2. 凯里学院大健康学院, 凯里 556011
2. School of Life and Health Science, Kaili University, Kaili 556011, China
全球变暖早已成为世界共为关注的重点问题之一，我国也于2020年提出了碳达峰、碳中和的战略目标。甲烷(CH4)是一种温室作用比二氧化碳(CO2)强20~30倍的温室气体，在由农业活动排放的CH4中，反刍动物被认为是主要排放源，全球反刍动物每年产生CH4约8×107 t，占全球人类活动排放量的28%[1]。不仅如此，反刍动物瘤胃产生的CH4不能被机体利用而以嗳气的形式排出体外，造成了反刍动物2%~15%的能量浪费[2-3]，不利于畜产品的绿色高效生产。随着我国居民对优质肉、蛋、奶产品的需求不断提升和反刍动物养殖规模的不断扩大，探求减少反刍动物CH4排放的方法已经成为当务之急。一些抗生素如莫能菌素已被广泛证实具有降低CH4产生的作用[4-5]，但随着全球范围内饲料“禁抗”的推行，亟需探寻新的产品或方法来减少CH4的排放。
中草药的应用和研究在我国具有悠久的历史，近年来更是发现其提取物具有添加量小、毒副性小、无残留或残留极小及不易产生抗药性等特点[6]，被广泛应用于药品、食品和饲料添加剂领域。目前，已有多个报道表明饲粮中添加中草药添加剂会对反刍动物瘤胃发酵产生影响。Bodas等[7]评估了450种植物作为抗微生物饲料添加剂的潜力，其中35种植物的添加较对照组降低了CH4产量15%以上，且对消化率、总产气量和挥发性脂肪酸(VFA)没有不利影响。García-González等[8]研究了掌叶大黄根和欧鼠李树皮对体外发酵的影响，表明掌叶大黄根可以使CH4产量显著下降。Durmic等[9]筛选了128种多年生木本植物，研究其对体外发酵的影响，其中有59种植物降低了CH4产量。因此，中草药及其提取物有望成为一种新的瘤胃发酵调控剂来减少反刍动物的CH4排放。
贵州地区有极其丰富的中草药资源，全省共有动、植、矿物药4 300余种，其中植物药4 000余种[10]。带纤毛的原虫能与产甲烷菌形成内源共生系统，有约20%的产甲烷菌寄生在原虫表面。中草药中的有效成分多为植物次生代谢物，基本可分为黄酮类、醌类、酚类、酯类、萜类、甾体及其苷、有机酸、生物碱、多糖类、挥发油几大类，有些成分可以显著抑制瘤胃原虫的生长活性[11-12]，介此可以间接减少产甲烷菌的数量，进而降低反刍动物瘤胃内CH4的产生。本试验选用了7种不同中草药，分别是野葛根、荆芥、柴胡、金银花、钩藤、仙鹤草、五香血藤。这些中草药富含丰富的活性成分，但目前仅见到少量关于野葛根、柴胡及金银花的提取物在反刍动物生产中应用的报道[13-16]，且这些中草药对瘤胃发酵调控及对CH4排放的影响方面尚缺乏研究。鉴于此，本试验采用体外产气法研究这7种中草药对肉牛瘤胃体外发酵的影响，筛选出有利于瘤胃发酵或抑制CH4生成的中草药类添加剂和添加剂量，旨在为开发天然的反刍动物瘤胃发酵调控剂和反刍动物CH4减排产品提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用的7种中草药均来自贵州省黔东南苗族侗族自治州凯里市。7种中草药的主要活性成分及含量见表 1，将中草药粉碎过40目筛，密封备用。发酵所用底物来自于肉牛全混合日粮，成分及配比见表 2，将其65 ℃烘干，粉碎过40目筛并密封待用。体外发酵所用的瘤胃液采集自四川农业大学动物试验场的3头体况相近的健康筠连黄牛。试验当天在晨饲前通过连接真空泵的瘤胃管经口腔抽取瘤胃液，并转移至经39 ℃生理盐水预热的保温瓶中迅速带回实验室，经4层纱布过滤后，于39 ℃水浴条件下快速进行后续操作。
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表 1 7种中草药的主要活性成分及含量 Table 1 Main active ingredients and their contents of seven Chinese herbs |
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表 2 体外发酵所用饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the diet used for in vitro fermentation (DM basis) |
试验采用7×3+1两因素完全随机试验设计，设置7种不同中草药，分别为野葛根、荆芥、柴胡、金银花、钩藤、仙鹤草和五香血藤; 3个添加剂量，分别为15、20、25 mg(额外添加于200 mg发酵底物中); 并设置1个不添加中草药的对照，共计22个处理，每个处理设置3个重复。
1.3 体外发酵培养准确称取200 mg发酵底物置于带有刻度的发酵针管(上海鸽牌全玻璃100 mL注射器)底部，并按试验设计额外加入相应品种和剂量的中草药粉末。在针管活塞上涂抹适量凡士林，以增强针管的气密性。额外设置3个空白管(不添加发酵底物)以消除产气量误差。参照Menke等[22]的方法配制人工瘤胃缓冲液各组分，成分及配比见表 3，将其按比例充分混匀后持续通入CO2，直至溶液颜色由粉红色变为无色透明。随后预热至39 ℃，与过滤保温的瘤胃液以2 : 1的比例混合均匀。向每根发酵针管中加入30 mL混合人工瘤胃培养液，倒立排尽空气后用止水夹密封针管并置于预设为39 ℃的恒温振荡水浴锅(金坛市医疗仪器厂，SHZ-88)中开始培养。分别于0、2、4、8、12、24 h读取针管刻度并计算产气量。培养24 h后，取出置于冰水中终止发酵。将气体收集至集气袋中立即分析气体成分，将发酵液摇匀并转移至10 mL离心管中，置于-20 ℃保存等待后续分析。
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表 3 人工瘤胃缓冲液各组分及组成 Table 3 Components and composition of artificial ruminal buffering solution |
发酵底物中干物质(DM)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、钙(Ca)和磷(P)的含量参照张丽英[23]的方法测定。
1.4.2 产气量(GP)的测定
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采用碱性次氯酸钠-苯酚分光光度法[24]测定发酵液中NH3-N浓度。以氯化铵作为标准品，在650 nm条件下进行比色。
1.4.4 VFA浓度的测定以巴豆酸为内标物，采用气相色谱仪(美国瓦里安CP-3800)测定发酵液中VFA中乙酸、丙酸、丁酸的浓度。色谱柱为4 mm(内)×2 m玻璃柱，内部充满3%游离脂肪酸相。柱温为140 ℃，汽化室温度为200 ℃，氢火焰检测器(FID)温度为180 ℃。使用氮气(N2)作为载气，流速为40 mL/min; 氢气(H2)流速为50 mL/min; 氧气(O2)流速为50 mL/min; 样品进样量为1 μL。总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度为乙酸、丙酸、丁酸浓度之和。
1.4.5 气体成分的测定利用气相色谱仪(福立GC9790Ⅱ)测定气体中CH4、CO2、H2的百分浓度，各成分气体产量=GP×百分浓度。使用氩气(Ar)作为载气，气体流量为20 mL/min，进样量为0.5 mL; 使用热导检测器(TCD)，色谱柱型号为TDX-01(1 m×1/8)，柱箱温度为80 ℃，检测器温度为120 ℃，进样口温度为120 ℃。
1.4.6 微生物蛋白(MCP)浓度的测定采用差速离心法分离MCP[25]，然后加入200 μL裂解液(北京索莱宝科技有限公司)并超声冰浴裂解沉淀(变幅杆Φ02，10 s/10 s，20 min，功率237.5 W)，用二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定其中总蛋白浓度即为MCP浓度，具体步骤参照说明书进行。
1.5 数据统计与分析试验数据先由Excel 2016进行初步整理，之后运用SPSS 26.0统计软件的一般线性模型(GLM)对所有处理进行单因素方差分析，对剔除对照处理之后的其余处理进行两因素方差分析，主效应为中草药种类和添加剂量，并检验二者的交互效应，差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较。用线性插值的方法对缺失值进行替换。结果以平均值和均值标准误(SEM)的形式表示，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，0.05 <P < 0.10为差异有显著趋势。
2 结果与分析 2.1 不同中草药和添加剂量对体外发酵24 h后GP及NH3-N和MCP浓度的影响不同中草药和添加剂量对体外发酵24 h后GP、NH3-N和MCP浓度的影响见表 4。两因素方差分析结果显示，中草药种类对GP、NH3-N和MCP浓度均有极显著影响(P < 0.001);添加剂量对NH3-N浓度有显著影响(P=0.046)，对MCP浓度有极显著影响(P < 0.001);中草药种类与添加剂量的交互效应对NH3-N浓度有显著影响(P=0.010)。在7种中草药中，GP以添加荆芥时最高，显著高于添加五香血藤、金银花、仙鹤草或钩藤时，以添加钩藤时最低(P < 0.05);NH3-N浓度以添加荆芥时最高，显著高于添加其他6种中草药时(P < 0.05)，以添加五香血藤时最低; MCP浓度以添加仙鹤草时最高，显著高于添加其他6种中草药时(P < 0.05)，以添加野葛根时最低。与其他添加剂量相比，25 mg的添加剂量显著提高了NH3-N和MCP浓度(P < 0.05)。单因素方差分析结果显示，与不添加中草药的对照相比，添加20和25 mg荆芥显著提高了NH3-N浓度(P < 0.05);添加20和25 mg五香血藤则显著降低了NH3-N浓度(P < 0.05);添加25 mg仙鹤草显著提高了MCP浓度(P < 0.05)。
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表 4 不同中草药和添加剂量对体外发酵24 h后GP及NH3-N和MCP浓度的影响 Table 4 Effects of different Chinese herbs and additional doses on GP, NH3-N and MCP concentrations for 24 h of in vitro fermentation |
不同中草药和添加剂量对体外发酵24 h后VFA浓度的影响见表 5。两因素方差分析结果显示，中草药种类对TVFA(P < 0.001)、乙酸(P < 0.001)、丙酸(P=0.002)、丁酸浓度(P < 0.001)和乙酸/丙酸(A/P)值(P < 0.001)均有极显著影响; 添加剂量对TVFA(P=0.041)和丙酸浓度(P=0.010)有显著影响，乙酸浓度有受添加剂量影响的趋势(P=0.052);中草药种类与添加剂量互作效应对TVFA(P=0.029)、乙酸(P=0.042)和丁酸浓度(P=0.019)均有显著影响，丙酸浓度有受中草药种类与添加剂量互作效应影响的趋势(P=0.052)。在7种中草药中，TVFA、乙酸、丁酸浓度和A/P值均以添加荆芥时最高，显著高于添加其他6种中草药时(P < 0.05);丙酸浓度以添加金银花时最高，显著高于添加柴胡或五香血藤时(P < 0.05);A/P值以添加金银花、五香血藤时较低，显著低于添加其他5种中草药时(P < 0.05);添加五香血藤时TVFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度显著低于添加其他6种中草药时(P < 0.05)。与20 mg的添加剂量相比，25 mg的添加剂量显著提高了TVFA、乙酸和丙酸浓度(P < 0.05)。单因素方差分析结果显示，与不添加中草药的对照相比，添加15和25 mg野葛根显著提高TVFA和乙酸浓度(P < 0.05)，添加15和25 mg荆芥显著提高TVFA浓度(P < 0.05)，添加15和20 mg荆芥显著提高了乙酸浓度(P < 0.05)，添加15和20 mg五香血藤则显著降低了TVFA和乙酸浓度(P < 0.05);添加25 mg金银花或野葛根显著提高了丙酸浓度(P < 0.05);添加3种剂量的荆芥或15 mg野葛根显著提高了丁酸浓度(P < 0.05)，添加20 mg五香血藤则显著降低了丁酸浓度(P < 0.05);添加3种剂量的五香血藤或金银花均显著降低了A/P值(P < 0.05)。
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表 5 不同中草药和添加剂量对体外发酵24 h后VFA浓度的影响 Table 5 Effects of different herbs and additional doses on VFA concentrations for 24 h of in vitro fermentation |
不同中草药和添加剂量对体外发酵24 h后H2、CH4和CO2产量的影响见表 6。两因素方差分析结果显示，中草药种类对H2、CH4和CO2产量均有极显著影响(P < 0.001)，但添加剂量以及中草药种类与添加剂量的交互效应对上述气体产量的影响均不显著(P>0.05)。在7种中草药中，H2、CH4和CO2产量均以添加荆芥时最高，H2产量以添加钩藤时最低，CO2和CH4产量以添加仙鹤草时最低; 添加钩藤或仙鹤草时H2显著低于添加荆芥、野葛根或柴胡时(P < 0.05)，添加仙鹤草时CH4产量显著低于添加荆芥、野葛根或柴胡时(P < 0.05)，添加仙鹤草、钩藤或金银花时CO2产量显著低于添加荆芥、野葛根或柴胡时(P < 0.05)。单因素方差分析结果显示，与不添加中草药的对照相比，添加20 mg荆芥或25 mg野葛根使H2产量显著增加(P < 0.05)，添加20 mg荆芥还使CH4产量显著增加(P < 0.05);添加20 mg金银花显著降低了CH4和CO2的产量(P < 0.05)，添加25 mg仙鹤草也使CO2产量显著降低(P < 0.05)。综上可知，本试验中添加钩藤、仙鹤草和金银花可以降低体外发酵温室气体的产量。
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表 6 不同中草药和添加剂量对体外发酵24 h后H2、CH4和CO2产量的影响 Table 6 Effects of different Chinese herbs and additional doses on H2, CH4 and CO2 production for 24 h of in vitro fermentation |
GP作为体外发酵体系中评定反刍动物瘤胃微生物发酵的重要指标，综合性地反映了发酵底物的发酵程度和降解特性，一定程度上能衡量瘤胃微生物发酵的活跃程度和总趋势。本试验中添加荆芥使GP提高的程度高于其他6种中草药，而添加钩藤和仙鹤草时GP较低。但单因素方差分析结果显示，中草药种类和添加剂量均未对GP造成显著影响，说明各添加中草药的处理与不添加中草药的对照相比并未对瘤胃发酵产生显著影响。
NH3-N浓度是反映瘤胃氮代谢的重要参数，是微生物合成MCP的前体物质，取决于瘤胃微生物对饲粮中蛋白质的降解与微生物合成蛋白质时的氨利用水平[26]，NH3-N浓度的提高意味着瘤胃中蛋白质降解率的提高或者瘤胃微生物对NH3-N利用率的降低[11]。Satter等[27]研究发现，体外条件下，保证瘤胃微生物最快生长的NH3-N浓度为20~50 mg/dL，本试验中的NH3-N浓度基本上均处于此范围。与不添加中草药的对照相比，添加20和25 mg荆芥使发酵液中NH3-N浓度显著提高，添加15和20 mg五香血藤则使其显著降低，然而却未对MCP浓度造成显著影响，且各中草药之间也是添加荆芥时NH3-N浓度最高，添加五香血藤时最低，而MCP浓度却并无同样的突出变化，提示荆芥可能会提高瘤胃微生物对氨基酸的脱氨基作用以及对饲粮中蛋白质的降解速率，而五香血藤则可能使瘤胃微生物的脱氨作用被抑制。
MCP是反刍动物代谢蛋白质的主要来源之一，可以提供约40%、最多可达80%的氮源[28]。Dijkstra等[29]研究发现，瘤胃原虫可以吞噬细菌以获取蛋白质源，这种吞噬作用会造成细菌数量减少和MCP产量降低[30]。在本试验中，添加25 mg仙鹤草较不添加中草药的对照显著提高了发酵液中MCP浓度，而未对GP和NH3-N浓度造成显著影响，且各中草药之间添加也添加仙鹤草时MCP浓度最高，其GP和NH3-N浓度并无同样的突出变化，说明添加仙鹤草可能抑制了瘤胃原虫的活性。仙鹤草中富含鞣质(又称单宁或单宁酸[31])等多酚化合物[32]。杨凯[33]的研究表明，饲粮中添加26.0 g/kg DM单宁酸可以显著降低原虫的相对数量。Piñeiro-Vázquez等[34]指出，缩合单宁能够降低瘤胃原虫和古细菌的活性，使瘤胃原虫数量减少最高达79%。本试验中添加金银花未对发酵液MCP和NH3-N浓度造成显著影响，但唐志文等[35]的结果表明，添加金银花提取物显著提高了发酵液MCP和NH3-N浓度，推测所得结果不同可能是由于金银花添加形式的不同所导致，金银花提取物中的活性成分含量更高，根据作者给出的金银花提取物中绿原酸含量估算，是本试验添加剂量中活性成分含量的2~8倍。
除柴胡和金银花外，本试验选用的其余5种中草药对瘤胃或体外发酵参数的影响均未见报道。
3.2 不同中草药和添加剂量对体外发酵VFA浓度的影响在反刍动物瘤胃中，饲粮碳水化合物被微生物发酵的主要产物是VFA，其能为动物机体活动提供能量，并维持瘤胃功能，还可为微生物合成MCP提供碳架[36]。瘤胃液A/P值可反映饲粮在瘤胃中的发酵模式，鉴于微生物生长对底物的选择性，A/P值也会影响MCP的合成以及不同区系瘤胃微生物(细菌、原虫等)的群体结构，进而影响整个机体的消化与营养代谢，一般来说，非结构性碳水化合物(NSC)在瘤胃中的发酵率较高，且产生VFA中丙酸比例较高，而结构性碳水化合物(SC)则相反[37]。本试验中，由于发酵底物相同，不存在瘤胃壁的吸收作用，所以VFA组成的改变是由于改变了微生物活动或微生物酶活性。与不添加中草药的对照相比，添加20 mg荆芥显著提高了乙酸、丁酸、TVFA浓度和A/P值，添加15 mg荆芥也显著提高了乙酸、丁酸和TVFA浓度，结合其还提高了GP和NH3-N浓度，说明荆芥有可能具有促进瘤胃微生物发酵NSC的作用; 添加3种剂量的五香血藤均显著降低了A/P值，添加15、20 mg五香血藤时还显著降低了乙酸和TVFA浓度，说明添加五香血藤可能会抑制瘤胃微生物对NSC的发酵; 添加3种剂量的金银花均显著降低了A/P值，添加25 mg金银花时还显著提高了丙酸浓度，而未影响其他指标，说明添加金银花改变了瘤胃的发酵模式，使其更趋向于丙酸型发酵。黄祥元等[38]研究了金银花提取物对肉牛体外发酵的影响，结果表明，在发酵12 h时随着添加剂量的增加，A/P值呈显著线性升高，而在24 h时各添加剂量组的A/P值与对照组无显著差异。本试验条件下，添加3个剂量的柴胡对各VFA浓度均未产生显著影响，而潘龙等[39]的研究则发现添加柴胡皂苷可以显著提高发酵48 h后TVFA和乙酸浓度，其中0.25 g/kg的添加剂量还显著提高了GP和丙酸、丁酸浓度，推测试验结果的不同可能是由于柴胡的添加形式和发酵时间的不同所导致。
除柴胡和金银花外，本试验选用的其余5种中草药对瘤胃或体外发酵VFA浓度的影响均未见报道。
3.3 不同中草药和添加剂量对体外发酵H2、CH4和CO2产量的影响反刍动物通过瘤胃微生物发酵利用其他动物不能利用的纤维素、半纤维素等结构性碳水化合物的过程中会产生大量的H2和CO2，瘤胃中的产甲烷菌能够利用H2和CO2进行还原反应并生成CH4。H2不仅可以被产甲烷菌消耗合成CH4，还会被细菌利用合成VFA[40]。已有研究表明，CH4产量与乙酸浓度呈正相关，与丙酸浓度呈负相关，即丙酸产量增加、A/P值较小的同时CH4的排放量减少，更有利于动物对营养物质的降解与利用[41-42]。CH4产量的减少还可能与抗原虫作用有关[43]。
本试验中，添加20 mg荆芥虽然促进了发酵，但是较不添加中草药的对照显著增加了H2和CH4产量，且添加25 mg荆芥时显著增加了CO2产量，与试验目的不符; 与不添加中草药的对照相比，添加25 mg野葛根显著提高了H2产量，未影响其他气体成分的产量，结合其还提高了乙酸、丙酸和TVFA浓度，说明添加野葛根可能会促进瘤胃微生物发酵并利用H2合成VFA; 与不添加中草药的对照相比，添加20 mg金银花显著降低了CH4和CO2产量，却未对所有其他指标产生影响，提示金银花或许具有抗原虫作用。Kim等[44]用金银花提取物与瘤胃液孵育的体外试验和定量PCR分析发现，培养物中纤毛虫相关的产甲烷菌数量比对照组显著降低，而纤维分解菌数量增加。黄祥元等[38]的体外研究显示，随着金银花提取物添加水平的升高，CH4生成量表现为显著线性降低，与本试验结果部分不符。7种中草药中，仙鹤草使CH4和CO2产量的降低程度最大，添加25 mg仙鹤草显著降低了CO2产量，但对CH4产量的降低未与对照形成统计学差异。刘美[12]用人工瘤胃液为10 mL(瘤胃液与人工唾液比例为1 : 9)、底物为100 mg的发酵体系筛选了100种中草药的70%乙醇提取物对体外发酵CH4产量的影响，百种中草药中包含有柴胡、荆芥、仙鹤草，但是其研究表明这3种中草药均未对CH4产量产生显著影响，与本试验结果部分不符。本试验中，添加不同剂量的柴胡、钩藤和五香血藤均未对体外发酵H2、CH4和CO2产量造成显著影响。
除金银花、柴胡、荆芥、仙鹤草外，本试验选用的其余3种中草药对瘤胃或体外发酵H2、CH4和CO2产量的影响未见报道。
4 结论在体外发酵条件下，添加20 mg金银花或25 mg仙鹤草于200 mg发酵底物中具有降低温室气体产量的作用，且没有对瘤胃发酵参数造成不良影响。
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