍动物的瘤胃发育过程中微生物以一种明确的、渐进的顺序迅速进行定植。微生物定植顺序及丰度主要取决于相同功能微生物对可利用底物的竞争，即瘤胃“生态位抢占”。生命早期微生物群落由需氧和兼性厌氧微生物组成，在6~8周龄时被厌氧类群完全取代[11]。Rey等[12]在研究新生犊牛瘤胃微生物的定植过程时发现，瘤胃中细菌的定植呈现三步变化：出生后2 d，变形菌门(70%)和拟杆菌门(14%)为优势菌门，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)(58%)为优势菌科；出生后3~12 d，拟杆菌属(Bacteroides)(21%)、普雷沃氏菌属(Prevotella)(11%)、梭杆菌属(Fusobacterium)(5%)和链球菌属(Streptococcus)(4%)为优势菌属，此阶段便已有成熟瘤胃中常见的细菌存在，说明参与降解饲粮中营养物质的菌群在反刍动物摄取固体饲料之前便已在瘤胃中定植；出生后15~83 d，随着固体饲料摄入量的迅速增加，普雷沃氏菌属成为最优势菌属(42%)，其具有降解蛋白质和利用淀粉的重要功能[13]，这说明此阶段饲粮对瘤胃菌群结构变化的影响最显著。焦金真[14]通过MiSeq高通量测序研究了0~70日龄山羊瘤胃食糜细菌定植规律发现，变形菌门相对丰度随日龄增长而降低，而拟杆菌门和厚壁菌门相对丰度的变化与变形菌门正好相反，许多研究结果[3, 12, 15]与此一致。在属水平，刚出生羔羊瘤胃内容物中优势菌属为埃希氏菌属(Escherichia)、弓形杆菌属(Arcobacter)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)。埃希氏菌属为兼性厌氧菌，可改变瘤胃内环境为厌氧微生物提供适宜定植环境；7日龄后，埃希氏菌属比例显著降低，而拟杆菌属成为优势菌属；28日龄后，普雷沃氏菌属为最优势菌属(>20%)，而纤维降解菌在开食料供给后才可以检测到[16]。李碧波[17]认为羔羊0~14日龄和28~56日龄瘤胃菌群差异最明显，可能与0~14日龄以母乳为主，28~56日龄逐渐采食固体饲料有关。瘤胃微生物的定植可以分为三大类，分别是先导菌、过渡菌和成熟菌。芽孢杆菌属(Bacillus)和乳球菌属(Lactococcus)为主要的先导菌，拟杆菌属、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、NK4A214和密螺旋体菌属2(Treponema 2)等为主要的过渡菌，成熟菌为普雷沃氏菌属1和理岩菌科RC9。另一项研究也发现类似规律，羔羊0~14日龄是微生物发育阶段，14~28日龄是微生物过渡阶段，28~56日龄是微生物稳定阶段[15]；该研究还发现，羔羊0日龄时，厚壁菌门为优势菌门，占比为80%，而拟杆菌门占比为8%；0日龄之后，拟杆菌门所占比例迅速上升，达50%，并随日龄增长基本保持稳定状态。在属水平上，羔羊刚出生没哺乳之前优势菌属是芽孢杆菌、乳球菌属和假单胞菌属(Pseudomonas)，特别是芽孢杆菌属，其比例高达55.55%；摄入母乳后，拟杆菌门变为优势菌门，芽孢杆菌属和乳球菌属的数量逐渐减少，最后几乎消失。芽孢杆菌属和乳球菌属作为母体阴道原生菌群主要组成部分会传递给下一代，并在形成机体的定植抗性和调节宿主的免疫效应方面起到关键作用[18]。在过渡阶段，卟啉单胞菌属、梭菌属、疣微菌科、Bibersteiniaren被认为是过渡菌群，可能与哺乳有关，21日龄后随着纤维的摄入而逐渐减少。另外，理岩菌科RC9肠道群、普雷沃氏菌科UCG-003、拟杆菌目_S24-7、普雷沃氏菌属1、瘤胃球菌属1、瘤胃球菌属2、月形单孢菌属1、纤维杆菌属的比例从28日龄开始增加，这些菌群与纤维的降解有关，出生28 d后瘤胃菌群逐渐稳定。
除了定植在瘤胃内容物的细菌，定植在瘤胃上皮(指瘤胃乳头和黏膜)的细菌也日益引发了研究者们的关注。许多研究发现瘤胃内容物和瘤胃上皮定植的细菌多样性和丰富度差异显著[19-23]，这是由于动物采食固体饲料后，食糜聚集在瘤胃腹囊，导致瘤胃内容物和瘤胃上皮之间的微环境(如氧气、pH)和细菌组成不同。与瘤胃内容物细菌相比，瘤胃上皮细菌可能与氮利用、氧清除、上皮细胞增殖和负责调节瘤胃壁吸收VFAs的基因表达有关，而与发酵碳水化合物无关[23]。李碧波[17]研究发现，随着山羊日龄的增长，瘤胃上皮中的变形菌门被厚壁菌门和拟杆菌门所取代，此外，随着山羊日龄的增长，丁酸弧菌属2(Butyrivibrio 2)成为主要优势菌属。丁酸弧菌属2作为瘤胃上皮产丁酸的主要菌属，产生的丁酸被瘤胃上皮直接吸收，提高了瘤胃上皮对丁酸的利用率，并有利于瘤胃上皮细胞的增殖和发育[24]。焦金真[14]发现，山羊瘤胃上皮定植的细菌alpha多样性指数随日龄增长而增加，且主坐标分析(PCoA)结果表明不同日龄时细菌组成不同。在门水平，优势菌门由变形菌门转为厚壁菌门和拟杆菌门，这与李碧波[17]的研究结果一致；在属水平，0日龄时埃希氏菌属为优势菌属，固体开食料供给后普雷沃氏菌属、丁酸弧菌属、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)和弯曲杆菌属(Campylobacter)随日龄增长而增加，并成为优势菌属[14]。Chai等[19]也发现山羊羔羊瘤胃上皮细菌以弯曲杆菌属为主，并且弯曲杆菌属可能参与瘤胃解剖形态发育以及氨和VFAs的代谢。
以上研究表明，由于宿主、饲粮成分、饲养管理和个体差异等因素的影响，早期瘤胃微生物群落建立的具体时间及其定植规律不尽相同。虽然日龄变化会对瘤胃微生物定植产生影响，但主要的影响因素还是饲粮的变化。根据上述研究结果，早期瘤胃微生物建立过程大致可划分为3个阶段：1)最初定植阶段(出生后0~2 d)，微生物主要来源于母体(包括产道、初乳和唾液)、外界环境等[25]，如芽孢杆菌和乳球菌属。2)过渡阶段(出生后3~28 d)，由初乳过渡到常乳，可利用乳中营养成分(单糖、乳糖或乳脂等)的菌群比例逐渐升高，如拟杆菌属、乳杆菌属(Lactobacillus)等[26-27]，这些菌属降解简单碳水化合物产生的乙酸可被丁酸球菌属(Butyricicoccus)和粪杆菌属(Faecalibacterium)等利用产生丁酸，丁酸可以促进瘤胃上皮的发育[28]。因此，丁酸球菌属和粪杆菌属的比例与母乳摄入量呈正相关。另外，此阶段已定植细菌也是成熟瘤胃中常见的组成成员，如普雷沃氏菌属和拟杆菌属。3)成熟阶段(固体饲料摄入增加)，随着母乳摄入比例减少，固体的开食料和粗纤维的采食量逐渐增加，可降解淀粉和纤维等微生物的比例逐渐升高，并成为瘤胃中的稳定菌属。如普雷沃氏菌属1、瘤胃球菌科UCG-005、理岩菌科RC9和瘤胃球菌科UCG-010等[17, 29]。
1.2 产甲烷菌群落的建立过程产甲烷菌占瘤胃微生物群落的0.3%~3.0%[30]，在产甲烷菌当中，大约78%的产甲烷菌是氢营养型的，而22%的产甲烷菌可以利用来自甲醇或甲胺的甲基基团合成甲烷，而利用乙酸合成甲烷的产甲烷菌很少[31]。Henderson等[32]对来自全球35个国家的瘤胃和前肠样品(来自379头牛、106只绵羊、59只鹿、52只山羊和72个其他类型反刍动物)的产甲烷菌群落组成进行了全面地普查，结果显示，尽管样本来自不同的反刍动物、地点、饲粮和条件，但优势产甲烷菌属却惊人的相似，几乎所有的反刍动物瘤胃样品中都发现了Methanobrevibacter gottschalkii和Mbb. Ruminantium，平均占到古菌群落的74%，连同Methanosphaera sp.和2个Methanomassiliicoccaceae的附属群，5个主要产甲烷菌群几乎占到古菌群落的90%。反刍动物排放甲烷不仅会加剧全球温室效应，而且还会造成2%~12%的饲粮能量浪费。因此，反刍动物胃肠道甲烷减排对缓解全球温室效应和提高饲养效率具有重要意义。最近的研究侧重于通过在反刍动物生命早期对微生物群落进行调控来减少甲烷的形成，正如Yáñez-Ruiz等[5]所总结的新生反刍动物瘤胃微生物群落更具可塑性，因为与成年反刍动物已建立的微生物组相比，对其进行调控更有可能产生持久的影响。而了解产甲烷菌在瘤胃发育过程中的定植规律，为不同发育时期的精准调控和确定最佳调控窗口期提供了可能，但是目前有关产甲烷菌在早期瘤胃发育过程中定植的研究较少。
刚出生的反刍动物瘤胃中就有产甲烷菌定植，并且产甲烷菌群的建立和发展是一个迅速的过程。较早的研究报道，产甲烷菌在2~4日龄的羔羊瘤胃中就已经存在，并且在10~14日龄羔羊瘤胃中产甲烷菌丰度便已达到成年羊瘤胃中的水平[33]。随着分子生物相关研究技术的发展，Guzman等[9]基于实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术，在出生后20 min的犊牛瘤胃中就检测到有代谢活性的产甲烷菌，如Methanomicrobiales mobile、Methanoccocales votae和Methanobrevibacter spp.。有报道称，山羊瘤胃细菌的组成随着年龄的改变而发生明显的变化，然而，类似的年龄依赖模式在山羊瘤胃古菌中并不明显。一项有关山羊1日龄到2岁龄的12个年龄段的研究发现，山羊各年龄段瘤胃液中优势菌门均为广古菌门(84.02%)和泉古菌门(14.38%)，1~15日龄广古菌门的丰度逐渐增加，之后丰度趋于稳定，而泉古菌门的丰度从出生到15日龄逐渐降低，之后也趋于稳定；不同年龄段个体古菌菌群组成在5月龄之前差异较大，5月龄之后差异逐渐减小，并趋于稳定；而不同年龄段个体的细菌菌群在1.5岁后逐渐稳定[34]。也有研究认为日龄是影响反刍动物瘤胃中产甲烷菌定植的重要因素之一。焦金真[14]通过MiSeq高通量测序研究了补饲和放牧条件下0、7、28、42和70日龄山羊瘤胃食糜中产甲烷菌的定植规律，结果发现，无论哪种饲养方式，从7~70日龄，操作分类单元(OTU)个数、Chao指数和Ace指数均随日龄的增长而呈二次增加；产甲烷菌在出生后1周内开始定植，无论是哪个日龄，产甲烷菌的优势属主要是Methanobrevibacter、Methanosphaera和Rumen cluster C。在7日龄时，Methanobrevibacter和Methanosphaera比例很低，大部分为未鉴定的产甲烷菌(77.8%)；在开食料供给后，Methanobrevibacter、Methanosphaera和Rumen cluster C的相对丰度均急剧升高，表明开食料对于产甲烷菌的组成有很大的影响。在Methanobrevibacter中，Methanobrevibacter gottschalkii相对丰度最高，其次是Methanobrevibacter ruminantium，而Methanobrevibacter中其他的产甲烷菌进化枝相对丰度较低。同瘤胃细菌研究类似，产甲烷菌的研究大部分也都局限于瘤胃固相、液相和原虫，考虑到定植于瘤胃上皮的微生物与瘤胃发育以及免疫功能之间可能存在紧密联系，因此对分布于瘤胃不同部位产甲烷菌的研究具有积极意义。Wang等[35]利用qRT-PCR技术研究了出生1、10、20、38、41、50、60 d的山羊瘤胃产甲烷菌在瘤胃固相、液相、上皮、原虫表面定植过程，发现在1日龄时瘤胃液相与上皮中就有代谢活性的产甲烷菌定植，4个部分中产甲烷菌的拷贝数前期随着日龄的增加而增加，而补饲之后4个部分中产甲烷菌的拷贝数均趋于稳定。瘤胃固相中产甲烷菌拷贝数是最多的，而瘤胃上皮中产甲烷菌拷贝数最少。基于提取RNA的16S rRNA扩增子测序结果显示：Methanobrevibacter、Candidatus Methanomethylophilus以及Methanosphaera是4个部分中丰度最高的产甲烷菌，这3个产甲烷菌属的相对丰度总共占据了总产甲烷菌的89.8%~98.3%。
1.3 真菌群落的建立过程众所周知，和瘤胃细菌菌群一样，厌氧真菌在降解纤维性饲料原料中发挥着重要作用，因为它们能够破坏植物组织结构并促进纤维分解菌对纤维颗粒的定植。瘤胃中的真菌在分解饲粮纤维过程中还会释放大量有利于产甲烷菌群落的氢气(H2)。因此，厌氧真菌活性可能会影响成熟瘤胃中细菌和古菌群落的结构，从而影响纤维利用效率和甲烷排放量[36]。以前的研究认为瘤胃真核生物定植与原核生物相比较晚，羔羊8~10日龄后瘤胃才出现真菌定植[37]。但是张科[38]采用MiSeq高通量测序技术对0、3、7、14、21、42、56日龄羔羊瘤胃真菌的定植过程进行了研究，结果发现，0日龄的羔羊瘤胃中便已有真菌定植，说明真菌在固体饲料摄入之前就已在瘤胃中定植。0日龄真菌群落与其他日龄差异较大，3、7、14、21日龄时真菌群落结构差异不大，28、42、56日龄时真菌群落结构差异不大。14日龄之前，子囊菌门(Ascomycota)所占比例较高，为优势菌门，14日龄之后，新美鞭菌门(Neocallimastigomycota)所占比例逐渐增加，成为优势菌门。属水平分析显示，0日龄的羔羊曲霉属真菌(Aspergillus)所占比例最高，为47%，3日龄后逐渐减少，到14日龄时消失。焦金真[14]也发现类似的规律，山羊瘤胃真菌定植较早，在出生当天就已定植，在门水平上，瘤胃真菌主要由子囊菌门和新美鞭菌门组成，子囊菌门在0和7日龄时丰度较高，而新美鞭菌门在28、42和70日龄时丰度较高。
1.4 原虫类群的建立过程原虫即原生动物，分属于鞭毛虫(flagellates)和纤毛虫(ciliates)，鞭毛虫多存在于新生反刍动物瘤胃，随日龄增加，鞭毛虫数量逐渐减少，成年后瘤胃中原虫类群以纤毛虫为主。尽管瘤胃原虫数量相对于细菌和产甲烷菌少，但其细胞体积大，因此其生物量可占瘤胃内微生物总量约20%或达到50%。与厌氧真菌一样，原虫与瘤胃古菌和细菌群落密切相关，可以影响营养物质的消化、发酵和甲烷产量[39]。然而，与其他瘤胃微生物不同的是，新生反刍动物纤毛原虫的建立依赖于成年动物唾液直接或间接的接触[40]。原虫建立时间一般较其他微生物群落晚，一般出生2周内瘤胃可发现原虫的存在[41]，并且通常是较小的Entodinia类原虫，Entodinia类原虫会在较大的Endomorphs和Holotrich原虫之前定植。但是，如果新生动物在出生后就与其他反刍动物隔离，则其瘤胃内将无法定植原虫[42]。
2 幼龄反刍动物微生物群落的调控幼龄反刍动物瘤胃微生物群落具有很强的可塑性。在此期间，任何外部干预都可能导致瘤胃微生物群落短期或长期性的变化。在瘤胃微生物定植早期阶段进行调控，可以引导瘤胃微生物菌群有序的定植和健康的发酵，提高宿主的健康水平和后续生长性能。而饲粮作为瘤胃微生物发酵的底物，其营养组成和物理特性直接影响微生物的定植。Yáñez-Ruiz等[43]发现羔羊在断奶前后饲喂精料或粗饲料可以调节瘤胃微生物结构，并且此影响可持续超过4个月。Dias等[27]采用新一代测序技术研究了添加开食料对断奶前45头犊牛瘤胃古菌、细菌和厌氧真菌群落的影响，发现补饲开食料后增加了瘤胃中降解碳水化合物细菌群落(如Megasphaera、Sharpea和Succinivribrio)的多样性，瘤胃细菌群落的变化也与瘤胃发酵模式的变化相关，而瘤胃发酵模式的转变促进了Methanosphaera sp. A4的定植。相比之下，饲喂牛乳的犊牛瘤胃中降解乳中营养成分的细菌群落为优势菌属(如乳杆菌属、拟杆菌属和副拟杆菌属)。在羔羊开食料中添加亚麻籽油，瘤胃中琥珀酸弧菌科和韦荣氏菌科的相对丰度较高，停止添加亚麻籽油后该作用效果仍有效[44]。这说明通过饲粮调控早期瘤胃微生物群落以达到调控成熟瘤胃微生物群落具有可行性。早期瘤胃微生物群落的调控措施除了饲粮类型外，还包括瘤胃微生物的移植和在饲粮中添加特异性促进或抑制某些微生物的添加剂。瘤胃微生物移植是一种重塑瘤胃菌群结构的有效手段。给新生羔羊持续灌服成年羊新鲜瘤胃液11周，促进了原虫的定植，提高了粗饲料的采食量和瘤胃氨态氮(NH3-N)、VFAs浓度[45]。Yu等[46]给羔羊饲喂冻干的瘤胃液后发现改变了瘤胃反刍兽新月单胞菌(Selemonas ruminantium)和埃氏巨球菌(Megasphaera elsdenii)的组成, 并降低了黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的相对丰度。研究发现，天然植物提取物茶皂素[47]、桑叶黄酮[48]、白藜芦醇[49]等都具有改善瘤胃发酵和降低瘤胃甲烷生成的作用。以白藜芦醇为例，可降低羔羊瘤胃液中甲烷短杆菌的丰度，提高脱硫弧菌属和普雷沃氏菌属的丰度[50]，但停止添加后对瘤胃微生物群落是否具有长期影响并没有报道。此外，反刍动物断奶前后添加微生态制剂也可以改变瘤胃微生物的定植过程。例如，在1~9周龄羔羊的饲粮中添加芽孢杆菌属，提高了瘤胃中瘤胃球菌科、RC9、普雷沃氏菌科和毛螺旋菌科等的相对丰度，并提高了瘤胃中的乙丙比[51]。1~180日龄的羔羊在饲粮中添加酿酒酵母，可促进瘤胃中纤维降解菌的定植，降低瘤胃氨浓度，提高瘤胃VFAs浓度[52]。也有研究认为通过使用特异性抑制剂抑制早期瘤胃中产甲烷菌的定植，可能是减少成年反刍家畜甲烷排放的有效方法。Abecia等[53]研究表明，用甲烷抑制剂(溴氯甲烷)对母羊和初生羔羊进行处理，当停止处理3个月后仍然发现羔羊甲烷排放量减少约33%。
调控早期瘤胃微生物定植的文章相对较多，但是早期瘤胃微生物调控措施对成年反刍动物是否有长期影响效果，仍需进一步确认。除了上述调控措施外，掌握早期阶段调控的最佳窗口期也非常关键。本综述结合产甲烷菌、细菌和真菌群落的定植规律发现，在固体饲料进食之前这些微生物群落就已经在瘤胃中定植，因此认为早期微生物群落调控的“黄金窗口期”是在动物刚出生后，这与Dias等[27]的观点一致。
3 小结总而言之，由于瘤胃中的微生物种类繁多、关系复杂，导致反刍动物早期瘤胃微生物群落建立过程复杂多变，仍需大量的试验来深入、精准地研究早期瘤胃微生物群落的建立过程，以及早期瘤胃微生物群落建立过程中的功能、核心群落的相互作用机制和代谢途径，这是实现精准调控的基础。虽然日龄变化会对瘤胃微生物定植有影响，但主要的影响因素是饲粮的变化。目前的研究发现早期干预对调控瘤胃微生物定植具有较大潜力，但应进一步深入探讨不同调控措施对幼龄反刍动物的长期影响效果，开发提高粗饲料利用、降低瘤胃甲烷生成的早期调控措施。
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