乙氧喹(ethoxyquin)是一种具有抗氧化活性的化合物，在饲料加工中常被用来保护脂质、维生素等营养成分免受氧化降解[1]，其化学结构见图 1。研究表明，蛋鸡饲粮中添加乙氧喹，不仅能有效防止饲料中营养成分氧化，还能提高血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，降低血清丙二醛(MDA)含量，从而改善肝脏功能[2]；饲粮中添加乙氧喹可以减缓犊牛断奶引起的氧化应激，促进犊牛瘤胃发育[3]；但在犬、猫饲粮中，尽管毒理学研究表明乙氧喹无致癌性和遗传毒性，但其代谢物可能与犬、猫生殖障碍、自身免疫性疾病和癌症相关[4]。饲粮中的乙氧喹在胃肠道被吸收后首先进入肝脏，必然对肝脏代谢产生影响。在现代畜禽养殖行业所采用的大规模集约化养殖方式，主要是为了在最短的时间和最低的成本下获取最大的经济收益，所配制的饲粮往往使畜禽肝脏代谢负荷加重，而维护肝脏机能也成为维护群体健康水平重要的抓手[5]。关于乙氧喹在畜禽饲料加工中的应用还存在着一些争议，目前欧盟已经禁止在饲料中使用乙氧喹，但国内仍然充许应用，有关乙氧喹在体内对动物机体的影响，尤其对肝脏功能的影响，有必要进一步深入研究。脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-GalN)诱导的急性肝损伤(acute liver injury，ALI)模型，是研究各种抗氧化剂的理想工具[6-7]。LPS可引起肝脏氧化应激，导致炎性细胞因子的大量释放，D-GalN则可增加肝细胞对LPS的敏感性，腹腔注射LPS和D-GalN可诱导建立典型的ALI模型，在该模型中氧化应激起关键作用[8]。因此，本试验通过腹腔注射LPS和D-GalN建立小鼠ALI模型，并在该模型上探究乙氧喹对肝脏炎性反应以及氧化应激状态的影响，从而为乙氧喹的运用和相关政策制定提供部分试验依据。
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图 1 乙氧喹化学结构 Fig. 1 Chemical structure of ethoxyquin |
6周龄体重24~28 g雄性昆明小鼠40只，购于广东省医学实验动物中心，许可证号：NO.SCXK(粤)2018-0002。所有小鼠均置于温度(25±1) ℃、相对湿度45%~55%条件下饲养，明暗循环12 h，自由饮水和采食。动物试验经佛山科学技术学院动物伦理委员会批准。
将40只小鼠随机分为以下5组：空白组、模型组以及乙氧喹低(50 μg/kg)、中(100、μg/kg)、高剂量(200 μg/kg)组，每组8只。取200 mg的乙氧喹溶解于500 μL的二甲基亚砜(DMSO)，再加入500 μL的吐温80，最后加入生理盐水定容为10 mL、20 mg/mL的母液，根据每组小鼠体重计算所需浓度，将母液稀释为工作液。空白组和模型组溶剂(生理盐水+5% DMSO+5%吐温80)做上述相同处理。乙氧喹各剂量组每天腹腔注射1次，连续注射3 d，空白组和模型组注射同体积溶剂。第3天注射乙氧喹1 h后，空白组小鼠腹腔注射同体积生理盐水，其余各组小鼠腹腔注射500 μg/kg的LPS和500 mg/kg的D-GalN。
1.2 试剂与仪器LPS(大肠杆菌055 ∶ B5)、D-GalN购自美国Sigma公司；乙氧喹购自上海阿拉丁生化科技有限公司；DMSO购自上海麦克林生化科技有限公司；丙氨酸氨基转移酶(ALT，货号：C009-2-1)、天冬氨酸氨基转移酶(AST，货号：C010-2-1)、MDA(货号：A003-1-2)、超氧化物歧化酶(SOD，货号：A001-1-2)、髓过氧化物酶(MPO，货号：A044-1-1)和GSH-Px(货号：A005-1-2)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；TRIzol购自于北京全式金生物技术有限公司；RevertAidTM第1链cDNA合成试剂盒(货号：K1621)、BCA蛋白质测定试剂盒(货号：23225)购自赛默飞世尔科技公司；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司提供；兔源β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体(货号：YT0099)购自美国Immunoway公司；兔源核因子-κB抑制蛋白α(IκBα)多克隆抗体(货号：BM3932)购自美国博士德生物工程有限公司；兔源核因子-κB(NF-κB)p65多克隆抗体(货号：8242s)、兔源磷酸化p65(p-p65)多克隆抗体(货号：3033s)、兔源磷酸化核因子-κB抑制蛋白α(p-IκBα)多克隆抗体(货号：2859)、兔源血红素氧合酶-1(HO-1)多克隆抗体(货号：43966s)、兔源核因子E2相关因子2(Nrf2)多克隆抗体(货号：12721s)均购自美国Cell Signing Technology公司；山羊抗兔免疫球蛋白二抗(货号：SA00001-2)购自美国Proteintech公司。其余所有化学品均为试剂级。
主要仪器包括荧光显微镜(RVL-100，美国Discover ECHO公司)、酶标仪(iMark，美国Bio Rad公司)、紫外分光光度计(T6，北京普析通用仪器有限责任公司)、微量紫外分光光度计(NanoDrop One，美国赛默飞世尔科技公司)、PCR仪(1855200，美国Bio Rad公司)、多功能凝胶成像系统(c280，美国Azure Biosystems公司)。
1.3 组织病理学分析LPS和D-GalN注射后4 h收集肝脏组织，并在10%福尔马林溶液中固定。切片经分级乙醇脱水后石蜡包埋，苏木精-伊红(HE)染色，显微镜观察组织病理变化。
1.4 血清ALT、AST活性检测在LPS和D-GalN刺激后4 h采集血液，4 ℃下放置过夜，离心分离血清。根据试剂盒的说明检测，510 nm波长下酶标仪读取吸光度(OD)值，绘制标准曲线，计算血清ALT和AST活性。
1.5 肝脏MDA含量及MPO、SOD和GSH-Px活性检测小鼠肝脏组织与生理盐水(1 ∶ 9)匀浆，离心收集上清，按照相应的试剂盒说明书检测肝脏MDA含量及MPO、SOD和GSH-Px活性。
1.6 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肝脏IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA相对表达水平液氮研磨肝脏组织，使用TRIzol提取总RNA，并溶解在0.1%焦碳酸二乙酯溶液中。使用微量紫外分光光度计检测提取的RNA浓度和纯度。总RNA储存在-80 ℃直至用于cDNA合成。根据说明书，使用反转录试剂盒进行逆转录反应。RT-qPCR使用CFX connect荧光定量PCR检测系统进行，引物见表 1。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为参比基因，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。
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表 1 RT-qPCR引物序列 Table 1 Primer sequences for RT-qPCR |
肝脏组织裂解样本低温离心10 min，取上清用BCA试剂盒检测蛋白质浓度，同时10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂牛奶中封闭4 h，一抗4 ℃孵育过夜，洗涤后二抗孵育1 h，Tris缓冲盐水洗涤3次，最后用增强型化学发光试剂(ECL plus)进行蛋白质印迹系统图像分析。
1.8 统计分析所有数据以平均值±标准差的形式表示。使用GraphPad Prims 9.0通过单因素方差分析(one-way ANOVA)和Dunnett-t检验法分析不同组之间差异的显著性。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 乙氧喹对ALI小鼠肝脏病理组织学的影响如图 2所示，空白组肝脏结构形态正常(图 2-A)。模型组肝脏组织出现明显异常变化，如肝脏组织明显肿胀，排列紊乱，肝细胞间隙可见炎细胞浸润并出血(图 2-B)。乙氧喹低、中、高剂量组小鼠病理变化介于空白组与模型组之间，且随着剂量增大改善效果越明显，呈现剂量效应关系(图 2-C、图 2-D、图 2-E)。
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A：空白组blank group；B：模型组model group；C、D、E：乙氧喹低、中、高剂量组ethoxyquin low, medium and high dose groups。 图 2 乙氧喹对ALI小鼠肝脏病理组织学的影响 Fig. 2 Effects of ethoxyquin on liver histopathology of ALI mice (400×) |
如图 3所示，与空白组相比，模型组的血清ALT和AST活性显著增加(P < 0.05)。与模型组相比，乙氧喹低、中、高剂量组的血清ALT和AST活性显著降低(P < 0.05)。这说明乙氧喹预处理有效缓解了LPS和D-GalN引起的肝功能损伤。
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Control：空白组；LPS/D-GalN：模型组；Ethoxyquin：乙氧喹剂量组。*表示差异显著(P < 0.05)，ns表示差异不显著(P＞0.05)。下图同。 Control: blank group; LPS/D-GalN: model group; Ethoxyquin: ethoxyquin dose groups. * mean significant difference (P < 0.05), while ns mean no significant difference (P > 0.05). The same as below. 图 3 乙氧喹对ALI小鼠血清AST、ALT活性的影响 Fig. 3 Effects of ethoxyquin on serum ALT and AST activities of ALI mice |
如图 4所示，与空白组相比，模型组的肝脏MPO活性和MDA含量显著升高(P < 0.05)，SOD、GSH-Px活性显著降低(P < 0.05)。与模型组相比，乙氧喹低、中、高剂量组的肝脏MPO活性和MDA含量显著降低(P < 0.05)，GSH-Px活性显著升高(P < 0.05)；乙氧喹低剂量组的肝脏SOD活性无显著差异(P>0.05)，乙氧喹中、高剂量组的肝脏SOD活性显著升高(P < 0.05)。这说明乙氧喹预处理有效减轻了LPS和D-GalN引起的炎症和氧化应激。
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图 4 乙氧喹对ALI小鼠肝脏MDA含量及MPO、SOD、GSH-Px活性的影响 Fig. 4 Effects of ethoxyquin on liver MDA content and MPO, SOD, GSH-Px activities of ALI mice |
如图 5所示，与空白组相比，模型组的肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相对表达水平显著上调(P < 0.05)。与模型组相比，乙氧喹低、中、高剂量组的肝脏TNF-α和IL-6的mRNA相对表达水平显著下调(P < 0.05)；乙氧喹低剂量组的肝脏IL-1β的mRNA相对表达水平无显著差异(P>0.05)，乙氧喹中、高剂量组的肝脏IL-1β的mRNA相对表达水平显著下调(P < 0.05)。这说明乙氧喹预处理抑制了LPS和D-GalN引起的炎性细胞因子的释放。
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图 5 乙氧喹对ALI小鼠肝脏TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表达的影响 Fig. 5 Effects of ethoxyquin on mRNA expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β in liver of ALI mice |
如图 6所示，与空白组相比，模型组的肝脏p65和IκBα的磷酸化水平显著升高(P < 0.05)。与模型组相比，乙氧喹低、中、高剂量组的肝脏p65的磷酸化水平显著降低(P < 0.05)，乙氧喹低、高剂量组的肝脏IκBα的磷酸化水平显著降低(P < 0.05)。这说明乙氧喹抑制了NF-κB信号通路的活化。
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图 6 乙氧喹对ALI小鼠肝脏NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响 Fig. 6 Effects of ethoxyquin on protein expression related to NF-κB signaling pathway in liver of ALI mice |
如图 7所示，与空白组相比，模型组的肝脏Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著下降(P < 0.05)。与模型组相比，乙氧喹低、中、高剂量组的肝脏Nrf2和HO-1蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)。这说明乙氧喹激活了Nrf2信号通路。
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图 7 乙氧喹对ALI小鼠肝脏Nrf2信号通路相关蛋白表达的影响 Fig. 7 Effects of ethoxyquin on protein expression related to Nrf2 signaling pathway in liver of ALI mice |
乙氧喹成本低廉，抗氧化能力强，已有资料证实饲粮中添加乙氧喹不但可以保护脂质成分免受氧化破坏，在体内还可以提高雏鸡和黄鱼的生长性能，促进犊牛瘤胃发育，对黄曲霉毒素所致的大鼠肝损伤也具有一定保护作用[3, 9-11]。但是，有关乙氧喹生物活性的基础研究还不够详尽，对乙氧喹在饲粮中的使用还存在着争议，欧盟已禁止在饲粮中添加乙氧喹，国内一般添加的剂量是每千克饲粮中不超过150 mg。实际上，因动物品种、年龄和饲粮组成等影响，饲粮中乙氧喹的适宜添加量也不同，过高剂量的乙氧喹会造成动物肝脏、肾脏及胃肠道损伤，但适宜剂量时又能保护肝脏功能[4]。
根据报道，LPS和D-GalN诱导的小鼠ALI被广泛用于研究肝损伤[12]。血清ALT和AST活性是评估肝功能的常用指标[13]。当肝脏受损时，血液中ALT和AST活性显著升高。本试验结果表明，乙氧喹降低了LPS和D-GalN诱导的小鼠血清AST和ALT活性。此外，组织病理学观察还阐明乙氧喹对LPS和D-GalN诱导的肝损伤具有保护作用。
MDA是脂质过氧化的最终产物，常被用于评估不同组织的氧化应激[14]。MPO被认为是中性粒细胞浸润的生物标志物，其活性增加代表中性粒细胞介导的炎症增加。SOD和GSH-Px是重要的抗氧化指标，可清除自由基保护细胞免受氧化损伤[15]。检测小鼠肝脏MDA含量及MPO、SOD和GSH-Px活性，可以阐明乙氧喹对LPS和D-GalN诱导的肝损伤的保护机制。本试验结果表明，乙氧喹可能通过提高小鼠抗氧化能力来保护LPS和D-GalN诱导的肝损伤。
研究表明，炎症细胞因子的过度产生与肝损伤的发展密切相关[16]。其中，TNF-α是一种促炎细胞因子，可调节许多细胞反应，包括肝细胞凋亡和坏死[17]。IL-1β是白细胞介素-1(IL-1)的一个亚型，可刺激多种次级细胞因子的产生并放大炎症反应[18]。IL-6作为兼具抗炎和促炎作用的细胞因子，与细胞损伤密切相关[19]。本试验检测了肝脏TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA相对表达水平，结果表明乙氧喹对LPS和D-GalN诱导的TNF-α、IL-1β和IL-6的相对表达有明显的抑制作用，说明乙氧喹可以减少LPS和D-GalN诱导的炎症。因此，本研究进一步探讨了乙氧喹的确切抗炎机制。NF-κB是一种重要的核转录因子，有研究报道，NF-κB信号通路被激活后，其下游促炎因子的表达增加[20]。在正常生理条件下，NF-κB被其抑制蛋白(IκBα)以非活性形式隔离在细胞质中，当NF-κB被激活时，它在细胞质中与IκBα分离并转运到细胞核中，导致炎症介质的异常转录[21]。通过Western Blot检测p-IκBα、IκBα、p-p65和p65的相对蛋白质含量，发现乙氧喹抑制了LPS和D-GalN诱导p65磷酸化，随后阻断了IκBα磷酸化和降解，这可能是乙氧喹的抗炎机制之一。
研究表明，炎症和氧化应激是相互关联的[6]。在正常生理条件下，机体通过抗氧化防御机制实现氧化和抗氧化的动态平衡。Nrf2是抗氧化防御系统的重要转录因子，调节多种抗氧化酶的转录，如SOD、GSH-Px等[22-23]。通常，Nrf2主要通过与Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)和肌动蛋白细胞骨架相互作用而位于细胞质中，当受到刺激时，Nrf2与Keap1分离并转移到细胞核与抗氧化反应元件(ARE)结合，调节HO-1的转录[24]。作为Nrf2的转录靶点之一，HO-1以其重要的抗氧化能力成为抗氧化防御的重要因素[25]。乙氧喹有效增加了肝脏Nrf2和HO-1的蛋白表达，表明乙氧喹可以激活Nrf2信号通路，这可能是乙氧喹在LPS和D-GalN诱导的ALI小鼠中发挥抗氧化作用的机制之一。
4 结论综上所述，本试验通过腹腔注射乙氧喹，在设置的水平可以发挥乙氧喹体内抗氧化作用，通过抑制NF-κB信号和激活Nrf2信号来保护LPS和D-GalN诱导的小鼠肝损伤，且在本试验条件下设置的3个剂量中，200 μg/kg为适宜剂量。这说明乙氧喹不仅是一种经济实用的饲料添加剂，还可能作为一种肝损伤保护剂应用于畜禽养殖行业中。
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